His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제

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문서 내 토픽

• 1. eGFP 단백질 발현 및 정제

  His tagged eGFP 단백질을 E.coli BL21(DE3) 시스템에서 과발현시키고 affinity chromatography를 통해 정제하는 과정. pET28a(+) vector에 eGFP 유전자를 클로닝하고 IPTG로 유도하여 6x His tagged eGFP를 과발현. Sonication으로 세포를 파괴하고 His tag와 니켈 이온의 친화성을 이용한 정제. Ultrafiltration으로 농축하여 최종 정제 단백질 획득.

• 2. 단백질 정량 방법 비교

  Extinction coefficient assay와 Lowry assay를 이용한 단백질 정량. 280nm와 488nm 흡광도를 측정하여 전체 eGFP 0.1827mM, functional eGFP 0.1268mM 계산. Lowry assay에서는 6.08mg/ml로 측정되어 아미노산 조성에 따른 차이 확인. eGFP와 같이 특이적 흡광도를 가지는 단백질은 extinction coefficient assay가 더 효과적.

• 3. SDS-PAGE 및 단백질 확인

  SDS-PAGE와 Coomassie blue staining을 통해 eGFP의 정상적인 과발현과 정제 확인. Whole lysate에서는 연속적 band, flow through에서도 28kDa 위치에 eGFP 관찰, wash 2에서 불순물 제거, 최종 정제 샘플에서 28kDa 위치에 진하고 두꺼운 단일 band 확인. 6x His tagged eGFP의 크기 28.3kDa와 일치.

• 4. 형광 특성 분석

  Spectrofluorometer를 이용한 eGFP의 형광 특성 측정. Emission spectrum에서 510nm, excitation spectrum에서 490nm에서 최대값 확인. eGFP의 특성인 490nm excitation과 510nm emission 파장 확인으로 정제된 단백질이 eGFP임을 증명. Emission 파장이 excitation 파장보다 긴 Stokes shift 현상 관찰.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. eGFP 단백질 발현 및 정제

  eGFP 단백질의 발현 및 정제는 분자생물학 연구에서 매우 중요한 기술입니다. 대장균을 이용한 발현 시스템은 비용 효율적이고 높은 수율을 제공하며, 다양한 정제 방법(친화성 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 등)을 통해 고순도의 단백질을 얻을 수 있습니다. 발현 조건 최적화(온도, 유도제 농도, 배양 시간)는 단백질 수율과 품질에 직접적인 영향을 미치므로 신중한 실험 설계가 필요합니다. 정제 과정에서 단백질의 활성을 유지하는 것이 중요하며, 적절한 완충액과 보존제 사용이 필수적입니다.

• 2. 단백질 정량 방법 비교

  단백질 정량은 생화학 연구의 기초적이면서도 중요한 단계입니다. Bradford, BCA, Lowry 방법 등 다양한 정량 방법이 존재하며, 각각의 장단점이 있습니다. Bradford 방법은 빠르고 간단하지만 계면활성제에 민감하고, BCA 방법은 정확성이 높지만 시간이 더 소요됩니다. 연구 목적과 샘플의 특성에 따라 적절한 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 또한 표준 단백질의 선택과 정확한 측정 기술이 결과의 신뢰성을 좌우하므로, 여러 방법을 병행하여 검증하는 것이 권장됩니다.

• 3. SDS-PAGE 및 단백질 확인

  SDS-PAGE는 단백질의 분자량 확인과 순도 평가에 가장 널리 사용되는 기술입니다. 음이온 계면활성제인 SDS가 단백질을 균일하게 음전하로 만들어 전기영동 시 분자량에 따른 분리가 가능합니다. 적절한 겔 농도 선택, 샘플 준비, 전압 조건 설정이 결과의 질을 결정합니다. 염색 방법(Coomassie, 은염색)에 따라 감도와 배경이 달라지므로 목적에 맞는 선택이 필요합니다. 정량적 분석을 위해서는 표준 마커와의 비교가 필수적이며, 재현성 있는 결과를 위해 일관된 실험 조건 유지가 중요합니다.

• 4. 형광 특성 분석

  eGFP의 형광 특성 분석은 단백질의 기능성과 품질을 평가하는 핵심 방법입니다. 여기파장(488nm)과 방출파장(509nm)의 측정을 통해 단백질의 성숙도와 활성을 확인할 수 있습니다. 형광 강도, 양자 수율, 형광 수명 등의 매개변수는 단백질의 구조적 완전성을 반영합니다. 형광분광법, 유동세포분석법, 형광 현미경 등 다양한 기술을 활용하여 다각적으로 분석할 수 있습니다. pH, 온도, 용매 등 환경 요인이 형광 특성에 영향을 미치므로, 표준화된 조건에서의 측정이 결과의 비교 가능성을 높입니다.