< 심장생리학 >>1. 서론* 생명의 수태 후 사망까지 심장 박동은 계속 된다.* 수송을 담당하는 순환기계※ 순환기계(circulatory system)① 심장(heart): 압력을 혈액에 실어주는 펌프로서 혈액이 조직으로 흘러가는데 필요한 압력 경사를 만든다.② 혈관(blood vessel): 혈액이 심장에서 신체 각 조직으로 가서 분포하도록 통로 역할을 함.③ 혈액(blood): 운반될 물질이 녹거나 떠 있도록 해주는 운반 매개체 역할.2. 심장의 해부* 꼭 쥔 주먹 크기의 비어있는 근육기관* 위치 : 흉골(sternum)과 척추(vertebrae) 사이의 중간지점.즉, 흉강(thoracic cavity) 내에 위치.* 심폐소생술(cardiopulmonary resuscitation, CPR): 심장이 효과적으로 수축하지 못할 때 흉골을 규칙적으로 눌러 심장으로부터 혈액을 인위적으로 방출1) 이중 펌프로서의 심장- 해부학적으로 단일기관이지만 좌우측 심장은 2개의 분리된 펌프로서 기능.- 4개의 방 : 2개의 심방(atria)과 2개의 심실(ventricle)- 정맥(vein) : 조직으로부터 돌아오는 혈액이 심장으로 들어오는 혈관- 동맥(artery) : 심실에서 조직으로 혈액을 운송하는 혈관- 격벽(septum) : 심장을 좌우를 나누어주는 벽으로 양쪽에 있는 혈액의 혼합을 방지하 는 근육의 연속된 형태(1) 혈류의 전체 순환 회로- 체순환에서 돌아오는 혈액은 대정맥 이라 부르는 큰 정맥을 통해 우심방으로 들어온 다- 우심방에서 우심실로 이동하고 우심실은 폐동맥을 통해 폐로 내보낸다.- 폐에서는 혈액이 과도한 이상환 탄소를 읽고 폐정맥을 통해 좌 심장으로 들어가기 전 산소의 공급을 받는다.- 좌측 심장은 폐순환으로부터 혈액을 받아 체순환으로 혈액을 내 보낸다.- 대동맥 : 좌심실에서 혈액을 내보내는 큰 동맥- 혈액의 일부는 좌심실에서 근육으로 보내지고 일부는 신장, 일부는 뇌로 이동한다.(2) 좌우 펌프의 비교- 양쪽 펌프는 동일한 양의 혈액을 동시네 내심방 수축 시 부분적으로 압축된다.(4) 판막의 섬유성골격- 4개의 심장판막은 다단한 결합조직으로 이루어진 4개의 연결 고리에 의해 부착되어 있다.- 섬유성 골격은 심방을 심실에서 독립되게 하고 심장 근육이 부착되도록 적당히 딱딱 한 구조를 제공한다.- 꼬인 형태의 구조는 기능적으로 중요하여 심장이 더 효과적으로 수축하는 데 도움을 준다.3) 심장벽은 주로 나선형으로 배열된 심근섬유에 의해 이루어진다.- 심장벽은 3개의 특징적 층으로 구성① 심장내막 : 혈관내피의 얇은층으로, 전체 순환기계를 경계 짓는 표피조직의 독특한 형태다.② 심근층 : 중간층으로 심근으로 이루어지며 심장벽의 대부분을 구성.③ 외심막 : 심장을 덮고 있는 얇은 외부막- 심근은 심장을 나선형으로 둘러싸고 있는 근섬유 다발로 구성.4) 심근섬유는 삽입원판에 의해 상호 연결되어 있고 기능적 단위를 형성한다.- 각각의 심근세포는 상호 연결되어 있어 여러 갈래의 섬유를 형성하는데, 이웃하는 세 포의 끝부분은 삽입원판 이라고 하는 독특한 구조로 서로 연결되어 있다.- 데스모솜은 세포들을 기계적으로 연결해주는 결합 형태로 많은 기계적 스트레스에 노 출되는 심장과 같은 조직에 특별히 많다.- 삽입원판 사이에는 마주하는 두 막이 매우 가까이 서로 근접하여 간극 접합을 형성 한다.- 심방과 심실 사이에는 근극 접합이 없다.- 심방과 심실 흥분-수축의 동시성 때문에 심장 한 부분에서 자동적으로 만들어진 전기 자극은 전체 심장으로 퍼진다.5) 심장은 심낭에 의해 둘러싸여 있다.- 심장은 이중벽으로 된 막인 심낭 내에 들어 있다.- 심낭액은 심장이 박동하여 매번 움직일 때 심장 주변부 층 사이의 마찰을 방지하는 윤 활제로서 역할을 한다.- 심낭염은 심낭에 염증이 생긴 것으로 두 층 사이의 고통스러운 마찰을 유발하고, 종종 바이러스나 박테리아 감염에 의해 발생한다.3. 심장의 전기적 활성* 자동 조율성 : 심장 수축은 자체적으로 일어나는 활동 전위를 한다.* 근세포① 수축담당 세포 - 혈액을 내보낼 수 있도록 기계로 전달된다.(2) 비정상적인 조율기 기능- 동방결절이 기능 이상일 때, 다음으로 빠른 방실결절이 역할 대신 수행.- 잠복성 조율기 : 동방결절을 제외한 다른 자동조율 세포- 완전 심장 차단 : 심방과 심실 사이 전도능력이 손상되거나 기능에 이상이 있을 때발생- 심실반응이 1분단 30회일 때 혼수상태- 매우 비정상적으로 심박률이 느릴 경우 인공 조율기를 사용(분당 70회로 자극)- 이소성 초점 : 푸르킨예 조직에서 동방결절보다 더 빠른 활동전위를 만들어 내는 등 비정상적 흥분성을 가진 곳.- 미성숙 박동 또는 외수축기: 동방결절에서 활동전위를 만들기도 전에 미리 활동전위를 만들어 내어 전체 심장을 뛰게 하는 등 간헐 적으로 일어나는 자극.3) 효율적인 수축을 위해 심장 흥분성의 전파는 일률적으로 일어난다.- 흥분성의 전도 요건① 심방의 흥분과 수축이 심실의 수축이 시작하기 전에 종료되어야 한다.② 하나의 심방 또는 심실을 구성하는 심근섬유들이 동시에 잘 연결되어 흥분되어야 한 다.③ 한 쌍의 심방과 한 쌍의 심실이 기능적으로 잘 연결되어서 두 쌍이 동시에 수축하여 체순환과 폐순환이 동시에 일어나야 한다.(1) 심방의 흥분- 심방 간 경로 : 우심방에 있는 동방결절에서부터 좌심방으로 이어진 전파과정.- 결절 간 경로 : 동방결절에서 방실결절로 이어져 있는 과정.(2) 심방에서 심실로의 흥분성 전달- 활동전위는 방실결절을 천천히 통과하여 심실에 혈액이 충분히 채워질 수 있는 시간 을 준다.- 방실결절지연 : 약 100msec(3) 심실의 흥분- 방실결절 지연기 이후 활동전위는 히스속으로 전달되고 푸르킨예 섬유를 거쳐 빨리 심실로 전파된다.- 활동저위를 발생하는 심근세포에 이웃하는 세포들은 간극 접합에 의해 전달되는 자극 을 받아 활동전위를 일으킨다.- 심실 전도 과정은 심방의 과정보다 매우 잘 짜여져 있고 중요하다.- 심실 활동 전위가 히스속과 푸르킨예 섬유를 통해 두 심실 모두 동시에 수축하도록 하여 결국 심장이 하나처럼 수축할 수 있게 하며 효과적인 혈액 방출시켜서 수축을 강하게 한다.6) 심장 근육의 긴 불응기는 근강직을 방지한다.- 불응기는 활동전위 시작 직후 시작되고, 그동안 흥분성 막의 반응성은 완전히 없어지고 다른 활동전위의 발생이 불가능하게 된다.- 근강직 : 지속적인 최고치의 수축력- 심장 근육은 수축이 종결되기 전에 다시 자극에 반응하지 않고 근강직이 발생하지 않 는다.7) 심전도는 심장 전기활성의 전반적 전파과정을 보여준다.- 심전도 : 탈분극과 재분극 기간동안 심장 근육에 의해 발생하는 전류가 신체 표면까지 전달된 것을 기록한 신호.- 심전도 고찰시 고려 요소① 심장 전기적 성질의 일부가 체액에 의해 전달되는 것이어서 실제 심장의 전기적 활성 을 나타내지 않는다.② 심장의 탈분극과 재분극기에 심장 전체에 퍼지게 되는 전기적 활성을 복합적으로 나 타낸다.③ 심전도 기록은 신체 표면의 두 지점에서 전극으로 측정하는 전압차를 나타낸다.- 신체 표면에서 전기적 활성을 정확히 기록하는 것은 전극의 방향에 의해 결정- 심전도 표준을 제공하기 위하여 심전도 기록에는 일반적으로 12개의 다른 고전 기록전 극 또는 유도가 이용.: 6개는 팔다리 부분, 다른 6개는 심장 근처 가슴 부분8) 심전도의 구성 요소들은 특정 심장 활동에 관련된다.- 정상 심전도의 세가지 웨이브 형태① P파 : 심방 탈분극 나타냄.② QRS 복합군 : 심실의 탈분극 나타냄.③ T파 : 심실 재분극을 나타냄.- 심전도의 중요점① 처음 기록 되는 P파는 심방에서 전달되는 활동전위를 나타낸다.② 정상 심전도에서는 심방의 재분극을 식별할 수 없다.③ P파는 QRS 복합군보다 훨씬 작은 신호이고, 이것은 심방이 심실에 비해 훨씬 적기 때문이다.④ 세 번에 걸쳐 심장 근육에는 아무 전류도 흐르지 않는 시기가 있고 이때 심전도는 휴 지기 전압을 보인다.ⓐ PR구획 : 방실결절에서 활동전위가 지연되는 시간ⓑ ST구획 : 심실이 완전히 탈분극되고 심실 근육세포가 활동전위의 고평부에 있을 때ⓒ TP간격 : 심장 근육이 완전한 휴지기에 있고 심실에 혈액이 들심방에서 심실로 들어간다(2) 심실 이완 후기- 동방 결절이 역치에 도달하여 활동전위를 만든다- 자극은 심방 전체에 퍼져 심전도 P파가 기록된다- 심방 탈분극은 심방의 수축을 일으켜 심실로 더 많은 피롤 보내며 심방 압력을 증가 시킨다.(3) 심실 이완 말기- 심실 수축이 시작되면 심실 이완기는 종결된다.- 더 이상 혈액이 심실 내로 들어오지 않는다.(4) 심실 흥분과 심실 수축기의 시작- 심방 수축 후, 자극은 방실결절과 특수 전도 시스템을 따라 이동해 심실을 흥분시킨다- 심실 흥분이 완결될 즈음 심방 수축은 종결- 심실 수축이 시작하면 심실 압력은 즉각 심방 압력보다 상승해 방식판막을 닫는다(5) 등용적 심실 수축- 방실판막이 닫히고 대동맥판막이 열리기 전에는 심실이 잠시 폐쇄된 공간으로 존재- 등용적 심실 수축 : 모든 판막이 닫혀 있어 혈액이 심실로 가거나 심실로부터 나올 수 없을 때- 심실 압력은 부피가 일정함에도 불구하고 계속 증가한다.(6) 심실 분출- 심실 압력이 대동맥압보다 커질 때 대동맥판막이 열리고 혈액의 방출이 시작- 심실 부피는 혈액이 빠르게 나갈 때 현저히 감소- 심실 수축기는 등용적 수축기와 심실 이완기를 포함(7) 심실 수축 말기- 이완 말기에 심실 내에 있는 혈액의 반 정도만이 다음 수축기에 방출- 수축 말기용적 : 수축기 말 완전히 방출이 끝났을 때 심실에 남은 혈액의 양- 1회 박출량 : 심실이 한 번 수축할 때 방출하는 혈액의 양(8) 심실 재분극과 심실 이완의 시작- T파는 심실 수축 말기에 일어난 재분극을 상징- 심실이 재분극과 함께 이오나을 시작할 때 심실압은 대동맥압 이하로 떨어짐- 중복 절흔 : 대동백판막이 닫힐 때 대동맥압 곡선에 생기는 굴곡(9) 등용적 심실 이완- 모든 판막은 다시 잠깐 동안 닫혀있게 되는 기간- 심근섬유의 길이와 부피는 일정하게 유지- 심실이 계속 이완하고 압력은 점차 낮아지고 혈액은 심실로 들어가지도 심실로부터 나오지도 않는다.(10) 심실 충만- 방실판막은 열리고 심실에 혈액이 다시 차기 실판막
1. 분광광도계의 원리와 투과율/흡광도=> 분광 광도계란 특정 파장의 빛을 분광하여 시료에 통과시켜 빛의 투과율과 흡수율(흡광 도)을 측정하는 장치이다. 투과율은 빛이 시료를 통과하는 량을 나타내며, 흡광도는 투과 율의 로그 함수로 나타내어지는데, 각각 다음과 같은 수학식에 따라 구해진다.[수학식 1] 투과율(t) = I/I0여기서, I0는 시료에 입사되는 빛의 세기, I 는 시료를 통과한 빛의 세기이다.[수학식 2] 흡광도(ABS) = -log(t)일반적인 방식의 분광 광도계는 먼저 블랭크(Blank)라 불리는 기준 시료에 빛을 통과시켜 나온 빛의 세기를 100 %로 기억하였다가 (0점 조정), 샘플 시료에 빛을 통과시켜 나온 빛의 세기를 %T(=t×100)값으로 나타낸다.[수학식 3] 흡광도(ABS) = K x l x c (Lambert-Beer's Law)여기서, K는 흡광계수, l은 투과층의 두께, c는 용액의 농도인데, K가 일정한 구간에 있어 흡광도(ABS)는 농도에 비례함을 알 수 있다. 이 공식을 이용하여 분광광도계를 이용한 농도측정실험을 할 수 있다.2. 분광광도계의 작동=> 그림1은 컴퓨터와 연동되는 분광 광도계의 모형을 도식적으로 보여준다.[그림 1]사용자(1)는 키패드(21)를 이용하여 분광 광도계(2)를 구동시키며, 분광 광도계와 컴퓨터(4)의 인터페이스가 가능한 경우 컴퓨터의 키보드(41)로도 구동시킬 수 있다. 측정된 데이터(그림1의 점선이 데이터의 흐름)는 분광 광도계와 컴퓨터에 내장된 CPU(22, 42)에서 처리되어 각각 LCD(25)와 컴퓨터 모니터(45)를 통해 사용자에게 전달(150)된다.실제로 측정을 실행하는 것은 분광 장치(모노크로미터(monochromator): 23)를 포함하는 분광광도계의 일부분으로서, 사용자가 분광광도계의 한 부분(이하 셀 홀더: Cell Holder)에 시료를 넣고 명령을 내리면(100), CPU는 모노크로미터와 센서, 셀 홀더 등을 작동시켜 필요한 데이터(130)를 얻게 된다. 이 데이터는 C. 어떤 흡수대의 세기가 증가하는 것은 농색효과(hyperchromic effect)라고 부르며, 세기가 저하하는 것은 담색효과(hypochromic effect)라고 부른다.[복사선 광원]흡수 분광 광도법의 복사선 광원은 두가지 기본적인 요건을 가지고 있다. 첫째는 흡광도를 측정하는 전 파장 영역에 충분한 복사선 에너지를 공급하여야 한다. 둘째는 측정이 이루어지는 동안에 일정한 세기를 유지시켜야 한다. 만일 흡광도를 측정하는 영역에서 세기가 약해지면 시료를 통과하는 파장범위를 넓혀서 필요한 출력에너지를 공급하여야 한다. 이와 같이 파장범위가 넓어지면 흡광도 측정시 오차가 발생하게 된다.1. 수소 혹은 중수소 방전등 : 가시선의 광원으로는 텅스텐, 필라멘트등이 있고, 자외선의 광원은 파장이 180∼360nm이어야 하는데 수소 방전관은 165∼375nm의 파장 범위로 파장범위는 넓으나 빛세기는 약하며 중수소 방전관은 빛의 세기의 약 3∼5배 정도이다. 또한 수은 방전관은 200∼400nm의 파장범위로 보정용으로 흔히 사용된다.2 광원의 안정성 : 백열등이나 방전광원의 단기간 고도 안정성은 홑빛살(single beam) 분광광도계에는 반드시 필요하다. 백열등이나 방전광원에서 나오는 복사선의 세기는 1 이상의 차수로 상승된 램프전압에 비례한다. 분광광도법에서 얻을 수 있는 정밀도인 0.2% 이내로 광 전류를 안정화시키려면, 백열등 광원의 전압은 수천분의 1 이내로 조정될 수 있어야 한다. 광원의 안정성은 정전압 변환기와 전자 전압 조정기를 사용하면 얻을 수 있다.3. 파장 선택 : 분광 광도법은 보통 불연속적인 복사선 피크를 분리시킬 것을 필요로 한다. 정량분석의 기본이 되는 Beer의 법칙은 단색 복사선이라는 가정에서 비롯되며, 또한 방출법에서는 바탕과 분석 방출성간의 가장 좋은 신호비율을 선택하여야 한다. 복사선을 각 성분파장으로 분리분산시켜 원하는 파장영역을 분리하기 위하여 필터나 혹은 단색화장치를 사용하여야 한다.{자외선-가시광선 분광광도계의 장치}1. 필터 충분히 크지 못하기 때문에 주변 파장의 세기를 감소시킨다. 프리즘 분산능은 파장에 대하여 비직선적 분산을 하지만 회절발은 비교적 직선적인 분산을 한다. 투과 회절발을 통과하는 수많은 가는 평행 빛살은 각각 새로운 광원처럼 행동한다. 그리하여 이들 수많은 빗살 사이에 간섭이 일어나서 성분파장으로 분산된다. 회절발에는 투과회절발과 반사회절발이 있다. 과회절발(transmission grating)은 빛살이 통과할 때 분산 유리판이나 다른 투명한 물질위에 수 많은 평행한 홈선을 조밀하게 긋는다. 또한 반사회절발(reflection grating)은 빛살이 반사할 때 분산 금속표면에 홈을 긋던지 회절발의 반사표면에 알루미늄 증기를 엷게 고착시켜 만든 것으로 일반적으로 많이 사용되어 진다.5. 이중 단색화법(Double Monochromation) : 이중 단색화장치에는 두 개의 분산계가 연속적으로 사용된다. 사이에 있는 슬릿은 단순히 첫 번째 단색화장치의 출구 슬릿이며 두 번째 것의 입구슬릿이 된다. 양편의 파장 작동은 서로 완전히 추적되어야 한다. 어떤 이중 단색화장치에서는 다른 분산기가 각각에 사용된다. 보통 첫째 것은 프리즘이며 두 번째 것은 회절발이다. 석영프리즘은 두 번째 회절발 단색화장치에 단일 차수를 공급하기 위한 차수 분리기로 작용한다. 빛을 채취하는 기하학적 배열은 겹빛살형이다. 두 개의 동일한 단색화장치를 연속적으로 사용하면 분산과 분해능은 대략 두배가 되고 미광 복사선은 크게 감소한다.6. 시료용기 : 시료용기는 시료를 담는 그릇을 말하는데, 용액 상태의 시료용기와 기체상태의 시료용기가 있다. 이용하는 파장영역의 복사선을 통과시키는 재료로 만들어야 하며 주로 석영이나 용융-실리카를 사용한다. 용기의 기벽에 묻은 지문, 그리스등은 투광도에 큰 영향을 주므로 분석에 들어가기 전에 용기를 깨끗이 닦아줘야 한다. 또한 반사 손실을 막기 위해 용기는 직각으로 설치해야 한다. 시료를 넣어 사용한 후에는 시료의 종류에 따라 증류수, 메탄올, 세척제 또는 진한포되어 있다. 전극의 둥근모양은 일차원에서 전자가 집중되게 하고, 더높은 전압이 유지된 연속적인 전극에 이와 같이 전자 증배 과정을 반복시키면 결국 양극에 충돌하는 전류를 생성시킨다. 이렇게 해서 내부 전류 증배 혹은 이득이 얻어진다.[흡수 분광법 기기]분광광도법에서 측정하고자 하는 양은 흡광도 이다. 그러나 흡광도를 직접 측정하는 것은 불가능하므로 실제로는 시료 통과 전 . 후의 투광도를 측정하고 다음 관계식에 의하여 흡광도를 얻게 된다. 즉 와 같이 투광도를 비교 측정하는 방법은 기기의 설계방법에 따라 여러 가지 형식이 가능한데 일반적으로는 홑빛살형(single beam type)과 겹빛살형(double beam type) 등 두가지 방식으로 구분된다. 자외선-가시선 분광 광도계는 기기 분석에 사용되는 기기중에서 그 종류가 가장 다양하다. 따라서 종류마다 각각의 특성과 장단점을 가지고 있다.1. 홑빛살형 분광광도계 : 홑빛살 기기의 경우 고려되어야 할 점은 빛의 통로를 차단했을 때 측정계기는 0점을 가르켜야 하고, 대조용액에 빛을 통과시킨 후 흡광도는 0점 또는 투광도는 100 %T를 가리켜야 한다. 다음 시료 용액에 빛이 통과하도록 한 후 흡광도 또는 투광도를 읽게 된다. 위의 세가지 단계는 시료 용액의 흡광도를 측정할 때나 측정파장이 다를 때마다 반복해야 하는 단점이 있다. 또한 이와 같은 기기는 광원과 검출기의 안정도가 매우 높아야 한다.2. 겹빛살형 분광광도계 : 홑빛살 기기에서의 시간차에 의한 측정오차를 줄이고 보다 측정방법을 다양화 할 수 있게 설계된 것이 겹빛살형 분광광도계이다. 겹빛살형 기기에서는 시료와 대조용액의 투광도를 동시에 비교하기 위하여 광원에서 나오는 빛을 시료쪽과 대조용액으로 동시에 또는 거의 동시에 분배해야 하는데, 분배방식에 따라 공간 겹빛살형(double beam in space)과 시간 겹빛살형(double beam in time)의 두가지로 나눌 수 있다. 공간 겹빛살형에서는 단색화 장치의 출구 슬릿을 통과한 빛이 거울에 측정의 오차 : 측정이나 기기에 의한 오차, 파장선정이 나쁠 때, 흡광도 눈금의 부정확, 지시계의 눈금을 그을 때 나타나는 오차, 영조절과 100조절의 오차, 각 흡광용기의 두께나 재질의 차이 등이 있다.[용매]흡수대의 구조와 위치는 용매의 성질에 의존한다. 일반적으로 극성용매는 흡수대의 위치를 이동시켜 그 진동 구조를 감소시키는 경향이 있다. 특히 수산기를 갖는 용매 중에서는 구조가 완전히 불명확하게 된다. 비극성용매는 기상 스펙트럼에 비하여 흡수대의 큰 변화가 없다. 그림 8.11은 흡수대에 미치는 극성용매와 비극성용매의 스펙트럼의 영향을 나타내고 있다. 비극성용매는 용질과 수소결합을 하지 않으므로 용질의 스펙트럼이 기체상태와 유사하지만, 극성용매의 경우는 수소결합으로 용질과 용매가 착물을 이루어 섬세한 구조의 흡수대를 방해하게 된다. 용매의 선택시 투명할 뿐만 아니라 흡광물질계에 영향을 주지 않는 것을 고려해야 한다. 물이나 알코올, 에스테르, 케톤등 극성용매에서는 진동효과에서 생기는 스펙트럼의 미세 구조를 지워버리는 경향이 있으며 흡수 극대위치도 용매성질에 영향을 받아 이동한다. 흡수 스펙트럼을 물질 확인 목적으로 비교하는 경우에는 똑같은 용매를 사용하도록 한다.[일반적인 정량과정]원칙적으로 정량하고자 하는 물질의 최대 흡수파장()과 몰흡수율()을 정확히 알고 있으며, 다른 물질에 의한 간섭이 없고, Lambert-Beer의 법칙을 엄밀히 따른다면 용액의 흡광도를 바로 측정하므로써 Lambert-Beer의 법칙으로부터 농도를 계산할 수 있다.1. 표준용액의 제조 : 측정하고자 하는 농도 범위에서 일련의 표준 용액을 만든다. 표준 용액의 조성 은 가급적 시료용액과 비슷해야 하며, 흡광도가 농도 오차 곡선에서 밑부분에 들도록 해야 한다. 만일 시료용액속에 어떤 알려진 오염물질이나 간섭물질이 있다면 표준 용액제조시 똑같이 재현시 켜야 한다.2. 바탕액의 제조 : 바탕용액의 조성은 시료용액의 측정성분을 뺀 나머지 조성과 동일해야 한다.3. 바탕선의 확인 : 도법
--그람 염색--그람 염색은 세균학에서 가장 많이 사용되고 있는 염색법이다. 그람양성균과 그람음성균을 구별하는 염색이기 때문에 differential stain이라고도 한다. 1884년 C. Gram에 의해 처음 창안된 염색법으로 두 가지의 세균으로 분류된다 . 이후 여러 가지 방법이 제안되었으며 Hucker의 방법과 Burke의 방법이 일반적으로 사용된다. 여기에서는 전자를 위주로 설명하였다.그람 염색 결과 자주색으로 염색되는 세균은 그람양성이며 분홍색으로 염색되는 세균은 그람 음성이다. 양성과 음성은 전기적 성질과는 무관하며 단순히 형태학적 차이를 나타내는 용어이다.그람양성균과 음성균이 서로 다르게 염색되는 것은 근본적으로 세포벽 구조가 다르기 때문이다. 세균의 세포벽은 크기와 형태를 유지하게 하며 또한 삼투압에 의한 세포 파열을 방지하는 역할을 한다. 세포벽에는 펩티도글리칸(peptidoglycan)이라고 하는 물질이 있기 때문에 아주 단단하다. 그람양성균의 세포벽은 여러 층의 펩티도글리칸 층이 두껍게 감싸고 있는데 세포벽의 약 80-90%가 펩티도글리칸이다.반면 그람음성균의 세포벽은 펩티도글리칸층이 한 겹으로 매우 얇으며, 이층 외부에는 인지질, 리포폴리사카라이드, 리포프로테인 등으로 구성된 외막(outer membrane)이 감싸고 있는 형태로 세포벽이 이루어져있다. 세포벽의 10-20%만이 펩티도글리칸이다. 이러한 세포벽 구조의 차이로 인한 그람 염색의 차이는 세균을 분류하는 가장 기본적인 기준이 되었다.그람염색법은 1884년 Hans Christian Gram에 의해서 처음으로 개발된 방법으로 각종검체및 배양집락의 현미경적 검사에 이용되며 미생물에 의한 감염여부를 조기에 진단할수 있게 해준다. 그람염색은 각 세균의 세포벽을 이루고 있는 성분과 구조에 따라 다르게나타나는데 그람양성세균의 경우 세포벽이 두꺼운 peptidoglycan layer와 풍부한 teicoicacid로 이루어져 있어서 organic decolorizer(탈색제)로 탈색시 쉽게 탈색되지 않으며따라서 염색액 crystal violet이 계속 세균내에 남아있어 보라색으로 염색된다.반면 그람음성세균은 peptodoglycan layer가 단일층으로 되어 있으며 세포벽이 지방성분이풍부한 lipopolysaccharide(LPS)로 이루어져 있어 organic decolorizer(탈색제)에 의해crystal violet이 쉽게 탈색되며 따라서 대조 염색액인 safranin O로 염색되어 붉은색을 나타낸다.< 그람 염색의 기본적으로 4단계 구성>제 1 단계: 크리스탈 바이올렛 염색=> 염기성 색소인 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하면 그람 양성 및 음성 균 모두 자주색으로 염색된다.제 2단계: 착색 단계=> 1단계에서 염색된 세균에 요오드 용액을 처리하면 크리스탈 바이올렛과 요오드가 반응하여 세포내에 불용성의 복합체(크리스탈 바이올렛-요오드 복합체, CV-I)을 형 성한다. 따라서 그람 양성 및 음성 세균 모두 자주색으로 여전히 보인다.제 3단계: 탈색=> 착색된 세균에 탈색제인 알코올 시약을 처리하면 착색된 CV-I 복합물이 용해된다. 이때 그람 양성균과 음성균은 서로 다른 반응을 보인다. 그람양성균인 경우에는 복 합물이 세포내에 그대로 남아있지만, 그람 음성균은 탈색된다. 따라서 탈색 단계가 지나면 그람 양성균은 자주색이지만 그람음성균은 백색으로 보인다.제 4단계: 대비 염색=> 분홍색의 염기성 색소인 사프라닌(safranin)으로 대비 염색을 하면 백색으로 탈색 되었던 그람 음성균은 사프라닌의 색인 분홍색으로 염색된다. 그러나 자주색으로 염색된 그람 양성균은 영향을 받지 않고 그대로 자주색으로 보인다.지금까지 알려진 바로는 그람양성균의 CV-I 복합체가 탈색되지 않는 이유가 다음과 같다. 즉 탈색제로 사용되는 알코올이 여러 층의 펩티도글리칸을 탈수시켜 분자간의 공간을 좁히기 때문에 CV-I 복합체가 세포밖으로 빠져 나오지 못하는 것이다. 따라서 자주색이 그대로 남는다. 그러나 그람음성균의 경우 대부분 인지질로 구성된 외막과 세포막(cytoplasmic membrane)이 알코올에 쉽게 용해되며, 한 겹의 얇은 펩티도글리칸 층은 CV-I 복합체를 막기 곤란하기 때문에 쉽게 탈색된다.이처럼 그람 양성과 음성의 차이는 세포벽 구조에 따른 차이로 인해 구별되며 어떤 경우에는 그 차이가 불명확하여 그람양성이 그람음성으로 염색되기도 한다.1. 실험 방법상 오류: 예를 들어 처음 세포를 고정할 때 지나치게 강한 열처리를 하거나, 알코올로 탈색하는 것 을 지나치게 오래하거나, 세척을 너무 강하게 하면 그람 양성균도 CV-I 복합체를 상실하 여 그람 음성처럼 보일 수도 있다.2. 세포의 상태: 24시간 이상 배양된 세균 세포, 즉 대수가가 아니라 정상기나 사멸기의 상태에 있는 오래 된 세균은 그람양성균이 음성균처럼 염색될 수 있다.3. 세균 자체의 특성: 그람 양성균에도 CV-I 복합체를 세포내에 가두는 능력에 차이가 있어 쉽게 잃어버리는 그람양성균은 음성균처럼 염색될 수 있다. 따라서 실험 수행과 결과 분석을 신중하게 하 여야 한다.시약조제방법주의사항염색제용액 A (crystal violet 2.0g + ethanol(95%, v/v) 20ml)
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