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[한국의 전통사상]일본과 중국의 역사 왜곡과 해결방안

중국과 일본의 역사 왜곡과 향후 우리의 대책○ 중국의 역사 왜곡과 우리의 대책1) 중국의 역사 왜곡중국의 역사 왜곡을 보는 시각은 크게 두 가지로 나누어져 있다. 고구려사의왜곡과 동북공정 자체의 시각이다.첫째, 중국의 고구려사 왜곡에 중점을 두고 있는 것이 현재 학계와 시민단체의 주류적 시각이 아닌가 생각된다. 고구려의 역사는 치우천황을 시조로 한다. 치우천황은 은나라의 조상이며서 동의족의 조상이다. 그런데 중국에서는 시황제와 치우천황을 시조로 삶아서 고구려와 발해를 중국 역사를 집에 넣을려고 하고 있다. 등소평이 등장하기 전에는 치우 천황은 중국의 조상이 아니라고 했는데 등소평의 민족 융화 정책에 의해서 치우 천황도 자신의 조상이라고 함으로써 민족을 융합시키게 되었다. 또한 만주에 있는 동의족 즉 조선족들에게 국사를 가르치지 못하게 함으로써 민족 융화 정책을 쓰고 있다. 그에 따라 학계의 대응은 일단 고구려사 왜곡에 집중되어 있다. 한국고대사학회를 비롯한 17개 학회가 중국의 고구려사 왜곡 대책위원회를 구성하고, 학회들이 고구려사 왜곡에 관한 학술 발표 회를 몇 차례 개최한 것이 그러한 시각을 보여준다. 발해사 연구자가 토론회에서 지적 했듯 이 발해사는 이미 중국사의 일부로 편입하여 중국사로 가르치고 있는 형편인데도 별 관심을 기울이지 않고 있으며, 고조선이나 국경문제 등에 관하여는 아무런 관심을 기울이지 않고 있다.시민단체의 시각도 고구려사 왜곡에 집중되어 있는 느낌이다. 동북공정에 대한 깊은 이해 의 결여와 함께 한국사의 일부이고 더욱이 광대한 영토와 기상을 뽐내던, 유일하게 자랑스 러운 역사였던, 고구려사에 대한 강한 향수가 이 문제를 고구려사 왜곡이라는 시각에서 보게 하는 요인이다. 동북공정의 목적과 성격이 그러하다면, 고구려사 왜곡은 그 목적을 달성하기 위한 하나의 교두보 확보 차원의 작업이다. 중국은 이미 발해사는 자국의 역사로 편입시켰고, 이번에는 고구려사를 대상으로 하고 있다. 그리고 고조선, 기자조선에 관한 연 구도 수행 중이다. 국가사로는 로 미래의 관계를 왜곡되게 형성하려는 것이다. 이것이 역사 왜곡의 본질이고 의도라고 하겠다.둘째, 동북공정 자체에 주목하는 시각은 동북공정이 역사왜곡에 그치는 문제가 아니고 장래 동북아시아(중국식으로는 동북지방)의 안정화 전략이라고 하는 데 중점을 두는 것이다. 전자에 비해 좀더 넓은 관점이라고 하겠다.동북변강의 역사와 그에 따라 파생되는 현상에 대한 체계적인 연구프로젝트라는 동북 공정의 정식 이름에서 보거나 연구 과제로 제시된 것들을 보아도, 중국의 관심은 고구려 사에 한정되지 않는다. 그들의 연구 범위는 고조선, 기자에서부터 괴뢰 만주국의 변경 충돌 에 이르기까지 전 시대의 동북 변강 역사와 민족에 걸쳐 있으며, 그 공간적 범위도 중국과 한국의 관계 뿐 아니라 중국과 러시아의 관계도 포함하고 있다.동북공정은 변강 지역의 역사와 함께 그에 따라 파생되는 현상을 연구하는 데 목적을 두고 있는, 따라서 다루는 시대가 길고 폭이 넓은 거대하고도 종합적인 프로젝트이다. 중국의 역 사왜곡, 동북공정의 주된 관심은 어찌 보면 역사 연구보다는 파생되는 현상에 있다고 생각 된다. 파생되는 현상이 발생할 주무대는 한반도이고, 그 내용은 한반도의 정세변화다. 한반 도의 정세는 극히 유동적이다. 그러므로 어떤 양상으로 한반도의 정세가 전개될지 모르지 만, 중국이 우려하는 것은 한국과 미국의 영향력이 북한이라는 완충지대 없이 중국 동북지 방에 직접 미치고, 그에 따라 만주지역의 조선족을 비롯한 주민이 동요하는 것이다. 한반도를 비롯한 동북아시아는 미국과 중국의 패권주의가 격돌하는 충돌점이 될 가능성이 매우 높다는 점을 의식하고, 그에 대비하는 안정화 전략을 세우는 차원에서 동북공정을 입안 추진하는 것이라고 판단된다.그러나 이러한 시각에서 보는 것만으로 충분하지는 않다고 생각한다. 좀더 근본적이고 미래 지향적인 시각에서 볼 필요가 있다. 중국의 동북공정 추진을 진실로 문제삼는 이유는 그것 이 결국 동아시아의 평화와 공존, 공영이라는 장래의 목표와 배치되기 때문이다. 역사적으로 오랜도록 후속 작업을 하는 것이다. 가칭 고구려 역사 왜곡 저지범 민족 시민 연 대가 강연회를 개최한다든가, 운동본부가 오늘과 같은 행사를 개최하는 것은 여론과 관심의 유지에 이바지 할 것이다.둘째, 중국의 역사인식을 바꾸도록 민간 차원에서 협력, 연대하는 활동을 전개하는 일이다. 이것은 민간에서 담당해야 할 핵심적인 활동이다. 먼저 중국의 학자들이나 각종 단체들과, 비록 NGO는 없지만, 반관반민단체들과 계속 교류하면서 역사인식의 차이를 좁혀 가는 활동을 전개하고, 중국의 패권주의에 위기를 느끼는 인근 국가의 시민단체와도 연대하는 활동을 전개해야 한다. 그리고 세계 각국의 평화를 애호하는 사람들과 역사학자들에게 중국의 역사왜곡과 그 위험성을 알려야 할 것이다. 반크의 활동은 큰 성과를 거둘 것으로 예상되며, 특히 학계와 협력하여 북한과 고구려사 뿐 아니라 중국의 역사왜곡 전반에 관한 교류를 추진하는 일이 과제다.셋째, 중국의 역사 왜곡을 일본의 역사왜곡과 함께 묶어 대응하는 방향을 찾아야 한다. 중국의 역사왜곡이나 일본의 역사왜곡은 겉으로 보기에 다른 양상을 띠고 있지만, 그 본질에 있어서는 별 차이가 없다. 그것은 지독한 自國 중심주의, 배타적 민족주의, 패권주의에 기초하고 있으며, 동아시아의 미래를 대결과 파멸의 길로 인도할 것이라는 점에서 공통적이다. 그러므로 시민운동은 궁극적인 목표를 동아시아 역사인식의 공유와 그에 기초한 평화 체제 구축, 공동 번영의 길로 설정하고, 각국의 역사 연구와 교육을 검토하여 동아시아 삼국의 역사 서술과 교육을 어떻게 하는 것이 바람직한 지를 연구하고, 그것을 실천하는 쪽으로 대응 방향을 잡아야 한다. 그러한 활동의 기반은 일본 역사 교과서 왜곡에 대응하면서 어느 정도 마련되었다고 판단되므로, 그 기반을 적극적으로 활용할 필요가 있겠다.넷째, 중국의 역사왜곡은 고구려사 왜곡에 그치지 않을 것이며, 일본은 2005년 다시 역사 교과서를 검정할 계획으로 있다. 그러므로 중국과 일본의 역사 왜곡 문제에 효과적으로 대 응할 수 있는 모색하는 향으로 삼는 게 좋겠다. 또한 한창 고조되어 있는 관심을 모아 모금 활동을 전개하여 시민의 참여를 유도하는 것도 바람직하다.일본의 역사 왜곡과 향후 대책1) 일본의 역사 왜곡일본의 역사 왜곡은 여러 측면에서 보이고 있다. 이것은 일본이 섬나라이기 때문에 대륙으로 진출하기 위해서 역사를 왜곡하는것이고 일본인들의 국민성과 관련되어 있다. 일본인들의 국민성은 계약에 얽매여서 살고 그것이 아니면 자기가 죽기 때문에 적극적으로 인간 생활을 한다. 그리고 인간미가 없다는 기분이 있다. 그래서 이렇게 되다 보니깐 대륙으로 진출하기 위해서 역사의 왜곡을 하곤한다.일본의 역사교과서가 다시 말썽을 부리고 있다. 2002년부터 중학생들이 배우게 될 역사교과서가 주변국가에 대한 침략행위를 은폐한 것은 말할 것도 없고, 심지어는 아시아민족의 해방에 기여했다는 식으로 서술하고 있기 때문이다.그런데 우리를 더욱 걱정스럽게 만드는 것은 일본의 자민당과 문부성이 이러한 역사왜곡에 음으로 양으로 개입하고 있다는 사실이다. 문부성은 이미 1999년 국회답변에서 검정에 제출되기 전에 각 출판사가 역사교과서의 내용을 자율적으로 수정하도록 지도하겠다고 말했다. 또 2000년에는 자민당 의원들이 역사왜곡에 비판적인 심의위원을 검정심의회에서 제외하라고 문부상에게 압력을 가했다. 문부성이 지금 검정을 하고 있는 역사교과서는 모두 8종이다. 그 중에서 우리들을 특히 경악케 하는 것은 '새로운 역사교과서를 만드는 회'라는 일본 민족주의 단체가 저술한 교과서이다. 근대 한일관계사를 전공하는 필자로서 이 교과서의 특징을 몇 가지 지적하면 다음과 같다.첫째, 일본의 식민지지배가 정당하고 합법적인 것이었다고 주장한다. 둘째, 한반도를 '일본에 들이대어진 흉기'라고 단언하듯이 역사적으로 일본에 도움을 주어온 한국을 오히려 나쁜 존재로 묘사하고 있다. 셋째, 한국을 자주적으로 근대화를 이룩할 수 없는 국가로 묘사하는 등 철저한 차별의식을 담고 있다. 넷째, 한국강점을 구미열강의 아시아진출 과정에서 이루어진 적. 새 역사교과서의 검정 통과 사실이 알려지면서부터, 한국정부는 일본정부에 강한 수정요구를 해왔다. 그러한 상황에서 이번에 일본정부가 수정요구를 받아들이지 않겠다는 뜻을 비추자, 한국 정부에 서는 문화개방 연기, 현재 진행되고 있는 문화교류 중지 등의 강경한 대응책을 내놓았다. 이는 한발자국도 물러나지 않겠다는 정부의 입장을 강력하게 피력한 것이다. 그러나 이는 지나치게 감정적인 대응이며, 최근 양국간 민간교류의 증가로 양국관계가 개선되고 있는 상황에서 상호 이해와 교과서 문제 해결의 가능성을 스스로 없애버리는 일이 될 수도 있다. 한국 정부에서는 이러한 감정적 대응태도를 지양하고 좀 더 이성적인 판단 하에 일본 정부와 연계하여 장기적인 대응 방법을 모색해야 한다.한편 일본 정부의 불확실한 태도에도 문제가 있다. 이는 교과서 문제의 원만한 해결을 지연시키고, 한국과 일본간의 정부의 대립상황만을 지속시키고 있는 결과를 낳고 있다. 수정을 하지 않을 것이라는 입장을 밝힌 이상, 앞으로 어떻게 이 문제를 해결해야 할 것인지에 대해 양국의 논의가 필요하리라고 본다. 이를 해결하기 위해서는 일본과 한국의 역사학자들이 직접 참여하여 공동연구를 통해서 서로의 입장 차이를 좁혀나가는 것이 최선책이 될 것이라고 생각한다.정부 차원에서의 대응뿐만 아니라 일반국민의 반응의 차이 역시 문제 해결을 어렵게 만들고 있다. 한국인들은 교과서 문제를 현 상황에서 가장 중요한 외교사안이라고 인식하고 있는데 반해, 일본인들은 무관심한 태도를 보이며 그리 큰 문제로 인식하지 않고 있다. 이렇듯 교과서 문제를 받아들이는 데 있어 양국간 국민들의 관심도의 차이가 지나치게 큰 것은 큰 문제점 중의 하나이다. 그러나 한국인의 관심이 크다고는 하나 문제의 본질에 직접적으로 접근했다고는 볼 수 없다. 현재 한국인들의 반응을 보면 이번 교과서 문제의 원인이나 해결방안에 대한 구체적인 생각 없이, 분위기에 편승하여 일본이 역사를 왜곡했다는 사실 하나만에 분개하고 강한 반발심을 표출하고 있는 경향이 강하다. 한다.

인문/어학| 2004.04.23| 8페이지| 1,000원| 조회(1,573)

전통, 일본의 역사왜곡, 중국의역사왜곡, 한국의 전통사상 계승, 한국의 전통사상

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[일본문화이 이해]먼나라 이웃나라 일본편을 읽고

먼나라 이웃나라역사를 알면 그 민족의 문화와 민족성을 알수 있다. 지리적으로나 역사적으로 우리와 긴밀한관계를 갖는 일본의 역사 이해는 우리가 일본을 정확히 볼수 있는 눈을 갖게 할 것이다. 그러면 일본의 언어를 보자. 우리말과 같은 알타이어 계통이고 우리민족과 같은 몽골리언 계통이다. 섬나라인 일본은 동남아시아에서 건너온 남방계통과 몽고계 인도 게르만계가 섞여 오늘의 일본 민족을 이룬다. 이중 구 몽고계라고 불리는 아시안인은 빙하기때 일본으로 건너간 것으로 알려진다. 1만년전 조본시대는 본격적인 역사가 열리기전의 시대, 일본은 기원전 3세기경부터 농경이 시작되면서 일본의 역사도 본격적인 궤도에 들어서게 된다. 도쿄대학근처 야요이라는 조개무덤에서 둥그스름한 질그릇을 발견 야요이 시대에 발견된 토기는 곡식을 담는 그릇이었다. 기원전 221년전에 한반도 고조선, 중국은 진나라가 중국을 통일 만리장성을 쌓는 등 강력한 중앙집권국가를 건설하였는데 이시대의 아무런 기록이 없어 일본으로선 열등감을 가지고 있다. 그래서 이때의 역사적인 약점을 온갖 수단을 동원하여 왜곡하고 있다.일본에 나라가 존재한단느 사실이 처음 등장한 것은 서기 1세기 한서지리지에 오라는나라가 등장한 것이다. 기원후 3세기는 중국은 위, 오, 촉의 삼국시대고 한반도는 고구려 백제 신라가 자웅을 다투던 시대였다. 이때 일본은 작은 나라들이 세력을 다추던 혼란기가 계속되었다. 야마토 시대는 일본의 상징적 첫국가가 등장하였고 첫 여왕이 나타난 시기였다. 따라서 일본의 본격적인 역사는 여왕으로부터 시작된다. 하지만 역사적으로 많은 의문점을 가기고 있다. 야마토 정권은 4세기부터 7세기까지 발전하였고 주변세력을 합쳐 일어섰다. 오이키미라는 대왕의 호칭을 사용하였고 이는 뒤에 덴노로 바뀐다. 그리고 일본은 임나 일본부설을 주장하기도 하였지만 이는 당시 역사적 상황을 고력해볼 때 있을수 없는 일이었으면 이런 주장이 지니는 의미는 야마토정권이 한반도의 세력과 맞설 수 있는만큼의 국가의 기틀이 잡혔다는 사실이다. 야마토하려는 목적으로 역사책을 저술하였다. 그러나 다이카 카이신과 율령제 실시하여 강력한 국가 건설을 하는 듯 했으나 귀족과 고조쿠의 영토 확장을 하자마자 세력을 키워 중앙정부에 맞서기 시작했다. 이에 정부는 덴노의 절대 권력으로 스스로 율령을 파괴함으로써 국가기강이 흐트러졌다. 귀족의 세도가 드세 지면서 황족도 아닌 신하가 섭정의 자리에 오르는가 하면 왕이 성인이 되어도 정권을 내놓지 않고 간바쿠가가 되어서 정치를 마음껏 주무르는 실질적인 왕 노릇을 했다. 이런 간바쿠 정치를 줄여 셋칸 정치라 하는데 귀족이 득세하던 헤이안 시대를 상징하는 말이기도 했다. 다이카 개신이후 바쿠후가 세워지기까지 500년간은 후지와라 가문세력과 덴노세력의 힘겨루기의 역사였다 후지와라 가문은 덴노의 부마가문으로 권력을 누려왔으면 황태자를 마음대로 폐위시키는 등 그 누구도 넘 볼 수 없는 절대 권력을 누린 외척 세도가문이었다 세도 귀족이 덴노를 밀어내고 정치를 멋대로 주무르면 국가의 기장을 흩트리고 부정부패를 일삼으면 율령제를 비롯한 국가 기반이 무너지기 시작할 무렵 귀족의 하수인으로 출반한 사무라이 계급이 귀족의 반대 세력으로 등장하게 된다.지방정원의 영주격인 고쿠시가 다토와 영토문제로 대립하게 되고 다토는 중앙귀족에게 땅을 바치고 자신의 안전을 보장받으면서 중앙권력자의 장원은 날로 거대해져 무사정권에 의해 귀족정치가 허물어지기 직전인 12세기 전반에는 개인 소유 장원이 전국토의 60%를 차지할 정도가 되었다. 개발영주, 장원영주들은 귀족들의 세력을 내세워 고쿠시의 장원 출입을 거부하고, 세금을 국가에 내기를 거부하게 되었다. 개인소유지로 변한 장원의 증가로 지방 세력과 중앙 귀족들의 세력이 커지면서 덴노의 중앙정부는 상대적으로 세력이 약해졌다. 따라서 율령제가 무너지고 국가 권력이 흔들리기 시작했다. 그리고 장원의 주인들은 고쿠시의 우협이 심해지자 스스로 토지와 생명을 지키기 위해 무장하고 힘을 합쳐 무사가 되었다. 이로서 무사 계급이 탄생하게 되었다. 중앙정부는 이에 위협을 느끼면서막을 내린다. 패장 미나모토 요시토모는 죽임을 당하고 그이 두 아들 요리토모, 요시쓰네는 머나먼 곳으로 유배를 간다. 이 두 사건은 부시의 힘에 의해 덴노의 자리가 좌우됨을 과시한 사전이었으면 권력을 잡은 다이라노 기요모리는 딸을 넨노의 부인으로 들여보내 그 사이에 태어난 안토쿠가 3살 되던 해 덴노에 앉힘으로써 외척이 되고 스스로 태정 대신의 자리에 오름으로써 부시 출신으로는 처음 수상자리를 차지 다이라 정권을 수립했다. 한편으로 막대한 장원을 차지하고 무역으로 엄청난 부를 쌓는가 하면 반대세력을 무차별 제거해 버리는 군사독재 정권을 형성하였다. 따라서 이에 불만을 가진 귀족과 덴노 가문들에서 반 헤이지 움직임이 일어났고 여러 차례 쿠데타 음모도 발생하였다. 기요모리의 지나친 권력독점에 반기를 든 인물의 중심에 바로 미나모토 요리모토가 있었다. 20년간의 기나긴 유배 생활 동안 복수의 칼날을 갈은 요리모토는 군사를 일으켜 다이라와의 5년 전쟁이 시작되었다. 지방세력과 조우고 불교 세력까지 요시쓰네가 지휘한 겐지군이 헤이지군을 무찌르고 승리를 거두었고 헤이지 가문은 멸망하과 말았다. 뒤에 군사력을 바탕으로 쇼군이 실직적인 최고 권력자가 됨에 따라 미나모토 요리모토에 의해 정식으로 막을 열게 된 것이 바로 이 바쿠후시대였다. 이 가마쿠라 바쿠후는 헤이지 시대의 부시정권은 670년간 계속된다. 하지만 정치실세가 바꿔었음에도 왕실, 즉 덴노의 혈통은 계속 이어져 내려옴에 따라 만세일통 혈통을 유지하였다. 이점 역시 섬나라 일본만이 가지는 특이한 일이다. 일본은 이 덴노를 상징으로 민족이 하나로 뭉치게 된 결과를 가져왔다. 하지만 겐지 가문이 쇼군이 3대로 대가 끊어지니 쇼군의 후임 문제로 고케닌 사이에 대립이 심해지고 덴노의 군대와 출동했다는 소리에 바쿠후의 부시들은 크게 술렁거린다. 그러자 미나모토 요리모토쇼군을 등에 업고 일본을 장악하였다. 이 사건을 조코의 난이라고 불렀다. 이때 세력을 크게하고 있던 몽고의 두차례 침공을 막아내면서 바쿠후 가문은 권세가 더욱 은 정치, 군사 등 모든 권력을 독점하는 지배계급으로 과거와는 달리 도시나 성안에서 사는 관료, 문신으로 변모되어 갔다. 그리고 이러한 사무라이시대는 일본의 역사와 문화에 많은 영향을 주었다. 이 시대에 일본은 소국정책으로서 조서느 중국과만 무역을 하였다. 에도시대에 특히 상업이 발달하였는데 이를 기반으로 상인들이 새로운 사회 주역으로 떠올랐다. 이들이 실력자로 떠오르면서 지배 계급인 부시계급을 밀어내고 사회주도권을 장악하게 되는데, 이것이 바로 1868년 메이지 유신의 가장 중요한 역사적 의미이다. 에도시대에 상업이 발달하게 된 것은 오랜 안정과 농업기술의 발달로 생산력이 증가함에 따라 서로 사고파는 유통이 발전했기 때문이다. 생산의 증가, 상업의 발달, 교통의 발달 등으로 에도시대 초기의 경제는 크게 성장하여 17세기 말에는 그 전성기에 이르러 일본 역사상 최고의 번영을 누리게 되는데 이때를 겐로쿠시대라 하여 지금도 최고의 경기를 상징하는 말로 통하고 있다. 하지만 이 시대 상인들과 지배계급의 혹독한 착취와 흉작과 기근으로 민심이 흉흉해지고 계속되는 반란으로 얼룩진 나라에 개혁을 주도한 세력인 한이 등장하게 되었다. 그리고 1854년 미군함을 끌고 온 페리제독에 의해 미·일 화친조약이 체결되었다. 굳게 닫혔던 일본의 문이 2 백여년말에 열린 것이었다. 이에 일분은 바쿠후를 중심으로 한 개국파와 덴로를 중심으로 한 배척파, 즉 오아파로 갈라져 개국을 두고 정면으로 대립하게 되었다. 1858년 다이로인 이이 나오스케가 굴욕적인 미·일 수호통상 조약에 조인하자 개국을 주장하는 바쿠후와 조이를 주장하는 사쓰마, 조슈등의 대립이 정면 충돌하게 되었다 사쓰마,조슈등 이른바 유항들은 바쿠후 세력이 약해지면서 바쿠후로부터 정권을 덴노에게 돌려주어야 한다는 이른바 왕정복고를 주장하는 순노론을 내세웠기 때문에 바쿠후와 유항들의 대결은 피할수 없었던 거였다 허약한 바쿠후, 권위없는 쇼군의 정권은 이제 새로 등장한 상업 자본을 등에 업은 유항에 의해 정면 도전을 받게 되었다. 몰락한 것을 계기로 한 동안 국력 증강에 치중하다가 1894년 갑오 동학운동이 터진 것을 계기로 한 반도 침략을 노골화하기 시작했다. 이를 빌미로 조산에 군사를 보낸 이롭ㄴ은 청나라를 도발하여 청일전쟁을 일으키고 승전함으로써 조선에 발판을 굳히는 계기를 마련했다. 뒤이어 러일전쟁에서도 승리하면서 일본은 일약 아시아의 군사대국으로 떠올랐다. 이때의 세계는 철저한 약육강식, 약한 나라는 강한 나라의 먹이가 되는 시대였고 실제로 미국이 필리핀을 지배하는 것을 묵인하는 대가로 가쓰라 태프트 밀약으로 일본의 한국지배를 묵인했고 그 외에도 각국이 자기 나라의 이익을 위해서 언제든지 적이 되기도 하고 우방이 되기도 했다. 한일합방으로 우리 민족이 혹독한 식민지 통치를 받게 된 1910년대는 일본에게는 비약적으로 국력이 신장된 시대였다. 세계의 열강들이 일본을 강대국으로 인정함에 다라 일본가 맺었던 불평등 조약도 고쳐 대등한 조약으로 바꾸게 되었다. 명실 공히 세계 상대국으로 성장한 1910년대 이후의 일본 역사는 눈부신 경제 발전과 산업이 발달에 따른 자본주의의 성장과 함께 정권과 밀착한 독점자본의 성장과 경세치국에 따른 부패도 늘어났으며 자본가에게 착취당하던 노동자들의 사회주의 운동도 격렬해 지고 한바츠와 군부의 정권독점에 반대하는 민주화 운동도 거세어 졌다. 일본의 정치는 민주주의와 거리가 먼 전제정치였고 뒤에 러시아의 공산혁명의 영향을 받은 거센 민중의 요구에 견디다 못한 정부는 1925년 보통선거법을 개정하게 되는데 결국 이것도 치한 유지법에 의해서 탄압을 받게 되고 일본은 군국주의의 길을 치닫게 되었다. 1914년 1차 세계대전으로 유럽 열강들이 아시아에 관심을 쏟을 겨를이 없는 틈을 타서 일본은 본격적으로 아시아 침략을 나섰다. 1차 세계대전으로 유럽의 생산이 감소하자 일본은 수출로 호황을 누렸다. 전쟁이 끝난 뒤 파리 강화 회의에 승전국으로 참가 할 수 있었고, 이 회의에서 미국의 윌슨 대통령은 자결주의를 주창했는데 이것은 동유럽에만 적용되고 아시아에는 적용하다.

자연과학| 2003.12.27| 6페이지| 1,000원| 조회(502)

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실험제목: Purification and characterization of lactase form kluveromyces marxianus실험개요이번실험은 kluveromyces marxianus부터 lactase를 순수분리하고 특성화를 알아보는데 있다. 단백질 전기영동에서 약 kDa에 부자량을 나타냈으면, 최적온도는 40℃이고 최적 pH는 6.5이었다. 그리고 pH에 관한 안정성은 pH5.0~8.0까지였고, 온도에 해한 안정성은 4℃~45℃였다. 이효소는 1M Ammonium perserfate buffer에서 저해를 받았으면, 50mM potassuim phospate bufferd에서 안정화 되었다.서론Lactose유당이라고도 한다. 분자식은 C12H22O11, β-D-galactosil(1,4)-glucose의 구조갖는다. β-lactose는 93.5℃이상의 진한 용액에서 결정시키면 생기는데, α-lactose보다 더 달다. 묽은 산이나 효소의 작용으로 가수분해되어 D-glucose와 D-galactose로 되면, 또 젖산균의 작용을 받으면 젖산이 된다. 생합성은 glucose를 수용체로 하여 YDP-galactose로부터 galactose를 전이하는반응에 의해서 이루어진다. 이 전이반응을 촉맨하는 효소는 갈락토실트랜스퍼라아제라 불리면, 젖과 젖샘속에서 발견된다. 이휴소는 다른자리 입체성단백질의 일종으로 혈청단백질의 일종인 α-lactoalbumin이 존재하지 않을때는 n-acetylactosimin을 합성한다. 이것은 생물이 갖는 조절기구의 한보기로 출산후에는α-lactoalbumin이 증가하게 된다.Lactaseβ-galactosidase라고한한다. lactose는 β-D-galactosil(1,4)-D-glucose의 구조를 가지고 있고, lactase는 lactose가 포도당과 galactose로 hydroltsis될때 촉매작용을 한다. 이 효소는 미생물에서 고등 동식물에 이르기까지 넓은 범위에서 발견되고 있다.실험목적kluveromyces marxianus 로부터 lactase를 분리하여 이 효소의 특성을 연구하여 산업적으로 사용하기 위해서이다.실험방법 및 재료1. 실험재료kluveromyces marxianus,, protein size mark, SDS PAGE, Bradford용액 Phenyl-Toyopeal, 셀로판막, DEAE column, 흡광도기, gradent, 1M Ammonium perserfate buffer, 50mM potassuim phospate buffer, YPD(yeast pepton dextose)배지, pH측정기, 증류수, E-tube, tip, pipette, 팔콘tube등등..2. 실험방법YPD배지를 만든어서 kluveromyces marxianus wide type을 straking↓24시간 배양후 seed culture 접종: 3~5ml 액체배지 in test tube↓main culture(200ml) 접종↓2일동안 액체배양후에 원심분리(상등액은 버리고 Z-buffer와 PMSF넣어서 희석한다.)↓cell 파쇄(Min Beadbeater로 46.000rpm, 30초간에서 5번 반복)↓원심분리기 12,000rpm 20분간 하여 상등액만 얻는다. 이것이 추출액이다.↓ultrafiltration로 추출액을 농축(이때 Relactity activity와 specific activity를 측정)↓DEAE column(이후에투석과 SDS PAGE 실시) -Relactity activity와 specific activity를 측정↓Phenyl - Toyopearl column(이후에투석과 SDS PAGE 실시) - Relactity activity와 specific activity를 측정↓효소특성연구(온도, pH, 온도에대한 열안정성, pH에 대한 안정성)↓SDS PAGE(최종lactase와 추출액, 농축액, SDS column)3. 기타실험들① ONP standard curve0.1ml/ml ONP solution을 사용하여 assay 방법으로 420nm에서 O.D갑을 측정하여 standard curve를 그렸다. 이것은 activity를 측정하는데 쓰이게 된다.② BSA(Bovine serum albumin) standard curve작성0.1mg/ml BSA와 Bradford 용액을 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 이것을 3번 반복으로 하여 실시하여 그 중간값을 그래프로 그렸다. 이것은 protein양을 측정하는데 이용되어진다.③ ONPG substrate 만들기0.1g KH2PO4 1.38g와 Mncl2을 멸균된증류수에 넣고 잘 Mix했다. Mix가 충분히 되면 8mM ONPG 250mg을 넣어서 완전히 녹인다. 그리고 이것의 pH가 4.5이기 때문에 6.5를 맟추기 위해서 NaOH를 첨가하고 최종 volume을 100ml맞춘다.④ lactase activity 측정8mM ONPG substrate 400ul와 enzyme 100ul를 넣고 37℃ 15분간 반응시킨다. 그리고 2%Na2CO3넣은후에 420nm에서 흡광도를 측정하면 된다.Activity=ONP양(ml)×희석배수/ONP의 분자량(139.1)×효소량(ml)×반응시간결과 및 고찰1. Purification summary of lactase from kluyveromyces marxianusPurification stepTotalactivity(Unit)Totalprotein(mg)Specificactivity(U/mg)Purification(fold)Recovery(%)Cell extract11881448.251.00100Ultrafiltration11329611.791.4395.29DEAE-sepharose937.5024.3038.584.6878.91Phenyl-Toyopearl12.180.0429035.151.03위표를 보면 처음에 Cell extract를 한 후의 specific activity는 8.25U/mg 였는데 마지막 Phenyl-Toyopearl column후의 specific activity는 290U/mg로 정제가 35.15fold 정도 정제되었다는 것을 알수가 있었다. 그리고 회수율은 1.03정도이다.2. SDS PAGE 결과최종 정제하고자하는 lactase는 Phenyl-Toyopearl column 후에 SDS PAGE 실행해 보았다. SDS PAGE를 한 결과 150kDa에서 하나의 밴드가 나왔다. 이것이 lactase로 추측이 되어진다.1 2 3 4 5kDa←175←83←62←47.5←←←←32.52516.56.51:Phenyl-Toyopearl 2:DEAE-separose 3:ultrafitration 4:cell extract 5:size marker3. 최종 Lactase의 특성① pH의 영향효소의 최적 pH를 알기 위해서 8mM ONPG substrate를 pH별로(4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0)을 50ml 씩 준비한다. 이 pH별 기질을 400ul씩 E-tube에 담은후에 효소를 100ul을 넣고 37℃ 15분간 반응시킨후에 2% Na2CO3 500ul넣고, 420nm에서 흡광도를 측정한여 activity를 측정한다. 측정한 결과 pH6.5에서 가장 활성을 나타냈었다.② 온도의 영향enzyme(100ul)과 substrate(400ul)을 넣어서 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃에서 15분동안 반응후에 2% Na2CO3 500ul 넣고 흡광도를 측정한다. 측정한 결과 40℃에서 가장 활성을 나타 났다는 것을 알게 되었다.③ 온도에 대한 열안정성 조사최종lactase를 50mM potassuim phospate buffer 2.7ml을 희석하여 E-tube에 150ul씩 loading후에 30℃, 40℃, 50℃, 60℃에서 1시간동안 incubation 한다. 그리고 4℃에서 5분간 방치후에 spin 애주한다. 그리고 assay를 실시하여 O.D값을 측정한다. 최종 lactase는 온도에 대한 안정성은 4℃~45℃까지 안정하였다는 것을 알수가 있었다.

공학/기술| 2003.11.09| 10페이지| 1,000원| 조회(546)

효소, 식물, lactase, 정제

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[유전자클로닝]미생물학실험

제목: small-scale preparation of plasmid DNA실험목적어떤 물질을 숙주세포에 잡아 넣기 위해서 필요한 vecter에 일종인 plasmid DNA분리하는 방법을 알아보자실험원리플라스미드란 박테리아와 다른 유기체에서 발견되는 DNA이다. plasmid는 숙주세포 염색체와 무관하게 복제할수 있다. plasmid는 원형 DNA분자이면 박테리아 세포내에서 독립적으로 전재한다. plasmid는 항상하나, 혹은 그 이상의 유전자를 가지고 있으며, 이러한 유전자는 숙주 박테리아에서 나타나는 유용한 특성의 원인이다. 예를 들면 chloramphenicol이나 ampillin 같은 항생제의 독성농도에서 살수 있는 능력은 항생제에 저항하는 유전자를 가진plasmid가 박테리아에서 존재하기 때문이다. 실험실에서 항생제 저항성은 종종 선별표식자로 사용되면, 이것은 배양되는 박테리아가 특별한 plasmid를 포함하는지를 확인하게 한다.모든 plasmid는 복제 시작점 역할을 하는 DNA 염기배열을 적어도 하나는 가지고 있기 때문에 박테리아 염색체와는 무관하게 세표내에서 다량복제될 수 있다. 더 작은 plasmid는 숙주세포의 DNA 복제효소를 이용하여 사본체를 만들지만 조금 큰 plasmid는 plasmid replication에 필요한 특별한 효소의 유전자를 지니고 있다plasmid 중 어떤 것은 박테리아 염색체내에 자신을 삽입시킴으로써 복제를 할 수 있다. 이런한 삽입plasmid혹은 에피솜은 수많은 세포분열휴에도 이런형태로 유지가 되지만 어떤 단계에서는 독립적인 요소처럼 존재한다. bacteriophage염색체의 중요한 특징이다.실험재료LB배지solution1(50mM glucose, 25mM Triscl(pH8.0) 10mM EDTA) solution2(0.2N NaOH, 1% SDS) solution3( 5M potassium acetate 60ml, glacial actic 11.5ml, 물 28.5ml) 원심분리기, 파이펫, E-tube, vo- 대장균에서 Lac Z가 들어 있는가 확인하는 배지이고 이들 종류에는 X-gal과 같은 배지도 있다. 그리고 항생제 저항 유전자의 삽이 비활성화가 재조합 확이늬 편리한 방법을 제공하기도 한다. 예를 들어 pUC 19이며 ampicllin 저항 유전자와 Lac Z유전자를 지니며 LacZ'는 효소 베타-갈락토시다제에 해당하는 일부 유전자이다. pUC19로 클로닝하는 것은 Lac Z'유전자의 삽입 비활성화로 베타- 갈락토시다제를 합성할 수 없는 것으로 재조합체임을 확인한다. 베타- 갈락토시다아제는 락토스를 글로코스와 갈락토스로 분해하는데 관여하는 일련의 효소중 하나이다. 이것은 일반적으로 대장균 염색체에 있는 유전자 lacZ에 해당한다. 어떤 균주의 대장균은 변현된 lac Z유전자를 가지고 있으면, 이것은 lacZ'라 부르는 베타-갈라토시다아제의 -peptide부위에 해당되는 유전자 조각이 없다. 이런한 돌연변이체는 lazZ'유전자 조각을 지닌 pUC19과같은 플라스미드를 획득할때만 효수를 합성한다. 그리고 이것은 베타-갈라토시다제의 존재 혹은 부재를 검사하는 것은 괘 쉽다. 글루코스와 갈락토스로 쪼깨는 락토스 분석시험법보다는 효소에 약간 다른 반응으로 검사할수 있다. 이것은 X-gal라 부르는 락토스 유사체이면 X-gal은 베타- 갈락토시당제에 의해 분해되어 진파랑색을 띄는 생성몰로 된다. 만약 X-gal이 아가에 첨가되고 그후에 엠피실린과 베타-갈라토시다제를 합성하는 세포인 비 재조합 콜로니이첨가된다면 파랑색을 띄는 반면에 lacZ' 유전자가 파과된 즉 베타-갈락토시다제를 합성할수 없는 재조합 분자의 하얀색을 띌 것이다.2. 실험에서 얻고자하는 것은 무엇인가?- 실험에서 얻고자하는 것은 하나의 bacterial colony에 포함되어 있는 DNA를 얻고자하는 것이다. 나중에 우리가 vecter에 넣을 때 이 DNA를 이용하고 있다. 또한 형질전환되어질때에 이DNA를 이용하여 숙주세포에 집어넣는데 사용되어진다.3. 실험에서 잘못된점이나 고쳐야할점?solution지 다른 부류의 제한 효소가 아려져 있으며 각각은 약간 다른 활돌을 함으로써 구분되어 지낟. 형태1과 형태3은 아주복잡하며 유전공학에 있어서는 아주 제한된 역할을 한다. 반면에 형태2 제한효소는 클로닝에 있어서 아주 중요한 절단효소이다.실험재료증류수, gel-loadung 환충용액(6 ), 파이펫, 팁, palafilm. UV사진촬영기. λ DNA/hindⅢ, gelvks. Etbr용액, DNA용액, Dye(염색약), comb, 전기영동 완충용액, 미리만든 agarosepUC19 plasmid DNA, 10 H 환충용액, EcoRⅠ, E-tube실험 방법1 .전기영동1. 0.7g읫 아가로즈를 100ml의 0.5 electrophoresis buffer에 넣은후 100도에서 녹을때까지 끓인다. *electrophoresis buffer ->20mM Tris-acetate, 0.5mM EDTA(pH8.0)2. 아가로즈 용액을 60도 정도까지 식힌 후 comb를 꽃은 gel위에 붓는다3. 아가로즈가 완전히 식은후 comb를 조심해서 뽑는다(너무빨리 뽑으면 gelgha이 파괴됨)4. 아가로즈 gel이 담긴 gelvks 그대로를 전기영동 장치에 넣은후 electrophoresis buffer를 붓어서 잠기게 한다.5. 깨끗한 palafilm위에 DNA용약 1㎕, 증류수4㎕,gel-loading 환충용액(6) 1㎕씩을 첨가한 후 섞어서 0.7% 아가로즈 gel의 홈에 주입한다.* 6 gel-loading buffer -> 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 30% glycerol in water6. 전원을 연결하여 (50V혹은 100V) 전기영동을 시작한다.7. blue 색깔을 딴 밴드가 gel의 2/3정도 내려오면 정지한후 gel을 꺼내서 EtBr 용액속에 담근다.8. 5분정도 방치한 후 gel에 UV를 비추어서 DNA를 확인하고 사진을 찍는다.2. 제한효소1. 제한효소에 의한 DNA의 절단반응용액(10㎕)조성을 아래와 다른 헥사뉴클레오티드인 CAGCTG에서만 절단한다. 많은 제한효소는 hexanucleotide 표적부위를 인식하지만 다른 것은 4개,5개 혹은 8개 뉴클레오티드 염기배열에서 절단한다. SAu3A는 GATC를 인식하며 AlUⅠ는 AGCT에서 절단한다. degenerate 인식 염기배열을 가진 제한효소들도 있다. 그들은 연관된 부위 집단의 어떤 하늴 DNA를 절단하단. HinfⅠ은 GANTC를 인식하여 GAATC, GATTC, GAGTC, GACTC 등을 절단한다.참고문헌- 일반 미생물학 실험서- 유전자 클로닝 입문 (제3판) 월드사이언스제목: 대장균의 형질전환(Hige-voltage electroportion 방법을 이용한 형질전환)실험목적plasmid DNA를 이용하여 높은 전압을 걸어서 숙주세포에 이것을 넣어보자실험원리형질변환·형전환 ·형변환 등이라고도 한다. 형질전환은 1928년 영국의 F.그리피스가 폐렴쌍구균을 이용하여 실시한 실험이 계기가 되어 발견되었다. 폐렴쌍구균 ·파라이질균 ·인플루엔자균 ·뇌척수막염균 ·대장균 등의 박테리아에서 볼 수 있는 현상이다. 폐렴쌍구균을 예로 들면, 다당류로 이루어진 두꺼운 막, 즉 협막을 가진 S형균으로부터 DNA를 추출하여 이것을 다당류성 협막을 가지지 않은 R형균에 작용시키면 R형균의 일부가 S형균으로 변한다. 이것은 S형 세균의 DNA가 R형 세균 속에 들어가서 유전자 발현을 하기 때문이다. 전환을 일으키는 데 필요한 DNA의 최소량은 약 10만분의 1mol이며, DNA의 싱글스트랜드를 주는 것보다도 더블스트랜드를 주는 쪽이 전환을 일으키기 쉽다. 형질전환 실험에 의하여 유전자의 본체가 DNA라는 것이 밝혀졌다. 그러나 고등생물에 있어서도 세균류에서 볼 수 있는 것 같은 형질전환이 일어나는지 어떤지는 아직 밝혀지지 않았다.또한 박테리아를 형질전환 시키는 대부분으 방법은 수많은 과학자들이 경험적으로 정리한 것이면 그 기전은 정확히 할려지지 않았다. 현재 실험실에서 현질전환할 때 주로 두가지 방법이 사용된다. 첫 번00㎕넣어서 희석되면 1/10희석됨 그러므로 1/100로 희석되었다. 이것에서 100㎕를 파이펫으로 따서 LB배지(항생제가 들어 있는배지)에 spreeding하고 난 뒤에 37도 배양기에서 뒤집어서 배양시팀(12~16시간이면 콜로니를 관찰할수 있음)실험결과고찰참고문헌제목: Polymerase Chain reaction(PCR)실험목적우리는 작은양의 DNA를 가지고 많은야의 DNA를 얻어 싶을때에는 PCR을 통하여 증폭시킬수가 있다. 이때 PCR이 어떻게 사용되는지 그리고 그 원리와 사용용도에 대해서 알아보자실험원리PCR은 DNA 분자상에서 어떤 부분만을 선택적으로 증폭시킨다 증폭하고자 하는 부위의 가장자리의 염기서열이 알려져 있다면 DNA분자의 어느부위이건 선택될 수 있다. 그 주변의 염기서열을 알아야 하는 이유는 DN 이중 나선의 각 사슬에 결합할 수 있는두개의 짧은 올리고 뉴클레오티드 들이 있어야 PCR을 수행할수 있기 때문이다. 이들 oligonucleotide들은 DNAgkqtyjd에 대한 primer로 작용하며 어느 부분이 증폭될 것인가를 결정한다.PCR에 의한 증폭은 제한효소인 TaqⅠ인 DNA 중합효소Ⅰ에 의해 수행되는데 온천에서 생활하는 이 세균이 만드는 Taq 중합효소를 포함한 많은 효소들은 대부분 고온에ㅅ도 안정하다. 즉 이들은 열에 의한 변성에 대하여 저항성을 갖는데 Taq 중합호소의 온도 안정성은 PCR에 필수 요인이 된다 PCR 증폭은 Primer가 결합된 주형 DNA 가닥이 합성됨으로써 시작된다. 곧 이어 이 반응액에 94도의 열이 가해짐으로써 새롭게 합성되었던 가닥들이 주형으로부터 분리된 후 많은 primer들이 새롭게 합성된 사슬 사의 특정 위치를 포함하여 template DNA 사의 해당 위치에 결합할 수 있도록 냉각된다. 다른 DNA 중합효소에 의해 두 번째 DNA합성이 일어나게 된다. 이와 가이 변성- 정합- 중합의 과동을 25-30회 정도 반복함으로써 수백만의 증폭된 DNA 단편의 복사체르가 합성될 수 있다,. PCR 산문은.

자연과학| 2003.11.09| 14페이지| 1,500원| 조회(1,006)

PCR, 형질전환, DNA, 미생물학실험, DNA전기영동

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[미생물학실험-단백질분야]미생물학실험2-단백질

실험제목: SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate0polyacrylamide gel electrophoresis)실험목적- SDS-PAGE 방법에 대해 알아보고자한다. 본 실험에서는 고도 효소와 BSA를 전기영동하여 각 단백질의 분자량을 확인하고자 한다. 본 실험을 통하여 기본적인 단백질전기영동에 지식을 습득하고자 한다.실험원리1) SDS-PAGE를 통해 확인할 수 있는 것들- 단백질의 정제도 확인- 단백질의 분자량을 결정- 단백질의 농도 확인- Proteolysis를 확인- immunoprecipitated protein을 확인- immunoblotting을 수행하기 위한 첫 단계2) 일반적으로 전기영동에서 단백질에서 단백질의 이동은 단백질의 크기, 모양, net charge에 의해 결정된다. 단백질의 크기, 모양, net charge에 영향을받는 native PAGE는 단백질의 정확한 분자량을 알거나 단백질의 정제를 알기에는 적당하지 못하기 때문에 이런한 단점을 보완한 것이 SDS-PAGE이다.SDS-PAGE는 샘플을 준비할 때 뜨거운 SDS를 처리하기 때문에 대부분의 단백질에 anion이 결합하여 단백질에게 동일한 nagative charge를 부여하게 된다. 또한 SDS는 단백질의 noncovalent 결합을 파괴하기 때문에 단백지르이 구조를 풀어지게 하여 동일한 모양을 가지게 한다. SDS와 함께 들어가는 2-merxaptoethanol이나 dithiothreitol은 단백질을 더욱 더 변성시킨다. 이러한 결과에 의해 SDS-PAGE는 단백질의 모양과 전하에 영향을 받지 않고 크기에 의해서 분리될 수 있다.실험방법stock 용액1. 2M Tris-HCl (pH 8.8)2. 1M Tris-HCl (pH 6.8)3. 10% (w/v) SDS4. 50% (v/v) glycerol5. 1% (w/v) bromophenol blueWorking 용액1. 용액 A (acrylamide stock 용액), 100ml30% (w/v) acryamring the separating gel↓pouring the stacking gel↓샘플을 준비하고 loading 한다.- 5x sample 완충용액 + sample- heat at 100℃ for 2-10min- spin snow- loading↓runing a gel-stacking gel : 20mA-separating gel: 40mA↓staining a gel with coomassie bule- 5-10분간 염색(1.0g coomassie bule R-250, 450ml methanol, 450ml 멸균 증류수, 100ml glacial acetic acid)↓Destain(100ml methanol, 100ml glacial acetic acid, 800ml 멸균증류수)12% separating makestacking gel makeacrylamide ----- 4ml1.5M Tris pH6.8------ 2.5ml10% SDS ----------- 0.1ml10% A/S ----------- 0.1ml멸균 증류수 --------- 3.3mlTEMED ------------ 4㎕1M Tris pH6.8-------- 0.25ml용액 A -------------- 0.33ml10% SDS ------------ 0.02ml10% AIS ------------ 20㎕TEMED-------------- 2㎕물------------------- 1.4ml실험결과SDS-PAGE의 결과BSA enzyme의 분자크기->GODO enzyme의 분자 크기->BSA enzyme의 분자의 크기는 약 6만 6천 daltons 이고, GODO enzyme의 분자의 크기는 약 11만 6천 daltons이다.실험 고찰1. 다른 전기영동법에 대해서 알아 보자1) 이동계면 전기영동법전기영동법은 크게 두가지 유형으로 구분할수 있다. 하나는 이동계면 전기영동법으로서 분리하고자 하는 분자들이 용액내에 산재해 있는 상태에서 전류를 통하여 용매와 용액사이 또는 용액과 용액사이 에 계 잡아 놓아서 인 것 같다. 그리고 다시 gel을 만들어서BSA와 GODO 효소를 loading 하여 전기영동 시켜보았다. 먼저 이론부터 들을때에는 어떻게 실험을 해야 할지 눈앞에 깜깜했다. 직접 실험을 해 보니깐 그런되로 이해가 되었다. 또한 실험 할 때에는 즉 gel를 만들때에는 거품이 생기지 않게 하여야 한다. 이후에 방법은 실험에 참가하지 않았기 때문에 잘 알수가 없어지만 저희 조원들의 설명을 들어니깐 조금이나마 이해할 수가 있었다.3. BSA 와 GODO 효소의 크기를 알아보자BSA 효소의 크기 -> 66,000 doltonsGODO 효소의 크기 -> 116,000 doltons참고 자료1. 미생물학 실험서2. 효소학 전홍기 저 부산대학 출판부 (p262∼284)실험제목: protein purification실험 목적- 단백질을 정제하는 방법에 대해 알아보고자 한다. 본 실험에서는 Kluyveromyces marxianus의 cell extract를 DEAE column에 통과시켜 β-galactosidase를 부분 정제하고자 한다. DEAE column은 anion exchange column으로써 본 실험을 통하여 기본적인 ion exchange column을 직접 수행해보고 단백질 정제에 관한 기본지식을 습득한 다.실험 원리모든 단백질들을 정제하는 한 가지 간단한 방법은 없다. 한 단백질의 정제에 유용한 방법은 또 다른 단백질의 변성을 가져올 수 있다. 단백질 정제에 있어서는 조잡한 단백질 혼합물에 있는 여러 단백질들의 물리적 및 화학적 성질들에 있어서의 근소한 차이를 이용한다. 이러한 차이점들의 정확한 본질을 미리 알고 있지 못하기 때문에 정제방법은 필연적으로 시행착오를 통해서 알게 된다. 세포에서 한 가지 균일한 단백질을 얻으려면 보통 다음과 같은 많은 방법들을 순차적으로 응용해 보아야 한다.1) 용해성수용액에 있어서의 단백질들의 용해도는 극성인 물 분자들과 단백질 분자들의 이온화된 원자단들 사이의 친수성 상호작용에 따라서 결정된다. 그러므로 기질 또는 방해물질과 같은 특이한 분자들에 대한 효소(또는 단백질)의 자연적인 친화성을 이용하는 친화 크로마토그래피가 매우 유용하게 사용된다. 단백질과 결합하는 분자를 아가로오스와 같은 비불용성인 지지체에 공유결합으로 결합시킨다. 다음에 이것을 적당한 단백질을 선택적으로 흡착하는 지지체로 사용한다.4) 전기영동법에 의한 분리단백질들의 알짜 전하는 그즐이 용해된 매질의 pH에 따라서 변한다. 따라서, 완총용액에 용해된 단백질 용액에 전기장을 가하면 단백질들은 차별적인 이동을 하게 된다. 흔히 사용되는 방법은 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동법이다.실험 방법1) DEAE-sepharose fast flow column 크로마토그래피가) Materials:target 효소: β-galactosidase from Kluyveromyces marxianussample 완충용액: 20mM sodium phosphate 완충용액 pH7.5(A)elution 완충용액: 1M NaCl 20mM sodium phosphate 완충용액 pH7.5(B)resine: DEAE-sepharose fast flow나) 방법DEAE-sepharose column 크로마토그래피1.)column packing준비된 column에 DEAE-sepharose resine 5ml를 packing한다.2.)column 평형20mM sodium phosphate 완충용액 pH7.5(A) 30ml로 평형을 이루게 한다.3.)sample loading이전시간에 투석한 cell extract 2ml을 column에 loading한다.4.)A buffer washingA buffer 20ml로 씻어낸다.5.)ElutionB buffer 30ml로 elution- 각 단계에서 얻어지는 fracrion들을 280nm에서 흡광도를 측정하여 단백링ㄹ profile을 작성한다.-각 단계에서 얻어지는 fraction들의 β-galactosidase profile을 작성한다.- 활성이 가장높은 fracrtion들을배크로마토그래피, 이온교환수지를 사용한 것을 이온교환크로마토그래피라고 한다.일반적인 실험 4단계로 나눌 수 있다.① 적당한 충전제를 선정하여 column을만든다.② column에 시료용액을 흐르게 하여 각 성분을 column 속에 층상으로 놓이게 한다.③ 적당한 용매를 흐르게 하여 층상의 각 성분을 완전하게 분리시킨다.④ 적당한 발색시약용액을 흘려 착색시키거나 또는 ③의 조작을 계속하여 column으로부터 순차적으로 흘러나오는 각 성분을 나누어 크로마토그래피를 얻는다.2. 다른 column들의 특징에 대해서 알아보자1) gel-filtration 크로마티그래피size에 의해서 분리하는 방법이다. 작은 양의 단백질의 혼합물을 다공성의 구슬로 채워진 column을 통과시키면 크기가 큰것일수록 빨리 침강하고 크기가 작은 것은 중간의 구슬에 있는 구멍을 빠져나오는데 시간이 오래 걸리므로 늦게 침강한다. 구슬은 비용해성이긴 하지만 polyacrylamide or agaarose or dextran 같은 매우 물을 좋아하는것도 있다.2) ion-exchange 크로마티그래피단백질의 net charge에 의해 분리하는 방법으로써 positively charged 단백질은 negatively chared bead에 결합하고 negativety charged 단백질은 결합하지 않고 바로 침강한다. 양성차지 단백질은 column에 결합한후 추출되는데 이것은 NaCl이 함유되어지 buffer에 의해서 분리되어진다.3) affinity 크로마티그래피단백질은 특별한 화학적 group에 대한 높은 친화력을 가진 것을 이용하는 방법이다. 한 단백질이 인식하는 작용기 X 또는 X의 receptor를 column에 공유결합으로 부착시킨다. column에 단백질 혼합물을 첨가한 다음에 완충용액으로 씻어서 결합하지 않은 단백질을 제겋나다. soluble 형태인 X의 진한 용액을 첨가여 원하는 단백질을 분리한다.4) High-Pressure liquid 크로마티그래피 (HPLC)고농도와 저농도의본다.

자연과학| 2003.11.09| 13페이지| 1,500원| 조회(1,244)

단백질정제, SDS-PAGE, 미생물학실험, 단백질의 농축과 투석

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