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[생물공학실험] 미생물 무균조작법 평가B괜찮아요

제 1장 미생물 무균조작법1. 실험목적순수배양을 위한 무균조작법을 익힌다.2. 실험원리1. 멸균(Sterilization)ㅇ 멸균의 의미는 특정요기나 기구 및 배지등에 존재하는 모든 (미)생물을 죽어거나 제거하는 것이다. 세포배양액에는 많은 종류의 영양소가 포함되어 있으므로 이 속에 미생물이 있으면 이들이 급속히 증식하여 양분을 소모하고 유독 물질을 내어서 배양세포를죽여버린다. 따라서 멸균방법이 대단히 중요한 의미를 가진다.ㅇ 그러면 멸균에 대해 알아보기 전에, 미생물(세균)이 증식하는데 필요한 요소가 어떤것이 있는지 알아보겠다.ㅇ 미생물 증식 요건은 크게 물리적 요인과 화학적 요인으로 나누어 볼 수 있다.1. 물리적 요인- 습도(moist) : 대부분 세균의 배지나 숙주동물은 충분한 수분을 함유하고 있으므로 그런 경우엔 충분한 습도가 제공된다. 건조상태에서 세균은 사멸하기도 하지만대부분의 세균은 대사하지 않은 상태로 생존하여 수분이 공급되면 다시 증식한다.단, 진균류는 수분량이 적은 건조한 상태에서도 증식이 가능하다.- 온도(temperature) : 세균 증식에는 적당한 온도가 요구되는데 이것은 세균마다다르다. 세균증식이 가능한 최고온도와 최저오도의 범위를 증식 가능 온도라고하고 그중 증식하기 가장 적합한 온도를 최저발육온도(지적온도,)라고 한다. 지적온도는 균종에 따라 다르다.- 수소이온농도(ph) : 세균증식에 적합한 수소이온농도를 지적 수소 이온 농도라고하는데 보통 ph 6.0∼8.0의 범위이다.- 산소(Oxygen)- 이산화탄소(carbon dioxide) : 모든 세균의 증식에 필수적인 것이지만 대게는 유기산의 분해대사때 균자체에 의해 생산되는 양으로 충분하다.- 삼투압 : 세균의 세포질은 일정한 삼투압을 가지고 있어서 외계의 삼투압이 높거나 낮으면 용균되어 사멸한다. 그러나 세균의 증식에는 외부환경의 삼투압을 엄밀하게 조정할 필요는 없다. 그런데 어떤 세균은 증식에 높은 염도를 필요로 하는데이를 호염균이라고 한다.2. 화학적 요인- 탄소원과 에너 대상물을 넣을 때 용액이 든 경우를 제외하고는 수증기보다 무거운공기가 아랫방향으로 빠져나갈 수 있게 넣는다.- 용기속 액체의 양은 가급적 적게하여 멸균온도에 도달하는 시간을 길게 가지않도록 한다. 멸균시간의 단축을 위해서는 미리 데워진 멸균대상물을 멸균기에넣으면 좋고, 배지는 미리 중탕하여 액상으로 만든 후 멸균기에 넣어 멸균하는것이 좋다.습윤멸균에는 자비소독법과 고압증기멸균법이 있다.a. 자비소독 : 주사기,가위,핀셋 등의 소독에 쓰이며 소독기속의 비등수(끓는물)중 에서 약 15분간 자비하면 충분하다.b 증기멸균 : 포화수증기로 멸균하는 방법인데 주로 배지의 멸균에 쓰이며 가 압할 때와 가압하지 않을 때의 경우가 있다.가압멸균에는 고압증기멸균기를 써서 120℃에서 15~20분간 멸균 한다. 이 방법으 로 아포까지 사멸시킨다. 배지중에 포도당과 같이 고온으로 파괴되거나 또는 변성 을 일으키는 성분이 들어있을 경우에는 코호의 상압증기솥으로 간헐멸균한다.2. 건열 멸균 : 습윤 멸균 처리가 곤란한 유지, 윤활유, 석유등의 광유, 왁스, 분말등과 유리기구, 주사바늘, 금속기구 등의 멸균에 사용. 습윤멸균보다 효율이 낮고,더 고온, 장시간이 요구된다.3. 여과법 :- 액체 : 압착유리가류, 여과판, 밀리포아 여과막 등을 사용하여 멸균- 기체 : 섬유성 물질이 적정 밀도로 채워진 관을 사용(물기에 젖지 않으면 효율 높음)4. 가스 멸균법 : 열에 약한 플라스틱 제품 등을 멸균할 때 사용5. 빛 처리법 : 감마선, 가속전자, 자외선등을 이용하며, 병원기구, 항생제등의 멸균에 사용하지만, 각종 안전장치가 필요하고 비용이 많이 드는 단점을 가지고 있다.무균조작실, 수술실,식품저장고, 병원등에서 널리 쓰인다. 저전압수은램프(자외선)를 써서 살균력량 최강의 2600~2800Å의 파장을 방사시켜 멸균한다. 이 방법의 결 점은 살균작용이 표면적이고 내부에 침투하지 않는 것이다.※ 기구세척과 멸균 : 최근의 조직배양 추세로는 플라스틱 기구의 사용으로 세척멸균의 문제가 많이 없어졌으고 성장도 정지하게되는 시기특징 : s형-콜로니의 주변이 매끄러운 표면이 부풀어 오른 것r형-콜로니의 주변이나 표면에 거칠고 부풀어오르지 않은 것- 제2차 콜로니 : 성장이 일단 정지한 콜로니도 확산에 의하여 약간 떨어진 부분에서영양이 보급되고 축적된 유해대사산물이 확산하게 되면 콜로니의 내부나 주변부에서 증식이 재게됨- 제3차 콜로니 : 콜로니가 상당히 오래 되어 성장이 완전히 정지된 후에도 간혹콜로니의 일부에서 불규칙적인 분열이 시작되는 것!!ㅇ 이제 배양에 대해서 자세히 알아보도록 하자.세균의 배양에는 일반적으로 배양기(incubator)를 사용하지만 호기성균, 통성혐기성균, 혐기성균에서는 배양방법이 다르다.○ 호기성 배양법(호기성균, 통성혐기성균의 배양방법)이것은 배지를 배양기 속에 넣어 두는 것만으로도 충분하다. 액체배양인 경우에는 산소를 충분히 공급하는 반응으로 진탕 또는 통기배양을 하는 경우가 있다.○ 탄산가스배양법임균, 수막염균 등 고농도의 이산화탄소를 필요로 하는 균의 배양에는 촛불배양법(candle jar method)을 사용한다. 이것은 유리로 된 jar 속에 고형배지와 함께 초를 넣은 후 초에 불을 붙인 다음 파라핀으로 뚜껑을 덥고 밀폐하여 불이 꺼진 상태에서 배양하는 방법이다.○ 혐기성배양법(혐기성균의 배양방법)배지의 산화환원전위를 낮추기 위해 cysteine, thioglycollate, liver broth 등의 환원제를 배지에 첨가한다. 또한 무산소의 환경을 만들기 위해서는 혐기성 jar를 흔히 사용한다. jar 속의 산소제거는 jar 속의 산소를 진공 pump로 흡입하여 제거한 다음 탄산가스, 수소가스, 질소가스로 치환하는 방법(가스 치환법), 화학반응으로 산소를 제거하는 방법(gas pak법)등이 있다. 특히 엄밀한 혐기배양법으로서는 roll tube법, 혐기성 globe box법이 있다.미생물의 배양에는 크게 분리배양과 순수배양이 있다. 배양온도는 일반적으로 균류와효모류는 25-30℃, 세균류는 37℃ 방선균류는 27℃이며 보것을 말하며멸균된 한천 배지위에 백금이로 여러가지 형태로 선을 그어 생성된 colony를관찰하는 것이다. streaking의 방법에는 4분원 도말 방법, 방사 도말 방법, 3분원도말 방법, 연속도말법, 2분원 도말 방법 등이 있다. 균액이 많고 적음에 관계없이 독립된 순수배양 집락을 얻기 위한 가장 기본적인 방법으로 일반적으로 가장 유용한 방법이다.시험균액 1백금이 량을 평판 한쪽에 접종하고 한쪽에 고루 바른다. 백금이를분젠버너 불꽃으로 화염멸균한 후 1차 접종부위를 2-3회 지나가게 하면서 2차도말을 한다. 이 때 2차 도말부위는 1차 도말부위보다 세균수가 감소하게 된다.마찬가지로 백금이를 다시 화염멸균한 후 2차 도말 부위를 2-3회 자나가게하면서 3차 도말을 한다. 이 부위는 2차 도말 부위보다 균수가 감소하게 된다.다시 백금이를 화염멸균한 후 4차 도말부위를 도말하면 1차 도말부위보다 균수는 월등히 감소하게 되어 독립된 순수배양집락을 얻을 수 있다. 따라서 이 때생성된 집락은 집락의 특성을 완벽하게 관찰할 수 있게 된다. 이렇게 이런 과정을 여러번 반복함으로써 순수한 균을 얻을 수 있게 된다. 이렇게 하는 방법을도말평판법이라고 한다.b. 주입 평판법 (Pour plate method, Loop dilution)백금이로 균체를 취하여 배양액에 차례로 희석하면서 접종하는 방법을 하며,별다른 기술을 요하지 않아도 좋은 결과를 얻을 수 있다.c. 분리 균주의 검색도말 평판법 혹은 주입평판법으로 24∼48시간 배양한 고체 배지의 표면을 자세히 관찰해 보면, 여러 가지 색깔의 콜로니(colony)를 확인할 수 있다.(여러미생물의 분류의 경우)그러면, 각각의 특징적인 콜로니를 따서 nutrient agar의사면 배지, 혹은 액체 배지가 마련된 시험관에 접종시켜 계대배양 을 한다.37 C 에서 24시간 정도의 계대배양을 한 후에 배양 세균을 시험관에서 따서슬라이드에 도말시 킨 후 염색 방법의 하나를 택하여 순수한 단일종의 세균인가아닌가를 확인하는 과정을 거친다.3. 지는 특성에 따라 여러 가지로 분류된다. 특성에 따라 분류해 보도록 하겠다.( 물리적 특성, 배지의 성분, 사용 목적 )1. 물리적 특성에 따라- 액체배지(liquid medium) : 한천을 첨가하지 않고 액체 그대로 된 배지.시험관이나 플라스크에 넣어 사용한다. nutrient borth, brain heart infusion broth등이 있다. 이 배지는 세균을 증식시키는 배지로 적당하며, 그 외 세균의 성상검사및 대사산물을 얻는데 적당하다.- 고형배지(solid medium) : 액체배지에 보통 한천을 1.5% 가하여 고형으로 만든것으로 nutrient agar, blood agar 등이 있다. 어느 용기에 넣어 굳히느냐에 따라평판배지, 고층배지, 사면배지, 반사면배지가 있다. 평판배지는 페트리접시(petridish)에 넣어 굳힌 것으로 세균의 분리배양 집락관찰에 이용될 수 있고 고층배지는 시험관에 넣어 똑바로 세워 굳힌 것으로 균주보존 및 세균의 성상검사에 이용되며 사면배지, 반사면배지는 비스듬히 굳힌 것으로 사면배지는 세균의 증식, 보존에, 반사면배지는 세균의 성상검사에 이용된다.한천을 0.03%∼0.75%정도 가한 배지는 반 유동배지로 균주의 보존에 이용된다.여기서 위의 고형배지에서 언급했던 한천(agar)에 대하여 알아보도록 하겠다.● 참고사항 : 한천(AGAR) 에 대하여ㅇ분자량 : 13.03ㅇ특 징 : 유백색의 세말 혹은 끈상. 냉수에 녹지 않지만 서서히 물을 흡수하여 팽창(팽윤)한다. 뜨거운 물(熱水)에 쉽게 녹으며, 1∼2%의 열수용액을 냉각하면 반투명한 젤리상태로응고한다.ㅇ용 도 : 미생물 배지, 제과원료등ㅇ추 출 : 원조를 세정해 비등수로 추출해 얻어지는 점성 용액으로 알콜을 가해서 침전시킨다.그 후 가온용액을 냉각해서 얻어지는 젤을 동결융해를 반복해 정제한다.ㅇ기 타 : 해조류의 우뭇가사리과, 강리과, 그외에 함유되어 었다2. 배지의 성분에 따라- 자연배지(복합배지) : 육즙, 효모추출액, 등 화학적 성상이 분명하지 않은 천연물질 .

자연과학| 2003.04.17| 11페이지| 1,000원| 조회(1,514)

미생물, 배지, 멸균, 배양, 고체평판

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