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[식물생리학] 종자를 이용한 호흡량 측정과 TTC검정 평가A+최고예요

종자를 이용한 호흡량 측정 과 TTC 검정1.서언[실험 1.2]생물이 생명활동을 유지하는 데는 에너지가 필요하다.생물은 이 에너지를 탄수화물(전분,여러종류의 당류)지방,단백질과 같은 유기물을 분해하여 얻는다. 이와같이 생물이 유기물을 분해하여 살아가는데 필요한 에너지를 얻는 작용을 호흡이라고 한다.식물의 전형적인 세포호흡은 호흡 기질로 sucrose나 전분을 분해한 6탄당의 산화이다. 호흡과정을 통하여 세포는 외부로부터 O2를 흡수하여 유기물질을 산화시킨 후 CO2를 방출하고 생명활동에 필요한 에너지를 얻으며,이와 동시에 H2O가 생성된다. 호흡기질이 완전히 산화되면 흡수된 O2의 부피는 호흡의 결과 방출되는 CO2의 부피와 동일하게 된다. 위와 같이 호흡에 흡수된 O2 부피에 대한 CO2 방출량의 비를 호흡게수(respiraty quotient)라 한다.본 실험에서는 호흡이 왕성히 일어나는 발아 중인 종자 및 수초를 이용하여 호흡과 광합성을 통한 CO2 의 흡수와 방출을 확인하고 이를 통하여 호흡과정을 이해하도록 한다.[실험 3,4]호흡은 광합성 산물이 분해되어 그 산물 속에 저장되어 있던 에너지가 유용한 에너지 형태로 전환되는 과정을 말한다. 호흡과정은 해당과정, TCA 회로, 그리고 전자전달계를 거쳐 진행되는데, 기질의 분해 과정에서 전자가 떨어져 나와 NADH에 전달되었다가 ATP의 합성에 이용된다. 전자가 떨어져 나오는 과정은 다양한 종류의 탈수소효소에 의해 촉매된다. 탈수소효소는 전자를 세포에서 발견되지 않는 twtrazolium염에도 전달하는데 이와 같은 화합물인 무색의 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 는 탈수소 효소의 작용에 의해 무색의 triphenylformazen 색소로 변한다. 따라서 식물 조직을 triphenyltetrazolium 용액에 침지하여 나타나는 붉은색의 생성정도로 조직의 탈수소 효소의 활성을 알 수 있다.본 실험에서는 종자나 전분 저장조직의 탈수소효소의 활성을 TTC검정을 이용하요 주사기로 1ml를 뽑았다.이 주사기의 앞을 고무마개로 기체가 빠져나가지 않도록 막은후 GC(gas chromatography)를 이용하여 CO2농도를 분석했다.(사용법을 잘 모르기 때문에 전문조교가 분석해주었다) 측정된 CO2농도를 이용하여 콩 종자의 호흡률을 계산했다.호흡률을 계산은 다음과 같은공식을 사용했다.- 호흡량 계산 공식(변화 CO2 % × 10) (용기의 빈 공간 (L))=mL/kg/hr(생물 생체중(kg)) (반응시간(hr))- 콩 호흡량 실험 계산 공식((30분후 CO2 % - 초기 CO2 %) × 10) (시험관 부피 - 콩부피)=mL/kg/hr(콩 생체중) (반응시간)[실험2]청색의 BTB용액에 입김을 불어넣어 원래의 BTB용액과의 색깔차이를 확인해 보았다. 그 다음 BTB용액을 4개의 시험관에 20mL씩 나누어 담았다. 시험관에 각각A,B,C,D,E,F 라벨을 붙인 후 다음과 같이 장치했다. 먼저 A시험관에는 원액을 넣고 parafilm밀봉 하고 B시험관은 입김을 불어넣은 그대로 parafilm.밀봉하여 대조군을 만들었다.C 시험관은 콩 종자 20개를 넣고 parafilm 밀봉하고 D시험관은 C시험관을 호일로 싸서 빛을 차단했다.E시험관은 물풀을 넣고 parafilm 밀봉 하고 F 시험관은 E시험관을 호일로 싸서 빛을 차단했다. 이 시험관들을 빛이 있는 곳에 30분간 놓다둔 후에 시험관내 BTB 용액의 색깔변화를 관찰했다.[실험3]TTC 검정을 통해 종자의 부위별 활력을 확인하고 자 하는 이번 실험에는 콩과 옥수수종자를 사용하였다. TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 0.1-1.0%용액 (0.05 M Na2HPO4-KH2PO4,ph7.4)을 사용하고 그 외에 핀셋 과 비이커 호일등을 사용했다.먼저 물을 흡수한 콩과 옥수수 종자 10개씩을 골라 세로로 자른 후 1%의 TTC용액에 착색 시켰다. 이때 용액과 절단면이 잘 닿도록 주의해야했다. 또한 TTC는 빛에 의해 분해되기 때문에 빛이 들어가지 않도록단에 표시되어있는 숫자는 CO2의 대기농도가 9.99%일때의 GC값이다.이 값을 표준으로 삼아 시험관 안의 CO2농도를 계산해 낼 수 있었다.사진 1. GC기계로 측정한 CO2 량의 Data(사진 2)의 하단에 표시되어 있는 숫자는 실험실 내의 CO2량의 GC값이다. 이 값은 대조구로 사용되어 여기서 나온 GC값으로 실험실의 CO2농도를 구했고 이 결과를 통해 콩 호흡으로 인한 CO2의 농도변화를 구할 수 있었다.사진2. 실험이 진행된 실험실 내의 CO2 량의 GC data아래의 사진3의 하단에 표시된 숫자가 우리 조가 실험한 시험관의 CO2에대한 GC값이다.이 값과 사진 2의 data를 이용하여 콩 호흡으로 인한 농도 변화량을 구할 수 있었다.(사진3)결과값1. 실험실 공기중의 CO2 농도CO2 9.99% : 19431 = CO2 Y % : 69Y % = 0.03547 %2. 콩 호흡 후 시험관 속의 CO2 농도CO2 9.99% : 19431 = CO2 X % : 91X % =0.04678%표준가스(9.99%)대조구결과GC결과194316991CO2농도9.990.035470.04678%표1.3. 콩 호흡량 계산(1) 콩 호흡으로 인한 농도 변화= (X - Y) % = 0.04678 % - 0.03547 % = 0.01131 %(2) 콩 호흡량 계산 (mL/kg/hr)= (0.01131x10) (0.080mL - 0.005 ) = (0.1131) (0.075)(0.005) (0.5) 0.0025= 0.00848250.0025= 3.393 mL/kg/hr = 138.773 μmole/kg/hr콩 호흡량 계산 과정을 보면 GC값을 통해 계산해낸 (1)번 계산식 에서 CO2의 농도가 0.01131%의 차이가 나는 것을 확인할 수 있는데 이 것으로 콩이 호흡을 하면서 CO2를 방출했다는 사실을 알 수가 있다. 앞에서 계산한 값과 자료에 제시된 용기와 콩의 체적의 값을 사용하여 콩의 호흡량을 계산했더니 138.773 μmole/kg/hr 이라는 값이 나왔다. 콩 의 호흡했다.시험관 C와 D는 콩 종자를 집어넣은 시험관인데 사진에서 확인되는 바와 같이 둘 다 같은 황색이었다. 시험관 E는물풀을 집어넣었는데 원래의 BTB용액 보다 더욱 진한 청색이 되어있는 것을 확인할 수 있었다. 시험관 F는 E시험관을 호일로 감싸서 빛을 차단한 시험관인데 원래의 BTB색보다 약간 연한 초록색으로 관찰되었다.(사진 4) BTB용액을 이용한 호흡과 CO2방출여부의 확인이 결과들을 분석해 보면 처음 대조군은 관찰되는 그대로 BTB는 입에서 나오는 CO2가 많이 들어가 있는 산성인 상태에서는 황색을 띤다는 것을 알 수가 있다. 또한 C와 D시험관을 처리할 때 처음에는 두 시험관의 색이 다를것이라 예상했었는데 호일을 뜯어 보니 두 시험관의 색이 같았다. 우리 조원들은 어느 하나가 더 황색이다 아니다하며 의견을 내 놓았었는데 지금 생각해보니 그때는 우리의 바람과 또 그럴것이라는 편견때문이었던 것 같다. 두 시험관은 모두 같은 황색이다. 두 시험관에 같은 수의 콩이 같은 온도상에서 같은 시간동안 호흡을 했다. 먼저 용액이 황색으로 변한 이유는 콩종자는 겉으로 보기에 노란색이다. 이는 콩 종자에 녹색을 띠는 엽록소가 없다는 것이다. 그렇기 때문에 이 콩은 광합성을 하지 않고 호흡만을 했다. 호흡을 통해 나온 CO2 가 용액을 산성으로 만들어서 황색으로 변했다.D실험관 또한 C시험관과 같은 변화가 일어났다. 다만 호일로 감싸준 것은 원래 빛을 통제하기 위함이었는데 처음부터 이 호일의 유무에 의해서 달라질 사실은 없었을 것이다.시험관 E와F는 물풀의 광합성 여부를 확인해 보기 위한 실험군인데 예상대로 물풀은 빛이 있는 E시험관에서 광합성을 하면서 산소를 내어놓았다. 이것은 BTB 용액의 색깔이 더욱 진한 청색으로 변한 것을 알 수 있다. 하지만 빛이 통제된 F시험관은 광합성을 하지 못하고 호흡만을 했는데 콩보다는 체적이 적기 때문인지 용액의 색 변화는 크게 나타나지는 않았지만 황색이 섞인듯한 맑은 초록색으로 변한 것을 통해 호흡여부를 확실히 파악할 수 있었다.지만 가장자리에 위치한 콩들은 염색이 잘 되지 않았다.사진 5. TTC용액에 착색시킨 콩 종자 (왼쪽) 와 옥수수종자(오른쪽)서언에서 밝혔듯이 TTC용액은 탈 수소효소의 활성에 의해 붉은 색을 띠게된다. 이 탈 수소 효소는 호흡과정에서 매우 유용하게 사용되는 효소이다. 이들의 활성이 있다는 것은 광합성의 산물인 전분이 위치하고 있다는 뜻이 된다. 단자엽 식물인 옥수수의 염색모양을 살펴보면 옥수수종자의 아래부분이 진하게 염색되어 있는 것을 살펴 볼 수 있는데 염색이 되지 않은 부분을 배유, 염색이 된 곳은 배 부분으로 구분할 수 있다. 옥수수에서는 경계가뚜렷하게 관찰이 되는데 이에 반해 콩의 염색된 모양을 살펴보면 청색으로 표시된 곳, 즉 배부분이 뚜렷하게 염색되어 있는 것을 볼 수 있었다. 또한 가운데 위치한 콩들은 전체적으로 염색이 되어있는 것을 관찰 할 수 있었다. 콩은 원래 배유가 없는 종자이다. 분이 존재하. 전체적으로 염색이 되어 관찰된것은 배 부분 이외에 자엽부분에도 염색이 되었다는 것이다. 콩은 원래 무배유 종자이기 때문에 배유부분이 없다. 그래서 옥수수처럼 염색이 되고 안된 뚜렷한 경계가 나타나지는 않았다. 하지만 콩안의 배 부분은 배유대신에 자엽에 양분을 저장하여 자라기 때문에 콩 전체적인 부분, 즉 자엽과 배 부분 모두 염색이 되었고 이것은 곧 콩의 전체적으로 양분으로 가득채워져 있다고 말 할 수 있다.[실험4]위의 다른 실험들과 같은 방법으로 처리한 후 확인해 본 결과 정상감자만이 붉게 변한 것을 확인 할 수 있었다. 정상감자의 실험군에서 모두 붉은색으로 색변화가 일어나지는 않았고 왼쪽 부분에 위치한 감자들이 특히 붉게 변한 것을 관찰 할 수 있었다.사진 6 정상감자(오른쪽)와 냉동감자(왼쪽) 의 TTC 검정결과효소는 적정 온도에서 활성이 증가하는데 이 활성은 0?C에서 약 40?C까지 이다. 0?C이하로 온도가 낮아지면 효소의 활동이 정지하게 된다. 나는 처음 이 감자의 색 변화를 보고 당연히 효소와의 관계라고 생각했다. 그리고 깊이 생각이다.)

자연과학| 2004.11.17| 8페이지| 1,000원| 조회(1,955)

호흡량, TTC용액, GC기계, 종자의호흡

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