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[미생물] 혼합평판 배양법에 의한 미생물의 순수분리 평가A+최고예요

1.실험 원리 및 목적1)원리자연계에는 수없이 많은 종류의 미생물이 혼재해 있다. 따라서 어느 특정의 균군을 얻고자 할 경우에는 어떤 선택 조건하에서 순수분리 조작을 행하여야 한다.즉, 미생물의 종류에 따라 영양요구성이 다른 점을 이용하여 어느 특정의 생리적 성질을 가지는 균을 선택적으로 증식시키는 원리를 이용한다.2)목적본 실험에서는 요구루트를 시료로 사용하여 시료 중에 가장 많은 수가 존재하는 미생물인 유산균을 분리 해 내기 위해 혼합평판 법을 사용하고 선택배지로서는 유산균의 영양요구성을 충족시키는 BCP배지를 이용한다.2.실험 재료1) 시료:불가리스2) 백금이: 지름 0.7㎜～0.8㎜ 정도의 백금선이나 니크롬선을 자루에 꽃아 끝을 둥글게 해서 사용하는 접종기구로 효모나 세균의 이식 및 배양에 사용3) 백금선: 끝을 구부리지 않고 직건으로 된 접종기구로서 곰팡이류의 포자 접종, 천자배야에 이용4) 시험관: 배지의 분주, 균의 액체배양, 한천 사면배양 등에 사용5) 페트리 디쉬: 미생물의 평판배양에 이용6) 항온배양기 (Incubator): 일정한 온도를 유지시켜 미생물을 정치배양하는 기구로 항온기 내부에 온도 조절룔 바이메탈이 붙어 있어 온도조절이 가능하며 온도 오차는 ±1℃로 정확해야 한다.7) 무균상자(Clean bench): 앞면이 유리로 되어 있고 자외선 등이 설치된 것으로 균의 분리, 접종, 이식, 조작에 사용되는 기구로 사용시에 Clean beanch 내에 70% 알코올을 분무하여 20～30분간 밀폐한 후 무균상태가 되면 사용한다. 사용하지 않을시 항상 자외선(UV) 멸균등을 켜 둔다.8) 알콜램프: 화염으로 미생물 오염 방지9) 고압멸균기(Autoclave): 포자를 가진 미생물을 고온, 고압에서 멸균하는 기구로써 널리 사용된다.보통 121℃, 15분, 1기압의 조건하에서 사용10) 건열멸균기 (Dry oven): 시험관이나 삼각플라스크 등 초자기구의 멸균에 사용11) 천칭(Balance): 시약이나 배지를 칭량하는 정밀기구 사용시 천칭을 깨끗하게 사용하고 최대칭량 이상으로 무거운 물체를 칭량해서는 안된다. 사용후에는 부드러운 붓으로 내부를 깨끗이 한 다음 덮개를 씌워둔다.3.실험 방법혼합 평판배양법에 의한 세균수 측정은 전세계적으로 가장 널리 이용되고 있으며, 일정한 배수로 희석된 시료를 배지에 접종하여 30℃에서 72시간 정도 배양했 을때 집락형성단위(colony forming unit)를 계산함으로써 시료중의 유상균수를 측정하는 방법으로서 그 순서는 다음과 같다.[혼합 평판 배양법 모식도]1) BCP 배지를 조성 성분표에 따라 필요량과 증류수 100ml을 삼각플라스크에 넣은 다음 잘 용해시켜 121℃에서 15분간 고압 멸균한 후 44∼46℃ 되게 조정한 항온수조에 보관한다.2) 멸균된 5개의 시험관에 희석용 멸균 증류수를 피펫으로 9ml씩 균등하게 분주한다.3) 시료인 요구르트에서 1ml를 취하여 5개 시험관 각각에 접종하여 10배 계단희석법 으로 희석한다.4) 희석된 시료는 5ml 피펫으로과각각의 희석배수당 멸균 페트리디쉬 2매에 1ml씩을 가한다.5) 각 페트리디쉬에 항온수조에 보관해 두었던 BCP배지를 꺼내 20ml씩을 분주하여 혼합한 다음 정치하여 굳히며 혼합시 배지가 뚜껑에 묻지 않도록 특히 주의한다.6) BCP배지가 완전히 굳은 후 (약 5∼10분 경과후) 37℃ 항온기에서 약 72시간동안 뒤집어서 배양 한다.7) 배양이 끝난 후 관찰 해 보았을 때, 집락은 충분히 떨어져 있고 1매의 집락수가 10∼30개의 집락을 형성한 페트리 디쉬인희석한것만 2매를 선택한다.8) 각 페트리 디쉬에서 1ml을 MRS 배지에 천자배양법으로 접종한다. 이 때백금이는 화염멸균후 시험관에 넣어 식힌 후 사용하며 접종시 백금이가 시험관에 닿지 않게 주의한다.9) 항온기에서 37℃ 로 2~3일간 배양한 후에 관찰 한다.4.실험 결과1) BCP배지 접종후 배양위 실험방법 6) 까지 시행 후 유산균을 접종한 BCP 배지를 살펴 보았다.,희석한 것을 각각 2매씩 배양 하였는데희석한 것만 집락형성이 관찰되어 졌다. 색은 황색은 아니였으며, 황색보다 약간 어둔운 색 이었다. 나머지 희석배수의 페트리 접시에서는 아무것도 나타나지 않거나 혹은 커다란 원 모양의 물질이 생긴 것이 보였다.2) MRS배지 접종후 배양72시간 후 관찰 해 보았는데 유산균을 접종한 부분에 일직선으로 고층배지를 관통하고 있는 모습이 관찰 되어졌다. 맨 윗부분에는 조그마한 원형 모양의 물질들이 먼지가 낀 것처럼 묻어 있었다.[MRS 배지 접종시에는 천자배양으로한다.]5.고 찰1) 배지조성 성분표위 실험에서 배지의 영양성분 조성이 잘 못 되었을 경우에 오차가 발생 할 수 있음을 가만하여 배지조성 성분을 기록한다. 0.1g의 미세한 차이라도 지켜지도록 하여 실험에서의 오차의 확률을 줄여야 한다.☞BCP배지Tryptone0.5gYeast Extract0.25gGlucose0.1gBCP0.004gAgar1.5g증류수100ml☞MRS배지Peptone10 gBeef extract10 gYeast extract5 gK2HPO42 gAmmonium citric acid2 gGlucose20 gTween 801 gSodium acetic acid5 gSalt solution5 gMgSO4.7H2O11.5 gMnSO4.2H2O52.4 gD.W.100 ㎖Distilled water1,000 ㎖2) 실험 분석(Ⅰ) 시료의 차이에 따른 오차다른조는 일반적인 ‘한국 야쿠르트‘를 사용했는데 우리 조 에서는 조금 다르게 남양유업의 ’불가리스‘를 사용했다. 이것은 즉, 두 시료간에 성분상에 차이가 있으므로 실험결과에서도 차이가 있으리라 예상 되었다. 예상대로 BCP배지에서 배양후 관찰 해 보았을때, 콜로니의 색깔이 다른조는 황색으로나타났는데 우리조는 황색보다는 어두운 색깔이 관찰되었다. 이것은 다른 세균에 의한 오염으로 나타났을 수도 있다고 생각된다. 하지만 다른조의 실험에서도 타 세균에 의해 일부 오염되었지만 황색 콜로니를 나타냈음으로 보아 시료 성분의 차이로 인한 것이라고 추정된다. 따라서 두 시료의 성분 차를 비교해 보았다.한국 야쿠르트불가리스고형분액상 발효유 3%농후 발효유8%유산균수1천만이상1억이상대장균군음성음성(Ⅱ) 페트리 디쉬를 2매씩 사용하는 이유위의 실험방법 4)에서 각각의 희석배수당 멸균 페트리디쉬 2매를 사용 하는데 그 이유는 혹시 잘못 될 수도 있는 실험상의 오차를 방지하기 위함과세균수 측정시 평균치를 얻기 위해서 이다.(Ⅲ) 실험방법 7)에서희석한 것만 2매 사용한 이유실험방법 6)까지의 실험에서 보듯이,희석액 각각 2매씩을 항온기에 널고 배양했는데 배양후 관찰 해 보니 콜로니가 발견되는건희석한 배지 뿐이었다. 이유는 유산균을 백금이로 접종시에 균이 죽었거나 배지가 유산균이 생육 할 수 없는 상태가 되었기 때문일 것으로 추정된다.(Ⅳ) 실험결과 (1)에서 배지위에 콜로니 외에 발생한 이물질항온기에서 배양후 BCP배지를 살펴보니 콜로니가 나타난 배지나, 콜로니가 나타나지 않은 배지나 모두 몇 개씩의 조금마한 원형의 곰팡이가 핀 것 같은 부분이 관찰 되어졌다. 이것은 콜로니에 비해 훨씬 커다란 구형의 모습을 하고 있으며 색깔은 약간 갈색을 띄는 듯 하였다. 즉, 이 부분은 유산균에 의한 것이 아니며 타 세균에 의해 오염된 부분으로 해석 할 수 있다.

자연과학| 2003.06.09| 6페이지| 1,000원| 조회(3,215)

미생물, 요구르트, 배지, 순수분리, 혼합평판

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