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미생물의 배양법과 발효산물의 정제

▶▷▶미생물의 배양법과 발효산물의 정제◀◁◀1. 미생물 배양법19세기 말 식생활에 미생물의 이용은 주로 효모를 이용한 알코올발효, 젖산균을 이용한 발효식품은 발효기간 중에 산소의 공급을 필요로 하지 않는 소위 혐기발효가 주였다. 그러나 초산균에 의한 ethanol에서 acetic acid생산 이외에 곰팡이를 이용한 고오지 제조, 치즈 표면의 곰팡이의 육성에는 산소의 보급이 발효촉진에 불가결인 호기적 배양도 경험적으로 배양되어 왔다.이상과 같은 전통적인 발효 생산과 때를 같이 하여 1993년 플라스크를 진탕시킴으로써 공기의 공급을 촉진하여 종래의 정치배양에 비하여 균일화된 미생물을 단시간 내에 증식시키는 방법을 개발하였다. 이것이 진탕배양법이다. 정치배양법은 오늘날에도 식초 생산에 이용되고 있으나 진탕 배양의 원리는 그 후 심부배양의 기술개발의 기초가 되었다.배양형식은 미생물을 적당한 영양원과 기타 조건을 조절한 액체배지에서 생육시키는 액체배양과 적당한 수분을 함유하는 고체배지에서 생육시키는 고체배양으로 대별되며, 발효형식은 종균의 산소요구도에 따라 호기적 발효는 회분발효와 연속발효 또는 유가배양 등으로 구분된다.1) 액체배양액체배양에는 표면배양과 심부배양이 있다.(1) 표면배양법표면배양은 호기적 정치배양으로 용기 내의 배양액량에 대하여 그 표면적을 크게 하여 기액 계면에서 액측에의 산소이동을 촉진시켜 산소를 미생물에 공급하는 배양법이다.액체표면배양은 영양물질이 함유되어 있는 액체를 살균한 후 종균을 접종하여 배양함으로써 액체의 표면에서 균을 번식시키는 방법으로 균막을 항상 공기와 접촉되어 있고 또 액체표면에서 용해한 용존산소를 미생물이 잘 이용할 수 있으므로, 특별히 산소를 공급할 필요가 없다. 이와 같이 표면배양은 호기적 발효에 사용되며, 한가지 유의할 점은 균이 번식할 수 있는 표면이 한정되어 있기 때문에 발효액의 층이 너무 깊지 않도록 하여야 한다. 이 방법은 현재 식초발효나 구연산 발효에 이용되고 있다.(2) 심부배양법상기의 표면배양에서는 공기측에서 배를 촉진한다. 이와 같이 발효조 저부에서 통기교반하는 배양법은 깅개 계면보다 자연확산에 의하여 산소를 용해시켜 표면배양에 대하여 심부배양이라고 한다.공기는 압축기에 의하여 발효조 저부에서 송입하나 발효조의 입구에서 공기여과기로 공기 중에 존재하는 잡균을 제거하여 무균공기로서 보내고 또 송입공기는 교반기에 의하여 미세화시킨다.교반은 산소를 용해시키는 것을 주목적으로 다른 배양액 특히 존재하는 미생물을 발효조 내에 균일하게 분산시키고 또한 열 이동의 촉진, pH를 조절하기 위하여 첨가된 산 또는 알칼리의 균일 분산 등을 위해서도 중요하다.(3) 진탕배양법이 배양법은 통기배양법의 일종으로서 왕복진탕기 또는 회전진탕기에 300∼500ml들이 삼각플라스크 또는 round bottom flask 등을 고정시켜 배양액을 연속 진탕함으로써 통기와 교반을 효과적으로 할 수 있다. 이들 배양병에는 60∼100ml의 배양액을 넣어 배양하며, 잡균의 혼입이 염려되므로 면전이 젖지 않도록 주의해야 한다. 또 될 수 있는 한 순수한 균을 다량 접종하는 것이 좋고, 면전도 너무 딱딱하지 않게 하는 것이 좋다.2) 고체배양고체배양법은 적당한 수분을 가지는 고체기질의 표면에 미생물을 직접 배양하는 방법이다. 고체배양은 실험실에서 흔히 한천 고체배지 등을 사용하지만, 공장에서는 영양물질이나 수분을 조정한 한천 배지와는 달리 농산물이나 그 폐기물을 이용하므로 이들에서는 미생물 세포내의 삼투압과 균형이 맞는 조건을 만들기 어려우므로 모든 미생물이 잘 생육하지는 못한다. 그러나 일반적으로 곰팡이는 세포내 삼투압이 세균에 비하여 높으므로 잘 생육을 할 뿐만 아니라 곰팡이의 포자형성은 호기성하에서 잘 되므로 고체의 표면배양이 적합한 면도 있다.따라서 농산물 또는 그 폐기물을 적합하게 수분을 포함시킨 상태로서 발효원료로서 사용한다면, 세균 등의 생육을 방지하면서 곰팡이를 우선적으로 생육시킬 수가 있어, 발효생산이라든지 균체단백을 부가한 사료로의 변환 등을 기대할 수 있다.고체배지와 공기와의 접촉형식에 하여 흘려보낸다. 풍온에 의하여 배지의 온도제어를 한다.(3) 유동층배양금망 또는 다공판 위에 분말상태의 배지를 실어 상향바람으로 유동층의 상태를 형성시켜 배양한다. 풍온에 의하여 배지의 온도제어를 한다. 층 두께는 수m까지 가능하다.3) 특수배양법(1) 동조배양법세포집단을 분별여과, 원심분리 같은 기계적인 방법이나, 온도나 영양조건등으로 균의 셍리적 조건을 조정하여 일정한 성장기의 세포막을 선택적으로 모아 이것을 배지에 옮기면, 몇 세대에 걸쳐 일정한 시간 간격마다 단계적으로 생균수가 2배로 된다.이와 같이 세포가 집단으로 균일한 분열을 반복해 가는 배양법을 동조배양이라 하며 분열직후에서 직전까지의 세포의 생리, 생화학적 연구에 널리 쓰인다.♧동조 배양의 방법·생리적 조건의 조정에 의한 동조화① 정지기 배양 -> 신선한 배지에 접종② 온도의 조정 : 성장적온 이하로 성장저해 -> 적온으로 상승③ 영양조건의 조정 : E. coli의 변이주 -> thymine만 가하지 않은 배지에 배양 -> thymine첨가하면 동조적으로 발육④ 광선의 조정 : 단세포의 chlorella 세포의 성장은 광에 의존하는 단계와 무관계의 단계이용·기계적 또는 물리적 방법에 의한 동조화① 기계적 선별법: Ameba 같은 비교적 큰 세포는 현미경으로 관찰하면서 어 느 일정한 성장기의 세포만을 모은다.② 분획 원심분리법 : 세포는 성장의 시기에 따라 크기가 다르므로 분획원 심법에 의하여 대소의 세포균을 분획할 수 있다.③ 분획 여과법 : paper chromatography를 이용한 세포를 여별하는 방법(2) 투석배양투석배양은 투석막으로 막혀진 2액간에 막을 통해서 조절된 물질을 이동시키면서 미생물을 배양하는 방법이다.① Cellophane bag법 : 청주효모와 청주유산균과의 혼합배양을 목저긍로 cellophane막으로 막은 2중 배양관을 사용했다. cellophane bag은 내외관간의 솜마개로 지지하기 때문에, 이 법은 정치배양에서는 적합하지만, 진탕배양이나 통기배양 등에는 수정을 어서 장치를 조립한다. 가압멸균시 공기가 나가는 구멍을 만드기 위하여 flange는 멸균 중에는 느슨하게 한다. 멸균 주사고나을 배지로 충만시킨다. 상실에는 멸균증류수 100ml를 무균적으로 첨가한다. 상, 하실내의 배양액이 평형에 달한 후, 상실에 균을 접종하고, 진탕배양한다. 대조는 투석막 대신에 고무막을 사용하고, 상실에는 하실과 똑같은 배지를 100ml 첨가한다.4) 기질의 공급방식에 따른 배양법(1) 회분배양회분배양은 보통 처음 공급한 원료기질이 모두 소비될 때까지 목적물의 발효생산을 계속시키는 방법이며, 현재 대부분의 발효공업이 회분발효형식을 택하고 있다. 그 기본공정은 적당한 배지를 넣은 플라스크에 종균을 배양하여 이것을 종모 발효조에 옮겨 필요량의 균체를 증식시켜 육성한 종모를 미리 살균과 모든 조건을 조정한 원료를 넣은 주 발효조에 적당량을 이송 식균하여 균의 증식과 목적물의 발효 생산을 한다.(2) 연속배양발효조에 신선한 배지를 연속해서 일정한 속도로 공급하면서 동량의 배양액을 연속적으로 배출시켜 발효조내의 액량을 항상 일정하게 유지하도록 고안한 배양방법이다.보통, 회분배양에서는 기질농도, 용존산소의 농도, 대사생성물의 농도, pH 등의 환경조건이 배양조건의 배양시간과 더불어 각각으로 변화하지만, 연속배양에서는 이들 인자가 항상 일정하게 유지되고 또한 인위적으로 증식속도를 임의로 조절할 수 있는 것 등이 특징이라 하겠다.① Chemostat : 기질농도, 생산물 농도, pH 등 배양액 중의 모든 화학성분 농도, 즉 환경 인자를 일정하게 유지하는 배양법② Turbidostat : 배양액 중의 균체 농도를 지표로 해서 일정하게 유지되도록 배지 공급 및 배출 속도를 제어하는 방법으로 광전비탁계로 배양액의 탁도를 조절하여 균체 농도를 일정하게 유지하는 배양법·장점① 고효율② 생산비가 낮다.③ 품질관리가 용이④ 자동화가 용이⑤ 여러 단계별 이용⑥ 기초 연구의 좋은 도구·단점① 생산성이 낮다.② 오염문제③ 균주의 변이, 퇴화④ 공정조작에 의존성이 크다.로써 기질을 자유롭게 제어할 수 있다.① 증식저해를 가져오는 물질을 기질로 하는 경우② 어떤 기질의 농도가 높아지면 목적 생산물의 생성이 억제되는 경우③ 영양 요구성주의 배양에서 요구물질을 첨가하는 경우이상의 배양에서 이들 특정물질의 농도를 적당한 값으로 유지시켜 증식 또는 대사산물의 생산을 유지시키는 데 필요한 양을 공급함으로써 효율좋은 발효생산을 행하는 데에 적합한 배양방법이다.♧유가배양법의 종류① 균등 유가배양법(정속 유가배양법)기질의 공급속도를 일정하게 유지하게 배양② 지수적 유가배양법미생물의 대수증식기를 장시간 유지시켜 배양시간이 단축이나 고농도 배양을 위한 대수증식을 유지하도록 기질을 공급하는 배양③ feedback 조절의 유가배양법배양계의 변화를 조사하여 그 변동을 지표로 유가속도를 조정하는 최적의 배양최분배양에서는 기질의 전량 다음 배양을 함으로 기질농도는 경시적으로 감소되며 연속배양은 깆리을 공급하면서 배양액을 유출시킴으로써 정상상태는 얻을 수 있으나 기질 농도를 조절할 수 없다. 그러나 유가배양은 기질을 적당한 속도로 가하면서 유출을 시키지 않으므로 공급하는 기질의 양과 미생물에 의한 소비량의 균형을 맞춤으로써 기질 농도를 임의로 조절할 수 있는 장점이 있다.2. 발효산물의 정제정제는 목적에 따라서는 수득률보다도 목적물을 얻는 데만 치중하는 경우가 있으나, 일반적으로 공업생산을 전제로 한 분리 정제법을 생각할 때에는 다음 사항에 대해서 유의해야 한다.(1) 요구되는 순도의 것을 얻을 수 있어야 한다.(2) 수득률이 높아야 한다.(3) 제조 원가는 저렴할수록 좋다.(4) 공정은 가급적 짧고 단순하게 한다.(5) 공정 진행에 따라 부생하는 폐기물의 처리가 가능하여야 한다.(6) 공업화가 가능하여야 한다.위의 사항을 항시 염두에 두면서 정제 방법으로서의 각종 단위조작을 종합하여 검토함으로써 최종적으로 그 목적 물질에 가장 적합한 정제 방법을 얻을 수 있다.1) 정제방법배양액의 정제에서 주요한 분리 방법으로는 ①침전법 ② 염석법 ③용매 추출법 ④ 흡이다.

자연과학| 2003.04.16| 9페이지| 1,000원| 조회(1,429)

미생물, 미생물배양법, 발효산물의 정제

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