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전기영동의 원리 종류 응용

1975년 DNA 조각을 전기영동하여 분리한 후 nitrocellulose filter에 옮겨서 특정 DNA 조각을 확인하는 방법이 Southern에 의하여 개발되었다. Southern hybridization은 가장 기본적인 유전자 해석법의 하나이며 유전자 구조에 관한 중요한 데이타를 얻을 수 있기 때문에 광범위한 유전자 해석에 응용되고 있다. 이 방법은 특정 DNA 조각을 확인하는 것 이외에도 클로닝된 유전자의 크기나 제한효소 지도의 검색을 위해 genome중 유전자의 copy수, transgenic animal에서의 외부 유전자 도입 여부의 확인, 유전자의 재조합 (recombination), 삽입 (insertion), 결실 (deletion)의 검증, PCR 산물의 확인 등에 이용 되어, 진핵세포의 genome 해석에 광범위하게 응용되고 있다. 이러한 Southern hybridization의 폭넓은 가능성 때문에 분자생물학에서 중요한 기법의 하나로 자리잡게 되었다.Hybridization이란 한 가닥으로 된 핵산이 이와 상보적인 염기 서열의 또 다른 한 가닥의 핵산과 적당한 조건에서 만나게 되면 이중나선(DNA-DNA or DNA-RNA)을 형성하는 현상이다. Southern hybridization은 DNA-DNA hybridization의 현상을 이용하는 기법이다.Southern hybridization의 원리를 다음과 같다.1) DNA를 추출한다.2) 추출된 DNA를 제한효소로 절단한다.3) 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 크기별로 DNA 조각을 분리한다.4) 이중나선 상태로 있는 DNA를 alkali로 단일 가닥 상태로 만들어 준 뒤 nitrocellulose filter나 nylon membrane으로 옮긴다. 이 때, gel 상에서의 DNA 위치가 변하지 않고 membrane으로 옮겨지게 된다.5) Gel상에서 filter로 DNA를 옮기는 방법으로 capillary transfer 방법을 가장 많이 사용한다. 이 방법은 흡수지에 의해 t에 미치는 힘 F는 F=QE에 의해 주어지는데, 여기서 Q는 분자의 전하량이고 E는 전기장(전극 양단의 전위차를 거리로 나눈 값)이다. 주 저지력 Fs는 마찰에 의한 것이고 Stoke's equation에 의해 아래와 같이 정량화될 수 있다.Fs = 6πγηυ여기서 γ은 분자(입자)반경이고, η은 액체의 점성, υ는 분자 속도이다. 그 외 다른 부 저지력은 용액 내의 다른 이온(반대 이온과 완충 이온)들에 의해 나타난다. 분석하고자 하는 하전된 분자의 주위에 이동도가 서로 다른 이온들이 분포하기 때문에 일그러짐(distortion)이 나타난다. 이러한 일그러짐 현상을 무시한다면, 가속력과 저지력이 같아질 때 하전된 분자는 최종 속도에 도달하게 된다.F = Fs 또는 QE = 6πγηυ υ = QE / 6πγη전하 또는 크기가 다른 분자들은 서로 다른 속도로 이동하며 이것이 전기영동 분리의 기본이 된다. 만일 하전된 분자들과 지지 물질 사이에 상호작용이 있다면 상황은 더욱 복잡해지게 된다. 지지 물질은 대류 현상과 같은 다른 효과들을 감소시키기 위해 사용되는데, 이들이 불연속적인 띠를 형성하여 구성 성분들의 이동을 방해할 수도 있다. 이러한 효과들은 전기영동의 기법들에 설명되어 있다.단백질과 같은 분자의 표면 전하에 미치는 pH의 영향은 이온화가 가능한 기(group)들의 수와 유형에 따라 좌우된다. 이러한 산성 또는 염기성기들의 효과는 단백질이 고유pH(등전점 pI)에서 순 영전하(net zero positive charge)로 된다. 등전점보다 낮은 pH에서 단백질은 순 양전하를 나타내며 pH가 감소할 수록 순 양전하는 증가하고, 전기영동에서 단백질의 이동이 증가된다. 등전점보다 높은 pH에서는 단백질은 순 음전하를 가지게 되며 pH를 높임에 따라 이동도도 증가할 것이다. 그러나 이 경우 방향은 반대가 된다. 분자 전하에 대한 pH의 효과는 이온 교환에서와 같이 전기영동에 있어서도 중요하다. 이와 같은 현상은 산과 염기들에서도 나타나는데, 차이점은 pH의 변수분이 많이 증발하게 되고, 이것은 지지체내의 염을 농축시키게 되고, 그 결과 이온강도가 증가하게 된다. 증발이 커지면, 지지체는 평형을 유지하기 위해 전극 칸막이에 있는 완충액을 지지체의 비어 있는 pore내로 끌어 들이게 되는데, 이와같은 완충액의 움직임을 완전히 조절하기는 어렵다. 이것은 지지체내의 건조정도를 조절하기가 어렵기 때문이다. 과도한 열발생을 피하기 위해서는 높은 전류로 전기영동을 수행하지 말아야 하며, 높은 전류를 낮게 하려면 저항을 크게 해야 한다. 그러므로, 완충액의 이온강도를 낮추므로 저항은 증가되고, 높은 전압과 낮은 전류가 이루어지게 된다. 일반적으로 전기영동은 이온 강도가 가장 낮은 상태에서 단백질 분석을 하며, 흔히 사용되는 이온강도는 = 0.05-0.08 정도이다. 일반적으로 이온강도를 올리면 입자주위의 전기적 이중성 때문에 영동속도가 늦어지고, 이온강도를 낮추면 영동속도는 커지게 되는 반면 이온의 확산, 입자의 확산이 커지므로 분리능력(분해능)이 감소하게 된다.완충액은 일정한 pH와 전류의 전도를 유지하는 것이다. 즉, 용액내에 이온이 많을수록 전류가 지지체를 쉽게 흐르도록 하고 그 결과 저항은 낮아진다.반면, 이온이 적게 들어있는 용액에서는 저항이 크므로 높은 전류에 의한 과다한 열이 생기지 않게 하고, 높은 전압을 사용할 수 있게 되는 것이다. 동일량의 음전하(-)를 갖는 단백입자를 이온력이 낮은 용액과 높은 용액에 두었을 때 이들의 움직임을 보면, 단백질 입자의 음전하는 주위에 양이온 무리를 끌어당겨 전기이중성을 형성하는데, 이온력이 클수록 단백입자 주위에 이온층이 더욱 조밀하게 되고 이온력을 감소시킴에 따라 양이온층이 희박하게 된다. 결과적으로, 이온력이 클수록 단백입자의 이동율은 느리게 된다.그러므로, 낮은 이온력을 갖는 완충액을 써야 전기영동이 빨리 이루어진다. 반면 단백입자의 확산이 증대되는 문제점을 해결하기 위해 단백입자가 확산하는 시간을 주지 않도록 전압을 올리므로 분리시간을 단축시킬 수 있다.3.전기영동의 종러한 아크릴아미드 겔 전기영동법은 소량의 시료를 사용하여 단시간에 시료 혼합물을 분리할 수 있는 장점이 있다.3)불연속 겔 전기영동법(disc-gel electrophoresis)아크릴아미드 겔을 이용하여 단백질들과 같은 하전된 알맹이가 매우 뚜렷한 띠들로 분리될 수 있도록 띠 전기영동법(zone electrophoresis)을 변형한 방법이다. 불연속 겔 전기영동법과 띠 전기영동법의 중요한 차이점은 두 가지 걸계(치쌓임 겔과 분리 겔)를 사용한다는 것과 겔 지지체와 완충용액 탱크에 사용하는 완충계들이 다르다는 것이다. 이 전기영동법을 불연속 겔 전기영동법이라고 부르는 이유는 두 걸계에 사용한 수소 이온농도, 이온의 세기, 완충용액의 조성 및 겔 농도 등이 불연속적이기 때문이다. 불연속 겔 전기영동에 사용하는 폴리아크릴아미드는 아크릴아미드 N,N 메틸렌 비스 아크릴아미드의 중합으로 형성된다아크릴아미드의 자유라디칼을 발생시키기 과황산암모늄을 가하며 중합반응의 촉매로서 N, N, N , N -테트라에틸렌디아민(TEMED)을 첨가한다.치쌓임겔은 아크릴아미드의 농도가 더 낮으며, 더 낮은 이온의 세기의 완충용액으로 제조되며, 따라서 pH도 더 낮다는 점에서 분리겔과 다르다. 첫 두 요인들에 의해서 단백질 분자들의 치쌓임겔에서의 이동은 분리겔에서의 이동보다 더 빨라진다. 그 이유는 첫째, 구멍 크기가 더 큼으로써(농도가 작은 겔에서) 이동하고 있는 분자들에 대한 물리적인 저항이 작기 때문이고, 둘째, 이온의 세기가 작으면 전기적 저항이 더 커지고 따라서 전기장의 세기가 더 커지기 때문이다.시료층(pH 8.3, 트리신-글리신 완충용액)에 있어서는 세 가지 음이온들, 즉 염화이온, 글리신 및 단백질들이 양극 쪽으로 이동하고 있다. pH 8.3에서 글리신의 알짜전하는 염화이온의 전하(-1)의 몇 분의 일이다. 글리신은 염화이온보다 크기 때문에 더 많은 저항을 받는다. 이 두 가지 이유로 염화이온들은 글리신보다 더 빨리 이동하려 할 것이다. 그러나 전류, 즉 이온들의 흐름은 , 한 가닥이 잘라진 원형(nicked circular) 또는 선형(linear)이냐에 따라 아가로오스 겔상의 이동속도가 다르다. 이 세 가지 DNA들의 상대적인 이동속도는 주로 아가로오스의 농도에 의해 결정되지만, 전류의 세기나 완충용액의 이온의 세기, 닫힌 원형구조 DNA에 있어서의 초나사선꼬임(superhelical twists)의 밀도에 의해서도 영향을 받는다. 그러므로 어떤 조건에서는 닫힌 원형구조 DNA가 선형구조 DNA보다 빨리 이동하지만, 다른 조건에서는 반대현상이 일어나기도 한다. 형태가 다른 DNA를 확인하기 위해서는 브롬화에티듐의 농도가 증가되는 조건들에서 전기영동을 수행해 보아야 한다. 즉, 브롬화에티듐의 농도가 증가함에 따라 많은 양의 브롬화에티듐이 DNA에 결합하게 되고, 닫힌 원형구조에서의 음의 초나사선꼬임이 점점 풀리면서 이동속도는 느려지게 된다.4.전류의 세기.:낮은 전압 범위에서는 선형구조 DNA의 이동속도는 걸어준 전압에 비례하여 증가한다. 그러나 전기장의 세기(electric field strength)가 증가함에따라 분자량이 큰 DNA 조각의 이동속도가 서로 다르게 증가하므로 전압이 증가할수록 효과적인 분리가 이루어지지 않는다.5.염기 조성 및 온도.:아가로오스 겔에 의한 DNA의 전기영동은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과는 달리 DNA의 염기조성이나 온도에 의해서 크게 영향을 받지 않는다. 일반적으로, 아가로오스 겔을 사용한 전기영동은 상온에서 행해지며, 아가로오스 겔의 농도가 0.5% 이하일 경우에만 겔에 강도를 주기 위하여 4 C에서 수행해야 한다.4.전기영동의 응용1)단백질의 2차원 전기영동2차원 전기영동은 통상 1차원적으로 등전점 전기영동(Iso Electric Focusing : IEF)을 하고, 단백질을 등전점으로 분리해서 다시 2차원적으로 SDS-전기영동(SDS-PAGE)으로 등전점이 같은 단백질을 분자량을 기준으로 분리하는 방법이다. 이 방법은 최초 O’Farell1)이 고안하였지만 지금은 1차원에서 높은 재다.

자연과학| 2001.04.03| 24페이지| 1,000원| 조회(5,938)

전기영동, 원리, 종류

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전기영동에 관해 평가A좋아요

AGAROSE GEL전기영동시판되는 agarose는 완전히 순수 분리된 것은 아니며 다른 다당류나, 염, 단백질 등이 혼합되어 있으며, 이런 물질들이 포함된 정도에 따라 전기영동시 DNA가 이동되는 정도나 DNA가 gel에서 분리되는 정도가 달라진다. 따라서 효소 억제제와 nuclease가 함유되어 있지 않으며 ethidium bromide로 염색할 경우 형광의 배경을 극소로 하기 위한 특별히 정제된 agarose를 구입하여 사용한다.Gel의 기능을 유지하면서 낮은 온도에서도 녹을 수 있게 화학적으로 변형된 low melting agarose는 gel에서 쉽게 DNA를 용리할 수 있도록 고안된 것인데 현재는 잘 사용되지 않는다. 또 일부 시약회사에서는 아주 작은 DNA 조각(10∼500 bp)을 분석할 때 이용할 수 있는, 낮은 온도에서 gel을 형성하는 agarose를 시판하고 있는데 이와 같은 agarose는 일반적으로 사용되는 agarose보다는 DNA가 잘 분리되지만 polyacrylamide를 이용하여 얻은 결과보다는 그 분리되는 정도가 낮다. 이러한 gel은 agarose의 농도를 높게 하여 사용하므로(4∼10%) DNA 조각들을 gel에서 용출한 후에 제한효소를 처리하면 효소작용이 억제되는 수가 많다.Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.u 여러 DNA 형태를 알아내기 위한 확실한 방법은 e도는 급속도로 빨라진다. Linear와 open circular DNA의 이동은 DNA가 중성의 전하를 띠거나 ethidium bromide에 의해 굳어지는 경우에 이동속도가 느려진다.u 낮은 전압에서 선형으로 된 DNA 조각의 이동속도는 부하되는 전압에 비례한다. 그러나, 전기장에서 전류의 흐름이 커짐에 따라 높은 분자량을 가진 DNA 조각의 이동속도는 빨라지게 되므로 전압이 올라감에 따라 agarose gel에서 DNA 분리 효과가 감소된다. 2 kb보다 큰 DNA 조각들의 분리를 최대로 하기 위해서는 agarose gel에 5V/cm 이상의 전압을 부하시켜서는 안된다.A. Agarose gel 전기영동실험방법1. 깨끗하고 건조한 유리판(또는 전기영동 기구에 꼭 맞게 만들어진 플라스틱판) 사방 모서리를 주형의 모양이 되도록 테이프로 감은 후 수평으로 맞추어진 판 위에 주형을 둔다.u 테이프로 감을 필요가 없는 기구가 요즈음 많이 시판되고 있다.2. 전기영동 tank를 채우고 gel 제조에 이용하기 위한 전기영동 완충용액(1x TAE)을 충분히 준비한다. 다음 표를 이용하여 분리하고자 하는 DNA 크기에 해당하는 양의 agarose 분말과 완충액을 삼각 플라스크 또는 유리병에 담는다.Amount of agarose in gel (%[w/v])Efficient range of separation of linear DNA molecules (kb)0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~32.00.1~2u 1x TAE 용액은 먼저 50x 용액을 제조한 다음 희석해서 쓴다. 50x TAE 1 liter 1 liter를 제조하기 위해서는 Tris 242 g, glacial acetic 57.1 ml, 0.5M EDTA, pH 8.0 100 ml를 녹여 증류수로 1 liter까지 채운다.u 전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 수되어 590 nm의 주황색 형광 가시광선을 내게 된다. Ethidium bromide는 한가닥과 쌍가닥 DNA및 RNA 검색에 모두 사용할 수 있으나 염료의 친화성이 외가닥에서보다 쌍가닥에서 더 강하다.u Ethidium bromide 원액은 증류수에 10 mg/ml로 녹아 있는 용액으로, 이 용액의 보관은 빛이 차단된 용기에 담아서 실온에 보관한다. 이 원액을 0.5 mg/ml로 희석해 두고 이를 gel에 혼합한다.u 주의: Ethidium bromide는 강력한 발암물질이고 독성을 지니므로 이 염색액을 다룰 때에는 반드시 비닐장갑을 사용한다. 사용 후에 이 용액은 정화한 후 버려야 한다.5. Comb을 agarose를 모두 부었을 때 주형의 밑바닥으로부터 0.5∼1.0 mm정도 떨어져서 위치하여 홈을 형성할 수 있도록 고정시킨다.6. 따뜻한 agarose 용액을 주형에 붇는다. Gel은 3∼5 mm 두께가 되도록 하고 기포가 생기지 않도록 주의한다.8. 실온에서 20∼30분 두어 gel이 완전히 굳은 후 comb과 테이프를 조심스럽게 제거한 다음 gel을 전기영동 tank안에 설치한다.u 0.5% 이하인 낮은 농도를 가진, 낮은 온도에서 녹는 agarose로 제조한 gel은 4 C 이하에서 굳힌 다음 냉장실에서 전기영동해야 한다.9. Gel을 1mm 정도의 두께로 덮을 수 있을 정도로 충분한 양의 전기영동 완충용액(1x TAE)을 가한다.10. DNA 시료를 전기영동용 loading 완충용액과 혼합한 후 pipette을 이용하여 잠겨있는 gel의 홈에 혼합액을 조심스럽게 가한다.u 전기영동용 loading 완충용액은 보통 6x로 제조하여 사용한다. 여러가지 종류가 있는데 우리 실험실에서는 type II (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll[type 400, Pharmacia]을 증류수에 녹인 것. Ficoll이 잘 안녹으므로 50 C에 약 1시간 두어 녹인다)를 쓴다. 만약 DNA 용액 DNA 조각들로 구성되어 있을 때(예: genomic DNA를 제한 효소로 절단할 때) 홈당 20∼30 ml의 DNA를 가하여 분석할 수 있다.u 한 홈에 가할 수 있는 최대부피는 홈의 3차원적 크기에 따라 결정된다. 예를 들면 일반적으로 사용되는 0.5 cm x 0.5 cm x 0.15 cm의 홈에는 37.5 ml를 가할 수 있다. 그러나, 옆의 홈에 가한 시료와 혼합되는 것을 막기 위하여 gel을 좀 더 두껍게 제조하거나 DNA를 에탄올로 침전시켜 DNA 부피를 줄여서 가하는 것이 좋다.u 시판되는 알려진 크기의 표준 DNA를 크기 표식자를 같이 전기영동하여 모르는 DNA의 크기를 측정할 수 있다. 크기의 비교가 가능한 것은 linear DNA임을 주의한다. 주로 많이 사용되는 표식자에는 1 kb ladder, 123 bp ladder, l HindIII ladder 등이 있다.11. Gel tank의 뚜껑을 닫고 DNA가 양극 쪽으로 이동해갈 수 있도록 양극에 빨간 도선을, 음극에 검정 도선을 연결하고, 전극간의 거리 1 cm당 1∼5 V의 전압을 가한다.u 전기영동을 시작하면 전기분해에 의하여 양극과 음극에서 기포가 발생하고 시약에 섞인 염료가 홈으로부터 이동해가는 것이 보인다. Bromophenol blue와 xylene cyanol FF가 적당한 거리만큼 이동해갈 때까지 전기영동을 시행한다.u 전기영동하는 동안 ethidium bromide는 음극 쪽으로 (DNA와 반대 방향으로) 이동해 가므로 오랫동안 전기영동을 하면 ethidium bromide는 gel에서 모두 빠지게 되어 작은 DNA 조각을 감지하기가 어렵게 된다. 이렇게 되는 경우에는 gel을 ethidium bromide가 0.5 mg/ml 포함된 증류수나 1x TAE 용액에 30∼45분간 담가 염색하였다가 관찰하면 된다.u Gel에 ethidium bromide가 함유되어 있으면 전기영동하는 동안 어느 시기에나 자외선하에서 관찰이 가능하다. 그러나, gel에 ethidium bromink의 뚜껑을 연 다음 gel을 자외선하에서 관찰하고 촬영한다.B. Agarose gel에서 DNA의 용출DNA를 전기영동하여 관찰되는 band 중에서 특정한 band를 gel로부터 유리해낼 수가 있다. 이 방법은 재조합 DNA를 만들때 대단히 중요하게 쓰이는 기술이므로 보다 회수율이 높고 용출(elution)된 DNA의 순수도가 보다 높고, 또한 보다 빠르고 간편하게 실행할 수 있는 방법이 계속적으로 개발되고 있다. Gel에서 DNA를 회수하는 많은 방법 중에서 대표적인 방법은 다음과 같다.1) 전기영동에 의한 DEAE-cellulose membrane 위로 DNA 조각의 이동2) 투석 주머니속에서의 전기 용출(electroelution)3) Low melting agarose gel로부터 DNA 용리4) Gene Clean III kit(Bio 101)를 이용한 추출5) QIAquick kit(QIAGEN)를 이용한 추출DEAE-cellulose membrane 위에서의 전기영동은 여러 DNA를 동시에 분리하고 0.5 kb~5 kb 크기의 DNA를 분리함에 있어서 효율성이 높은 비교적 간단한 방법이다. Membrane으로부터 분리되는 DNA는 순도가 높으므로 거의 모든 용도로 사용이 가능하다. 투석 주머니속에서의 전기 용리는 현재까지 알려진 가장 불편한 방법이지만 5 kb보다 큰 DNA 조각들을 분리하는 데에는 가장 효과적인 방법이고 순수도가 높다. 낮은 온도에서 녹는 agarose gel로부터 DNA를 분리하는 방법은 위의 두 방법에 비해 분리되는 DNA 양이 적지만 제한효소나 ligation에 필요한 효소를 gel에 직접 처리할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 그러나 요즘 실험실에서는 kit를 이용한 방법이 가장 많이 쓰인다. 무엇보다도 빠르고 간편하며 회수율과 순수도도(계속 개발되고 있음) 높기 때문이다.1) Gene Clean III kit를 이용한 추출Gene Clean III kit(Bio101)에는 glassmilk라는 silica matrix다.

자연과학| 2001.04.03| 6페이지| 1,000원| 조회(1,288)

생화학, 전기영동, 아가로스겔

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