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Lactic acid and 2,3-DPG

Ⅰ. Purpose운동 중 에너지 요구량이 aerobic metabolism 능력을 초과하거나 O2의 공급에 제한이 따를 경우, 근세포는 운동에 필요한 에너지를 anaerobic glycolysis에 의존한다.Anaerobic glycolysis의 최종 산물은 lactic acid(이하 lactate)이며 근육내 lactate의 축적은 근 피로의 직접적인 원인이 된다.lactate는 운동 제한 효소로서만 작용하는 것이 아니며 운동 후 회복기에, 혹은 장시간 운동의 후반부에서 에너지로 이용되기도 한다.또한 운동으로 인한 산소 공급 제한이 되면, Red Blood Cell (이하 RBC) 의 O2 운반 능력 및 RBC에서의 대사과정이 변화하는데, 이에 관여하는 것이 2.3-diphosphglycerate (이하 2,3-DPG)이다.2,3-DPG는 hemoglobin (이하 Hb)의 O2 affinity를 감소시켜 조직으로의 O2 공급을 증가시킨다.이 실험의 목적은 신체 환경의 변화(안정시, 운동시, 회복시)에 따른 혈중 lactate와 2,3-DPG 농도를 측정하여 이들이 신체에 미치는 효과를 이해하고, 두 factor 간의 관계를 고찰해 보는데 있다.Ⅱ. ApparatusA. 혈중 Lactate 측정 실험① Lactate Analyzer(YSI 23ℓ MODEL)② YSI 2357 buffer, 증류수③ Heparinized capillary tube④ Finger tip needle⑤ Standard 5 mmol 용액⑥ Dosposal box⑦ Beaker⑧ 알콜솜Lactate Analyzer(YSI 23ℓ MODEL)B. 혈중 2,3-DPG 측정 실험① Reagents. NADH, Catalog No. 340-101: Nicotinamide adenine dinucleotide. TRIETHANOLAMINE BUFFER SOLUTION, Catalog No. 665-5. ADENOSINE-5'-TRIPHOSPHATE, Catalog No. 35-5. GAPDected △A = △A - 0.030Blood 2,3 DPG (μ㏖/㎖) = △A 7.7※ Factor 구하기2.99 / (6.22 0.0625) = 7.72.99 = Volume (㎖) of reaction mixture in cuvet6.22 = absorbance at 340㎚ of a 1μ㏖-NADH/㎖ solution0.0625 = Volume (㎖) of original sample in reaction mixtureⅣ. ResultA. LactateTable 1. Lactate concentration according to blood sample type and physical state.(단위:mmol/L)ObjectStateBlood sample typeFinger tipwhole bloodserumplasma최성호안정시1.821.093.692.33운동시5.559.347.31회복시1.982.852.08황진환안정시1.610.913.662.61운동시5.9711.039.05회복시1.522.561.73최범렬안정시1.481.765.132.97운동시8.3115.329.21회복시3.544.684.36Figure 1. Individual lactate concentrationFigure 2. Lactate mean valueWhole bloodserumplasma안정시1.254.162.64운동시6.6111.908.52회복시2.353.362.72Figure 3. Lactate concentration according to blood sample type in stable state.B. 2.3-DPGTable 2. OD value of initial A and final A and blood level of 2,3-DPGObjectStateOD(optical density)BloodInitial AFinal A2,3-DPG(μmol/L)최성호안정시0.7130.3122.854운동시0.6590.3132.435회복시0.7460.3312.965황진환안정시0.64ctate shuttle system을 통해 interstitial fluid로 이동된다. Whole blood에서 lactate는 RBC와 plasma에서 모두 볼 수 있으며 운동중인 경우 lactate와 수소 이온은 plasma에서 RBC로 동시에 이동되며 이것은 plasma와 interstitial fluid 간의 구배차이와 운동중인 muscle로부터 나오는 lactate와 수소 이온의 efflux를 위한 공간의 확장을 통해 증진 될 수 있다. 운동중인 근육에서 생성된 lactate와 수소 이온은 blood를 통해 liver, heart와 inactive muscle등으로 운반된다. Whole blood 내의 lactate양은 근육에서 나오는 lactate와 lactate를 저장하는 다양한 공간으로의 이동을 통한 제거와 분배를 통해 균형을 이룬다. 휴식기에는 plasma와 intraerythrocyte compartment간의 lactate간의 배열은 일정하지 않다. 즉 전혈내의 총 lactate양의 1/3은 RBC에 , 나머지 2/3는 plasma에 배치되어 있다. 이것은 RBC내의 Hb이 약간의 negative charge를 띠고 있으며 따라서 chloride, bicarbonate, lactate같이 negative ion인 경우 RBC보다는 plasma에 더 많은 양이 존재하며 반면에 수소이온 같은 positive ion은 RBC내에 더 많이 존재한다. 운동 중에 생성된 lactate는 근육에서부터 plasma phase를 거쳐 RBC로 이동되며 이것은 monocarboxylate-specific carrier mechanism을 통해 이루어진다. 여러 실험 결과를 통해, 극단 적인 운동 중 blood내의 lactate transport에 의해 plasma로 유리되는 lactate의 양은 RBC로 들어가는 양에 비례한다. 그 결과 RBC내의 lactate와 plasma의 lactate는 평형을 이루게 되고 이것은 plasma와 RBC간에 lacta정상의 glycolysis 중 phosphoglycerate kinase에 의한 ATP 생성과정을 우회하게 된다.2) 이 shunt를 살펴보면,Bisphosphoglycerate mutase 와 2,3-bisphosphoglyceratephosphatase 에 의한 두 가지 비가역적 반응으로 구성되어 있으며 과정 중 high-energy phosphate가 유리되므로 결국 net-ATP 는 zero 가 된다.3-phosphoglycerate는 bisphosphoglycerate mutase를 자극하고2,3-DPG 생산을 자극함으로서 전체 shunt 가 조절이 되며, product 인 2,3-DPG는 negative feedback 에 의해 혈액내 일정량이 유지되게 된다.3) 그러면 왜 이 기전이 존재하는 것일까?예를 들어, 운동으로 체내 O2가 부족하게 되면 조직에서의 O2 요구량이 증가하게 되고 oxygenized hemoglobin 의 조직으로의 O2 unloading에 대한 요구가 커지게 된다. 즉 Hb의 O2에 대한 affinity 감소가 필요하게 되는 것인데, 바로 이 affinity를 감소시키는 역할을 하는 것이 2,3-DPG 이다. 따라서 더 많은 2,3-DPG를 생성하기 위해 적혈구는 ATP 생산 대신 우회로를 선택하여 2,3-DPG의 생산량을 높이게 된다.4) 어떻게 2,3-DPG 는 hemoglobin 과 산소간의 affinity를 감소시키는 것일까?2,3-DPG는 negative allosteric effector로서 Hb가 O2가 안 붙어 있는 deoxygenated configuration(T-state) 일 때 pocket 이라 하는 β chain 사이에 위치하게 된다. 이러한 pocket에는 positive charge 를 가진 아미노산이 있어 negative charge 를 가진 2,3-DPG의 phosphate와 결합하여 salts를 형성하고, 결국 β chain과 교차결합(cross-linking)한다.그 결과 T-state의 증가한다.11) 갑작스런 운동이 2,3-DPG의 농도에 미치는 효과는 어떨까?운동을 함에 따라 조직에서의 O2 요구량이 높아지기 때문에 Hb의 O2 affinity를 감소시키기 위해 2,3-DPG 의 이용이 늘어날 것이다. 운동이 격해져 hypoxia 상태가 된다면, RBC의 2,3-DPG shunt 에 의해 2,3-DPG의 생산이 증가될 것이나, 조직으로의 빠른 O2 공급을 위해 Hb과 결합하는 2,3-DPG의 양이 훨씬 많기 때문에 결과적으로 plasma 내의 2,3-DPG 농도는 감소하게 될 것이다.운동이 끝난 후 회복기에 들어서면 조직의 O2 요구량은 점차 줄어들 것이며, 따라서 2,3-DPG 의 농도는 운동 전의 정상의 수치 또는 그 이상으로 증가할 것이다.이러한 2,3-DPG 의 농도변화 여부를 확인하기 위해 우리는 다음과 같은 실험을 하였다.5분간의 Havard step test를 수행 후, 운동 전 (안정시), 운동 직후 (운동시), 운동 30분 후 (회복시)에 2,3-DPG의 양을 측정하였다.본 실험의 결과를 살펴보면 위에서 언급한 대로 운동직 후 2,3-DPG의 농도는 상당히 감소되어 있었으며 시간이 흐르며 원래 운동전의 수치로증가함을 알 수 있었다. (Fig. 4, 5) 흥미로웠던 점은 평소 운동을 열심히 하던 '최성호(M, 24세)' 의 3-DPG의 변화량의 폭이 적고 30분 안에 원래의 수치로 돌아왔음에 반해, 평소 운동량이 적은 '최범렬(M, 29세)' 경우2,3-DPG 의 감소 후 정상치의 수치로 돌아오는 데 시간이 걸렸다.2,3-DPG 의 변화량을 직접 잴 수 없으므로 다음과 같은 절차가 필요했다.12) 2,3-DPG 정량법위 실험에서 우리는 여러 가지 시약과 효소를 첨가하고, 2회의 흡광도를 측정한 후 일정 수식에 대입하여 2,3-DPG를 측정하였다. 이러한 과정에 대한 고찰을 해보면,이 방법은 Lowry가 고안한 효소법으로서 NADH가 340nm에서 최대 흡광도 (OD: optical density) 를 보이는 반면 NAD+는한다.

의/약학| 2003.10.08| 28페이지| 1,000원| 조회(576)

Lactate, lactic acid, 산소해리, 2, 3-BPG, 2, 3-DPG

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적혈구 & 백혈구 cell count 평가A좋아요

I. Purpose세포는 생명을 유지하고 기능을 발휘하기 위해서 필요한 물질들을 공급받고 필요하지 않은 물질은 제거하여야 한다. 세포의 물질교환은 주위환경인 간질액과의 사이에서 이루어지므로 간질액은 세포에게 적절한 환경을 유지하고 있어야 한다. 심장의 펌프작용을 바탕으로 혈관 내를 순환하면서 간질액과의 사이에 물질들을 교환하는 매체가 혈액이다. 혈액은 적혈구(이하 RBC), 백혈구(이하 WBC), 혈소판(이하 Platelet) 등의 세포 또는 고형성분과 이들이 보유하고 있는 액체성분, 즉 세포외액의 일부인 혈장으로 구성되어 있다.이들 혈액의 구성성분들의 수치는 정상시에는 일정 범위 안에 있지만 신체에 이상이 생기면 그 수치가 많아지거나 적어지는 등의 이상현상이 나타난다. 따라서 혈액에 관한 소견은 임상진단에 매우 중요하다.이 실험의 목적은 측정원리를 이해하고, hemacytometer를 이용하여 적혈구와 백혈구의 수를 측정해보는 데 있다.II. Apparatus1. 적혈구 수의 계산① 혈액 sample② Haemacytometer (0.0025㎟, depth 0.100㎜)③ Counter④ Hayem 용액 : 0.86 NaCl⑤ 70% Ethanol⑥ 헤파린 나트륨 (1방울)⑦ Beaker⑧ Tourniquet, 주사기⑨ 혈액 희석용 melangeur⑩ Cover glass⑪ 광학현미경2. 백혈구 수의 계산① 혈액 sample② Haemacytometer (0.0025㎟, depth 0.100㎜)③ Counter④ Turk solution : 2% acetic acid⑤ 70% Ethanol⑥ 헤파린 나트륨 (1방울)⑦ Beaker⑧ Tourniquet, 주사기⑨ 혈액 희석용 melangeur⑩ Cover glass⑪ 광학현미경III. Procedure1. 적혈구 수의 계산먼저 혈액을 2㎖정도 뽑고(적혈구 및 백혈구 계산을 2~3번 반복하기 위해 많이 뽑음), 응고를 막기 위해 1 방울의 헤파린 처리를 한다.혈구 측정기는 두꺼운 유리판에 가로 세로 1mm 폭으로 닦아낸다. 이때 소독솜이 melangeur의 중앙 모세관에 닿게 되면 모세관 현상으로 안의 혈액이 빨려나오기 때문에 주의하여야 한다. 0.5의 눈금까지 혈액이 담겨 있는 melangeur에 0.86 NaCl을 팽대부 위쪽의 101이라는 눈금까지 정확하게 더 빨아들인다. 용액이 101의 눈금까지 정확히 오면 혀 끝으로 고무관의 끝을 막고 인지와 엄지로 melangeur의 양끝을 막고 1~2분 동안 서서히 흔들어 혈액과 희석액이 잘 혼합되도록 한다. 이 과정을 통해 혈액은 200배로 희석이 된다. 혈액이나 희석액을 빨아올리는 과정에서 정해진 눈금 이상으로 빨아올렸거나 공기를 함께 빨아올렸을 때에는 그 실험을 중단하고 melangeur을 다시 씻어 건조시킨 후 처음부터 실험을 다시 한다.Haemacytometer 은 가운데에 세로로 4개의 깊은 홈과 가운데 2개의 홈 사이에 가로로 홈이 새겨져 있다. Haemacytometer의 중앙 평평한 곳 상하에는 혈구를 세기에 편리하도록 구획이 되어 있다. 그 구획은 1㎟를 가로 세로로 구획하여 25개의 정방형으로 나누어 놓았으며 한 개의 정방형은 다시 16개의 작은 정방형으로 구획되어 있다. 이 구획 위에 cover glass를 놓으면 Haemacytometer와 cover glass 사이에는 0.1mm의 공간이 생긴다. 이 공간에 melangeur를 수직으로 잡은 후 처음 나오는 한 두방울의 희석된 혈액은 버리고 끝을 공간에 살짝 대면 혈액이 스며들게 된다.이 후 Haemacytometer를 약 3분동안 방치하면 혈구가 Haema-cytometer의 바닥에 정착하게 되므로 혈구 계산이 용이하게 된다.준비된 Haemacytometer를 현미경의 재물대 위에 올려놓고 400배의 최대확대로 작은 정방형 구획 속에 있는 혈구를 센다. 25개의 정방형 구획을 다 세어야 하나 시간이 너무 걸리기 때문에 R자들이 씌여있는, 즉 25개 정방형 구획들 중 5개만을 센다. 이는 16×5=80개의 작은 정방형 구획의 혈구만을 센 결과가 문에 5를 곱한다.2. 백혈구 수의 계산백혈구 계산 실험은 적혈구 계산 실험과 거의 같으나 희석액, 희석배수 및 정방형 구획수가 다를 뿐이다.백혈구 희석용 melangeur은 유리관 중간의 팽대부가 적혈구 희석용 melangeur보다 더 작고 안에 하얀 유리알이 들어 있으며 그 위에 11이란 눈금이 있다. 채혈시에 혈액은 melanguer의 1.0이라고 새겨진 눈금까지 정확히 빨아들인 후, 2% acetic acid 를 눈금 11까지 빨아들여 잘 섞이도록 흔들어 준다. 이렇게 하면 혈액은 10배로 희석된다. 이때 적혈구는 희석액의 acetic acid로 인해 용혈되어 현미경하에서 보이지 않게 되고, 백혈구는 핵이 청색으로 염색이 된다.적혈구 계산시와 동일하게 cover glass가 놓여져 있는 Haemacytometer에 희석된 혈액이 스며들게 하고, 확대배율 100배의 현미경으로 Haemacytometer를 관찰하면 중앙에 적혈구 계산용 구획이 보이고 그 주위에 25개 구획이 4개 보인다. 그 4개 구획속의 백혈구를 모두 센다. 얻은 총 백혈구수를 4로 나눈 평균값을 이용하여 다음 공식에 적용하여 계산하면 된다.백혈구 수/㎣ = 4개의 구획에 있는 백혈구 수 × 1/4 × 10 × 104개의 구획 내에 있는 백혈구 수를 셈한 평균치에 희석배수 10과 Haemacytometer 표면과 cover glass간의 거리 보정치 10을 곱하면 백혈구 수의 실측치가 된다.IV. Results1. 적혈구 수구 분Haemacytometer에서의 개수적 혈 구 수 (million/㎣)남여정 상 치·약 5.00약 4.50최 범 렬537개5.37·최 성 호436개4.36·최 윤 정455개·4.55함 지 선340개·3.40황 진 환505개5.05·※5개 중방내 있는 적혈구 수 × 5 × 10 × 2002. 백혈구 수구 분Haemacytometer에서의 개수백 혈 구 수 (개/㎣)남여정 상 치·약4,000~10,000약4,000~10,000최 범 렬210개5250·최 성 호153개lobulin4.5g/dℓclotting factor(주로 fibrinogen)0.3g/dℓCellular componentsRBC4.2~6.2million/㎣WBC(7,000~10,000/㎣)LymphocyteWBC count의20%~25%Monocyte &macrophage3%~8%Eosinophil2%~4%Neutrophil60%~70%Basophil1% 미만Platelet140,000~340,000/㎣성인은 평균 5ℓ의 혈액을 가지고 있으며 이는 체중의 약 8%를 차지한다. 혈액의 구성성분은 크게 plasma, plasma protein, cellular components로 이루어진다. Plasma는 전체 혈액의 50~55%를 차지하며 이중 93%가 물이다. Plasma protein은 albumin, globulin, clotting factor가 있으며 cellular components로는 RBC, WBC, platelet이 있다.2. RBC1) 개 요RBC는 혈액에서 가장 많은 부피를 차지하는 세포이다. 성인 남자에서 약 48%, 여자에서는 약 42%의 부피를 차지한다. RBC의 cytoplasm은 solution containing protein인 hemoglobin과 RBC의 plasma membrane을 통해 diffusion을 조절하는 electrolyte로 구성되어 있다. 성숙한 RBC는 핵과 세포내 소기관이 없으므로 mitotic division을 하지 못한다. 대략 120일을 살면서 기능을 수행한 후 파괴된다.2) 모양, 크기적혈구의 모양과 크기는 주기능인 gas 운반을 위해 가장 이상적인 모습을 띠고 있다.1 Biconcavity납작하고 biconcave한 모양은 표면적과 부피의 비율을 gas diffusion하기에 가장 적절하도록 만들어 준다.2 Reversible deformabilityReversible deformity는 RBC가 직경이 좁은 모세혈관을 지나갈 때 모양이 변한 후에도 다시 원래의 모습을 회복할 수 있도록 한하게 된다. 이 상태의 cell을 basophilic erythrobast라고 한다. 이후 세포는 점점 작아지고 hemoglobin을 생산하기 시작하면서 세포질은 basic stain과 eosin stain에 모두 친화성을 보이며 이 상태의 세포를 polychromatophilic erythroblast라고 한다. 결국 세포질은 점점 더 eosiniphlic해지고 orthochromatic erythroblast라고 한다. 이 orthochromatic erythrobast는 핵을 외부로 방출하고 circulation에 참여하면서 reticulocyte가 된다. 이 상태의 세포는 poly ribosomes의 reticular networks를 가지기 때문에 이름이 붙여졌다. 마지막으로 reticulocyte가 polyribosome을 잃게 되면서 성숙한 erythrocyte가 된다.proerythroblast basophilic erythroblastpolychromatophilic erythroblast orthochromatic erythroblastreticulocyte erythrocyte4) 정상수치RBC는 남성이 4.5~5.9×106개/㎕ 여성이 4.1~5.1×106개/㎕ 이다.이 수치는 평균치로서 대략 1백만 정도의 차이는 있을 수 있다. 우리 몸 안의 모든 적혈구를 면적으로 합산하면 무려 약 3,500 ㎡가 된다.3. WBC (Leukocyte)1) WBC의 종류와 형태를 알아보자.WBC는 hemoglobin과 같은 색소 성분이 없는 세포로서, 형태학적으로 구분하기 위해서 특수한 염색을 사용하여 관찰한다.WBC는 크게 granulocyte (과립구)와 agranulocyte (무과립구)로 분류되어 지고, 각각의 종류는 다음의 표로 정리할 수 있다.Granulocyte는 세포질에 specific granule과 azurophilic granule을 갖는 것으로서 neutrophil, eosinophil, basophil 이 있고, agranuloc0

의/약학| 2003.10.08| 34페이지| 2,000원| 조회(4,103)

적혈구, 백혈구, Cell count, 혈구 계산

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