6x His tagged eGFP의 과발현, 정제 및 정량 분석

본 내용은 " 현대생물학실험1 2차 풀레 6x His tagged eGFP의 과발현과 정제 및 정제 확인과 정량(A0) " 의 원문 자료에서 일부 인용된 것입니다. 2025.09.06

문서 내 토픽

• 1. 단백질 발현 및 정제 기술

  6x-His tagged eGFP를 pET28a(+) 플라스미드 벡터를 이용하여 BL21(DE3) 숙주 세포에서 과발현시켰다. IPTG 유도제를 사용하여 Lac operon을 활성화하고 T7 RNA polymerase를 통해 고효율 전사를 달성했다. Sonication으로 세포를 파괴하여 단백질 혼합물을 얻었고, IMAC(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography)를 통해 니켈 이온과 히스티딘의 결합을 이용하여 목표 단백질을 정제했다. Ultrafiltration으로 불순물을 제거하여 순도 높은 eGFP를 획득했다.

• 2. 단백질 정량 분석 방법

  Extinction coefficient assay를 통해 280 nm와 488 nm에서의 흡광도를 측정하여 Lambert-Beer 법칙으로 농도를 계산했다. 280 nm에서 0.2467 mM, 488 nm에서 0.1793 mM의 농도를 얻어 순도 72.68%를 확인했다. Lowry assay로 BSA 표준곡선을 이용하여 0.351 mM의 농도를 측정했으나, Lowry assay가 아미노산 잔기에 영향을 받아 더 높은 값을 나타냈다. 488 nm의 흡광도가 기능성 eGFP만 측정하므로 더 정확한 정량 방법으로 판단된다.

• 3. 단백질 구조 확인 및 특성 분석

  SDS-PAGE 전기영동으로 eGFP의 분자량 28.3 kDa에서 선명한 밴드를 관찰하여 정제 성공을 확인했다. Spectrofluorometer를 이용한 형광 분석에서 Excitation scan은 487.75 nm, Emission scan은 506.5 nm에서 최대값을 보여 eGFP의 알려진 특성(490 nm excitation, 510 nm emission)과 일치했다. 이는 고순도의 기능성 eGFP가 성공적으로 정제되었음을 입증했다.

• 4. 단백질 정제 기술의 원리 및 응용

  6x-His tagging은 표적 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 6개의 히스티딘을 부가하여 친화성 크로마토그래피를 통한 정제를 가능하게 한다. 작은 크기로 단백질에 미치는 영향이 적고 변성 상태에서도 정제 가능하다는 장점이 있다. IMAC는 니켈 이온과 히스티딘의 특이적 결합을 이용하며, Imidazole을 경쟁적으로 사용하여 단백질을 용출한다. Ultrafiltration은 분자량 차단값(MWCO)을 이용하여 선택적으로 단백질을 농축하고 정제한다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. 단백질 발현 및 정제 기술

  단백질 발현 및 정제 기술은 현대 생명공학의 핵심 기술로서 매우 중요합니다. 재조합 단백질 발현 시스템(박테리아, 효모, 곤충세포, 포유동물세포)의 선택은 목표 단백질의 특성과 용도에 따라 신중하게 결정되어야 합니다. 각 발현 시스템은 고수율, 단백질 폴딩, 번역후 수정 등에서 장단점을 가지고 있습니다. 정제 기술의 발전으로 높은 순도의 단백질을 대량으로 획득할 수 있게 되었으며, 이는 의약품 개발, 진단 시약, 연구용 시약 등 다양한 분야에서 필수적입니다. 앞으로 자동화 및 고처리량 정제 기술의 발전이 기대됩니다.

• 2. 단백질 정량 분석 방법

  단백질 정량 분석은 생명공학 연구에서 기본이 되는 중요한 기술입니다. Bradford, BCA, Lowry 등 다양한 비색정량법은 각각의 장단점을 가지고 있으며, 샘플의 특성에 따라 적절한 방법을 선택해야 합니다. 최근에는 분광광도법, 형광법, 질량분석법 등 더욱 정확하고 민감한 방법들이 개발되고 있습니다. 정량의 정확성은 이후 모든 실험의 신뢰성에 영향을 미치므로, 표준물질의 선택과 측정 조건의 최적화가 매우 중요합니다. 고처리량 분석이 필요한 경우 자동화 시스템의 도입도 효율성 측면에서 고려할 가치가 있습니다.

• 3. 단백질 구조 확인 및 특성 분석

  단백질의 구조 확인 및 특성 분석은 단백질의 기능을 이해하는 데 필수적입니다. X선 결정학, 핵자기공명(NMR), 냉동전자현미경(Cryo-EM) 등의 고급 기술들이 원자 수준의 구조 정보를 제공합니다. 또한 동적광산란(DLS), 원편광이색성(CD), 형광분광법 등은 용액 상태에서의 단백질 특성을 파악하는 데 유용합니다. 이러한 다양한 방법들을 통합적으로 활용하면 단백질의 3차원 구조, 안정성, 상호작용 등을 종합적으로 이해할 수 있습니다. 구조 정보는 약물 설계, 효소 개선, 질병 메커니즘 규명 등에 직접 활용되므로 매우 가치 있는 정보입니다.

• 4. 단백질 정제 기술의 원리 및 응용

  단백질 정제 기술은 물리화학적 성질의 차이를 이용하여 목표 단백질을 선택적으로 분리하는 기술입니다. 크기, 전하, 소수성, 친화성 등 다양한 특성을 기반으로 한 크로마토그래피 기법들이 널리 사용되고 있습니다. 겔 여과, 이온교환, 역상, 친화성 크로마토그래피 등 각 기법의 원리를 이해하고 적절히 조합하면 높은 순도의 단백질을 효율적으로 획득할 수 있습니다. 최근 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)와 초고속 액체크로마토그래피(UHPLC) 기술의 발전으로 분석 시간이 단축되고 분해능이 향상되었습니다. 정제 기술의 최적화는 비용 절감과 수율 향상에 직결되므로 지속적인 개선이 필요합니다.