*진* 스토어

*진*

개인

팔로워0 팔로우

소개

등록된 소개글이 없습니다.

전문분야 등록된 전문분야가 없습니다.

판매자 정보

학교정보

입력된 정보가 없습니다.

직장정보

입력된 정보가 없습니다.

자격증

입력된 정보가 없습니다.

판매지수

판매중 자료수

1개
전체 판매량

9개
최근 3개월 판매량

0개
자료후기 점수

평균C
자료문의 응답률

-

전체자료 1개

PCR 평가C아쉬워요

Ⅰ. Introduction* PCR 법의 원리PCR(Polymerase Chain Reaction)법은 DNA 가닥의 열변성(denaturation step), primer와의 annealing(annealing step), polymerase에 의한 DNA 합성 신장 반응(Extension step)를 반복하여 실시함으로써 in vitro에서 DNA를 증폭하는 방법이다. 이 방법을 사용하면 DNA를 수 시간 내에 적어도 105배로 증폭할 수 있다. TaKaRa Taq(TaKaRa Code No. R001)는 Thermus aquaticus YT-1주로부터 DNA polymerase 유전자를 클로닝하여 그 유전자를 도입한 재조합체 대장균을 이용하여 대량 발현하고, 고도로 정제한 94 kDa의 내열성 DNA polymerase로 천연의 Taq DNA polymerase와 같은 기능을 갖고 있다.개발 초기의 PCR은 Klenow Fragment를 사용하므로 열변성의 스텝에서 효소가 실활하여 매 사이클마다 효소를 다시 첨가하지 않으면 안되었다. TaKaRa Taq은 고온에서도 극히 안정하기 때문에 고온의 열변성에서도 실활하지 않아, 중간에 효소를 첨가하지 않아도 PCR을 실시할 수 있다. 또 고온에서 반응을 실시하기 때문에 프라이머의 비특이적인 아닐링도 적어 목적하는 단편의 DNA만을 높은 효율로 증폭할 수 있다.·스텝 1 :프라이머, dNTP,내열성 DNA polymerase를 함유하는 반응액 중에, 목적으로 하는 두 가닥 DNA 단편을 열변성한다(94℃,30초).·스텝 2 :열변성에 의해 생긴 한 가닥 주형DNA에 프라이머를 아닐링한다(55℃, 30sec).·스텝 3 :DNA polymerase에 의한 상보성 DNA를 합성한다(72℃, 1min).·스텝 4 :증폭 산물로서의 두 가닥 DNA를 재열변성하여 한 가닥 DNA를 형성한다(스텝 1로 되돌아간다).스텝 1∼4를 1사이클로 하여, 25사이클을 반복한다. 단, 목적DNA 단편에 따라 증폭의 최대 효율을 얻을NA단편에 적당한 설정조건을 변경할 필요가 있다.* Polymerase Chain Reaction 방법# Pipetting & DNA template여러 component를 혼합할 때에는 시료간에 오염이 되지 않도록 주의하여야 하며 가능하면 공기를 통한 오염을 방지할 수 있는 aerosol-resistant pipette tips을 사용하는 것이 좋습니다. 반응물 혼합 시에는 tube를 ice 상에 두고서 혼합하여야 상온에서의 잘못 primer annealing에 의한 extension을 방지할 수 있습니다.(*이론적으로 Taq DNA polymerase는 최적 온도 이하에서도 반응이 어느 정도 진행됨으로 상온 등에서 정확하게 annealing되지 않은 primer에 의한 임의의 반응이 진행됨으로써 원하는 size의 product 이외의 non-specific product가 만들어질 수 있습니다.)# Setting up the LaboratoryPCR은 민감도가 뛰어난 실험이기 때문에 아주 적은 양의 DNA가 오염되더라도 실험에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 그러므로 PCR을 위한 template를 준비하는 곳과 PCR 반응을 하는 곳, 그리고 PCR 후 전기영동 및 분석을 하는 곳은 격리시키는 것이 좋으며, DNase 와 RNase free PCR tube를 사용하고, aerosol-resistant pipette과 전용 pipette을 구분하여 사용하는 것이 좋습니다. 또한 가능하다면 fume hood에서 PCR 반응액을 혼합하도록 하고 disposable gloves를 착용하고 작업하는 것이 좋습니다. 모든 시약류는 반드시 autoclave와 filteration을 거친 후 사용하여야 합니다. 사용한 tip과 소모품, 그리고 agarose gel 등은 반드시 밀봉하여 버리고, 반드시 실험에는 positive control과 negative control을 포함되어야 합니다.# PCR cycling programPCR cycling 조건은 PCR의 종류와 PCR 기기 등에 따라 달라져야 합니다.a. Initial denaturationtemplate DNA의 완전한 denaturation이 중요한데 94도∼95도에서 2∼3분 정도로도 충분하지만 대부분 5분 정도 초기 변성 시간을 주는 것이 좋습니다. denaturation이 충분하지 않으면 primer의 annealing과 extension이 방해받아 정확한 반응물이 생기지 않을 뿐만 아니라 self-priming이 일어날 수 있어 위양성 (false-positive)의 결과를 낳을 수도 있습니다.b. Denaturation step during cycling보통 94도∼95도에서 20∼30초 정도이지만 PCR 기기와 tube 등에 따라 시간을 늘리기도 합니다(예로서, 반응량이나 반응tube가 커짐에 따라 시간을 늘려 주어야 합니다.). Template의 GC함량이 높으면 높은 온도와 긴 시간을 사용하기도 하지만 필요 이상으로 변성 온도가 높거나 길면 Taq DNA polymerase의 활성이 감소됩니다.c. Primer annealing대개의 경우 annealing 온도는 primer의 Tm 값에 따라 결정됩니다. 온도가 너무 높으면 primer가 annealing 되지 않아 PCR product가 생기지 않게 되고, 온도가 너무 낮으면 non-specific annealing이 일어나 정확한 PCR product가 생기지 않습니다. 이때 사용하는 한 쌍의 primer간의 Tm 값의 차이는 5도 이하로 디자인하고 primer간의 상보적인 결합에 의한 primer dimer가 형성되지 않도록 설계하여야 합니다.d. Extension (polymerization)Taq polymerase의 경우 72℃에서 1초당 약 60개의 염기를 중합시키기 때문에 1 kb까지는 45초 정도면 충분합니다. 하지만 대부분의 경우 1kb 당 1분 정도의 시간이 필요합니다. (PCR 반응의 경우 cycle이 진행됨에 따라 template는 많아지는 반면 효소의 활성은 줄어들기 때문씩 extension time을 늘려주는 것도 보다 많은 양의 product을 만드는 한 방법입니다.)e. Cycle number대부분의 경우 25∼35cycle을 진행하고, Template 분자가 10개 이하인 경우에는 40 cycle 정도 진행하면 product을 관찰할 수 있습니다. 그러나 cycle의 수를 무작정 늘린다고 해서 product의 양이 급격히 늘지는 않으며 오히려 비특이적 밴드가 늘어날 수 있습니다. (최근에는 reaction buffer의 조성변화나 thermostable pyrophosphatase 등을 사용함으로 해서 보다 많은 수의 PCR cycle이 가능한 long cycle PCR kit들이 판매되고 있습니다.)# Equipment (Thermocyclers & PCR tubes)PCR 기기는 기본적으로 PCR 반응을 구성하는 세 가지 온도를 최소한의 시간에 정확하고 재현성있게 유지할 수 있어야 합니다.또한 반응 tube에 따라 열전도율의 차이가 있기 때문에 가능하면 thin-walled reaction tube를 사용하는 것이 좋으며 thermal cycler의 block에 꼭 맞는 크기를 사용하여야 합니다.# PCR reaction componentsa. DNA templateTemplate 양과 질은 PCR에 절대적인 영향을 미칩니다. template가 적을수록 product의 양 역시 비례적으로 감소하게 되며, RNA의 오염은 Mg2+ 이온을 잡아먹어 yield를 낮추게 되고 불순한 template에는 반응 저해제들을 많이 포함하고 있어 반응의 효율을 떨어뜨립니다. Human DNA의 경우 1∼100ng이 적절하며, bacterial DNA의 경우는 1∼10ng이, plasmid DNA의 경우는 0.1∼1ng 정도가 적당하다.b. PCR PrimersPCR의 많은 요소들 중에서도 primer의 염기서열과 농도는 전체 반응의 성패에 가장 큰 영향을 미치는 요인 중 하나입니다. 좌측의 primer design program을 며, 다음과 같은 사항들을 고려하여 설계하는 것이 좋습니다.길이는 18∼24mer가 적당하며두 primer의 Tm 값의 차이는 5도 이내로2차 구조가 형성되지 않도록G+C 값은 40∼60%로G/C나 A/T rich 영역을 피하여두 primer의 3' 사이에 상보결합이 없어야 합니다.primer의 농도는 20∼100㎕ 반응의 경우 10∼100pmoles 정도가 적당하며 농도가 높을 경우 반응이 저해가 되어 mispriming과 non-specific product이 많이 생기며, 낮은 농도의 경우에는 반응이 완전히 끝나기 전에 소진되어 생성물이 줄어들게 됩니다.c. Choice of DNA polymerasePCR 반응에 사용하는 Taq DNA polymerase는 0.5∼2.5 Units/20∼50㎕ reaction volume 정도가 적당합니다. 비율적으로 너무 많은 효소가 들어가게 되면 높은 glycerol 농도로 인하여 product가 끌리는 현상이나 특이성이 떨어져 불균형적인 결과를 초래하게 되며, 너무 적은 양의 효소를 사용하면 생성물의 양이 부족하게 됩니다. Taq DNA polymerase의 활성은 pH나 salt 농도에 영향을 받으므로 효소와 함께 제공되는 반응 buffer를 사용하시는 것이 좋습니다. 최근에는 PCR의 용도에 따라 다양한 효소들(높은 fidelity, yield의 증가, GC-rich 영역, long-size, gene cloning용)이 많이 판매되고 있으므로 적절하게 선택하여 사용하여야 합니다.d. Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)항상 dNTP의 4가지 요소들은 동일 농도로 사용하여야 합니다. dNTP mixture의 불균형은 Taq polymerase의 fidelity를 감소시켜 error rate가 증가될 수 있습니다. 또한 dNTP stock은 thawing/freezing에 민감하여 3∼5차례만 반복하여도 활성이 감소하여 올바른 결과를 기대할 수 없습니다. 그러므로 stock은 사용량에 습니다.

자연과학| 2001.05.08| 4페이지| 1,000원| 조회(1,163)

PCR, annealing, denaturation, extension

미리보기

닫기