[동물발생학 실험 레포트]Exp. 4.Male sex organ(sperm, testis, seminal vesicle)Ⅰ. Introduction< Male sex organ>1) 정자(sperm) : 정원세포는 정소 내에서 체세포분열을 통해 askg은 수로 늘어나고 크기도 현저히 증가하게 되는데 이와 같이 커진 세포를 제1차 정모세포(primary spermatocyte)라 한다. 제 1차 정모세포는 제 1 감수분열 결과 2개의 크기가 작아진 제 2차 정모세포(secondary spermatocyte)로 되며, 제2 감수분열을 수반하여 더 작은 정세포를 형성하게 된다. 정세포는 정자완성 단계를 거쳐 운동성을 가진 정자로 분화하게 된다. 정자의 형태는 일반적으로 작은 두부와 가늘고 긴 채찍 같은 꼬리를 가진 구조로 생각하기 쉬우나 동물에 따라 매우 다양한 구조로 진화되어 왔다. 대부분의 정자는 핵, 첨체와 편모로 되어 있으며 핵은 고도로 농축된 염색질을 함유하고 있다. 첨체는 종에 따라 다양한 형태를 나타내며, 막이 융합하여 첨체 내의 효소가 방출하며 방출된 효소는 정자가 난자를 둘러싸는 부속층을 침투할 수 있도록 돕는다. 첨체와 핵은 정자의 두부 모양을 결정하며 실제 두부의 구조는 종에 따라 매우 다양하다. 정자의 꼬리는 난자를 향해 전진할 수 있는 편모운동을 일으키는 복잡한 구조이다.포유류의 정자만을 다시 정리하면, 두 주요 부위는 두부와 미부로서 두부는 핵과 첨체로 구성되어 있고 첨체는 두부의 앞 끝에서 핵을 둘러싸며 cap을 형성한다. 핵은 매우 농축된 염색질을 포함하고, 핵을 덮고 있는 첨체는 매우 단순한 구조를 한다. 첨체는 원형질막와과 핵막 사이에 끼워져 있으며 첨체막으로 둘러싸여 있다. 또 첨체의 내용물은 몇몇 가수분해효소를 함유하여 정자가 난자 근처에 도달할 때 첨체반응을 수반한다.2) 고환(testis, 정소) : 이것은 고환간막(mesochorium)이라고 하는 조직층으로 복막과 연결되어 있는데 그것은 마치 장간막의 장에 대한 역할처럼 체벽과 고환을 연결하는 교량 역할을 하며 혈관과 신경의 통로가 된다. 고환은 중간신장의 가장자리를 따라서 형성되는 생식융기(genital ridge)로부터 만들어진다. 생식융기의 피질부분은 퇴화하고 수질부분이 발달하면 고환이 된다. 따라서 대부분의 하등 척추동물에서는 중간신장의 앞부분과 밀접하게 관련되어 있는데, 이 부분은 부고환(epididymis)이라는 부속기관이 되어서 그것을 통하여 정자가 생식관(genital duct)을 통과하게 된다. 고등한 포유류에서도 중간신장의 부고환부분이 수컷의 생식기관의 일부분으로 보존된다. 포유류의 고환은 일반적으로 작고 난형이며 밀착된 주머니 모양의 결합 조직인 백색막에 싸여 있다. 그 보다 더 바깥쪽은 체강을 둘러싸고 있는 복막과 상동인 중배엽성의 고환쪽판이 덮고 있다. 질긴 백색막 아래에는 혈관이 공급되어 있는 좀더 느슨한 혈관막이 있다. 배색막의 한쪽 면으로부터 다른쪽 면으로 결합조직들이 뻗어나가서 고환 전체를 쐐기 모양의 고환소엽(lobuli testis)이라 한다. 고환에서는 정자발생과 호르몬 분비의 두 가지 기능이 있다. testosterone에는 정낭을 발육시키는 작용이 있다. 대사의 조정에도 관여하며 단백동화작용을 촉진하는 동화 호르몬으로서의 작용도 있다.This is the microscopic appearance of normal testis. The seminiferous tubules have numerous germ cells. Sertoli cells are inconspicuous. Small dark oblong spermatozoa are seen in the center of the tubules.3) 정낭(seminal vesicle) : 정낭은 정관이 끝나는 부위에 있으며, 즉 방광의 후면 하부에 따라 존재하는 한 쌍의 소낭으로 직장 앞에 위치하고 있으며, 정액을 만드는 곳으로서 사정액의 약 3분의 2는 정낭에서 나오는 분비액으로 구성되어 있는데, 정낭의 분비액에는 사정된 정자가 잘 움직이도록 활동에너지를 부여하는 영양물질과 완충물질이 들어 있다. 따라서정액의 점조성 성분을 분비하여 정자의 대사를 유지하는 영양분을 공급하게 된다. 그리하여 정자의 운동을 가능하게 하지만 정자를 저장하지는 않는다. 정낭은 정관에서 파생되어 확장된 낭선이며 오른쪽과 왼쪽에 각각 한 개의 정낭이 있고 사정 시 정자와 알칼리성의 끈끈한 용액을 혼합하여 배출하며, 이 알칼리성의 끈끈한 용액은 정자와 운동성과 신진대사에 필수적인 성분인 과당과 단백질로 구성되어 있습니다. 정낭의 분비물은 정액량의 대부분을 이룬다. 정낭의 벽은 바깥막과 근육층 및 점막으로 이루어진다. 바깥막에는 탄력섬유가 많고, 점막은 1,2,3차 주름 등으로 복잡하게 분지되어 복잡한 분비공간을 형성하는데, 이 공간들은 절단면상에서 서로 분리되어 보이지만 모두가 속공간과 서로 통한다.
[동물발생학 실험 레포트]Exp. 3.Female sex organ(oocyte, ovary, oviduct, uterus)Ⅰ. Introduction- female sex organ암컷의 생식기관 은 난소, 난관(자궁관), 자궁, 질 및 외부생식기로 구성되어 있다. 이 중에서 난소(ovary), 자궁(uterus), 난관(oviduct)에 대해서 알아보고, 난모세포(oocyte)에 대해 알아본다.1) 난소(Ovary) : 난소는 복강 내에 위치하고 있는 한 쌍으로 된 암컷의 성선으로서 estrogen, progesterone 등의 호르몬을 분비하고 난자를 생성하는 기능을 한다. 난소의 형태와 크기는 가축의 종에 따라 다른데 소와 면양은 편도상이지만 돼지의 경우는 포도상이고 무게도 소도 10-21g, 돼지나 면양은 3-4g정도로서 차이가 있다. 난소는 생식융기로부터 형성되며 수질은 퇴화되고 피질이 발달되어서 이루어진 기관이다. 난소는 중앙에 수질(medulla)이 있고 그 바깥쪽에 피질(cortex)이 있으며 난소의 수질은 기질(stroma)과 많은 원시 난포 (primordial follicle)로 구성되어 있다. 또, 수질은 불규칙적으로 배열한 섬유성 결체조직과 신경계, 혈관계로 되어 있으며, 피질에서는 난포의 형성과 성숙, 배란, 황체의 형성 및 퇴화 등 일련의 현상이 주기적으로 반복되면 호르몬이 분비된다. 난소는 난자를 형성하는 기능과 호르몬을 분비하는 기능도 갖는다. 이 기관은 단순히 복막(peritoneum)에 부착되어 있거나 피막에 싸여서 난소간막(mesovarium)으로 체벽에 연결되어 체강내에 자유로이 매달려 있거나 토끼와 고양이에서처럼 복막 내에 매몰되어 있을 수도 있다. 오리주둥이의 난소는 소수의 크게 돌출한 난자의 탓으로 다소 엽상을 하고 있어서 포도송이와 비슷하다. 그러나 대부분의 포유류의 난소는 비교적 작고 둥글며 외형이 밋밋하고 백색막(tunica albuginea)이라는 섬유성 조직의 치밀한 층으로 둘러싸인다. 그 아래에는 피질이 기질이 풍부한 소강난소(lacunate ovary)이다. 이들의 성숙한 난자들은 난소의 외벽을 통해서 직접 체강 안으로 떨어지고 난관의 개구부에 의해서 받아들여진다. 성체의 임신하지 않은 쥐의 암컷은 보통 생식상태가 되면 난소 속에 성숙된 또는 잘 발달된 난포(follicle)가 들어있다. 이와 같이 난소는 콩팥 바로 뒤에 난포덩이처럼 보이며 보통은 지방체 속에 파묻혀 난소간막(mesovaria)에 의해 콩팥 뒤의 등쪽 체벽에 붙어 있다. 성숙한 난포는 그라프난포(Graafian follicle)라 부르며 난자가 들어있다. 큰 황체(corpora lutea)도 볼 수 있다.기능을 정리하면, 난소는 여성의 생식선으로서 난자를 생산하고 여성호르몬과 소량의 남성 호르몬을 생산한다.2) 자궁(Uterus) : 자궁은 포유동물에서 볼 수 있는 암컷의 생식기관 중의 하나로서, 수정란이 착상하여 일정기간동안 발육되는 기관이며 난관과 접해있는 원주형의 기관으로 일반적으로 한 쌍의 자궁각, 자궁체, 그리고 자궁경으로 구성되어 있으나 각 부분은 상대비와 형태는 가축의 종에 따라 다르다. 체내수정을 하는 대부분의 동물은 난관의 일부가 변해서 자궁을 형성한다. 이 구조는 골반 안에 들어 있으나 임신 중에는 복부까지 이른다. 자궁몸통(자궁체, uterine body)은 두꺼운 근육층을 가지고 있으며 태아가 자람에 따라 200배 이상 확장될 수 있다. 질과 연결된 부분은 자궁목(자궁경, uterine cervix)이라고 하며 다소 질강내로 돌출되어 있다. 개구리에서도 번식기에는 난관의 기부가 팽대하여 일시적으로 알을 보관하는 자궁을 이룬다. 태생 경골어류나 판새어류는 잘 발달하고 혈관이 풍부한 자궁을 가진다. 그러나 자궁은 포유류에서 가장 잘 분화되어 있다. 하등 척추동물에서는 자궁은 난관처럼 항상 이중구조이나 포유류에서는 질이 단일화됨에 따라 자궁도 좌우의 것이 융합하는 경향이 있다. 단공류에서는 질이 없고 2개의 분리된 중복자궁(uterus duplex)을 가지며 유대류는 질은 있ornis)을 이룬다. 한편, 영장류와 사람에서는 단일한 자궁에 2개의 가느다란 난관이 이어진 형태의 단순자궁(단일자궁, uterus simplex)을 갖는다. 자궁 몸통을 관찰하기 위해서는 질과 보다 후방을 노출해야 하다. 이를 하기 위해서는 항문 바로 배쪽에 있는 바깥비뇨생식구멍(external urogential opening)을 먼저 확인하고 그 둘레의 털을 깎아낸 다음 근육 아래에 있는 두덩결헙을 분리시켜 생식기관을 노출시키기 위하여 다리는 벌린다. 여러 부위를 확인한 후 비뇨생식동굴, 질과 자궁을 열 수 있다. 실제로 두 개의 완전한 자궁으로 나누어져 있으며 그 각각은 따로 질(vagian)에 개구되어 있다. 분리된 자궁은 자궁뿔(horns or cornua)에 해당된다. 질로의 개구에서 자궁뿔(cornua)사이의 두꺼운 벽은 자궁목(cervix)이다.자궁은 수축운동에 의해 정자의 상행을 용이하게 하고, 자궁유를 분비하여 자궁내로 진입한 착상전의 수정란에 대해 영양물질을 공급함과 아울러 태반형성과 태아발달의 장소가 된다. 분만시 자궁의 강력한 수축은 태아의 만출을 용이하게 하고, 분만 후에는 자궁퇴색에 의해 분만이전의 상태로 회복된다. 일반적으로 태아는 자궁각에서 자리를 잡고 발달한다. 자궁경은 질부에 돌출한 근육층의 두껍고 좁은 부분으로 내주에 자궁경관이라는 가는 관이 있다. 자궁경관은 발정시외에는 폐쇄되어 있지만 발정시에는 이완하여 정자의 진입을 가능하게 한다. 또한 발정시 점액이 분비되어 외음부로 배출되고 , 임신 중에는 다량의 점액이 관강을 페쇄하여 세균 및 이물질의 침입을 방지한다. 그리고 분만시에는 자궁경관이 이완되어 태아의 만출이 이루어진다. 자궁벽은 외막, 근층, 내막의 3층으로 나눠지며, 월경주기에 따라 자궁내막은 큰 조직학적 변동을 주기적으로 겪게 된다.동물의 종류에 따른 자궁을 다시 살펴보면, 양쪽의 자궁이 유합되지 않고 독립하여 있는 중복자궁(대부분의 설치류·유대류·코끼리 등의 자궁), 외형적으로는 제법 유합되어 있지만 내부는 난관) : 나팔관은 일명 수란관, 난관, 자궁관이라고도 하며, 배란된 난자와 사정된 정자를 받고 또 난자와 정자가 수정하여 수정란을 만들면 이것을 자궁으로 수송하는 역할을 하는 여성 내부 생식기관이다. 판새어류의 난관복강구멍(ostium abominale)은 전신장과 연결되었던 도관으로부터 유래된다. 그러므로 체강 안의 난자를 받아들이는 난관복강구멍은 본래 체강액을 배설하는데 사용되었던 신장개관 입구와 상동이다. 다른 척추동물에서는 발생초기에 중간신장의 옆에 중간신장옆관, 즉 뮬러씨관(Mullerian duct)이 발생되어 난관을 형성한다. 많은 알을 일시에 낳는 개구리 같은 동물에서는 산란기 동안에 난관이 일시적으로 매우 길어지고 선회되어 있다. 알을 낳기 전의 암탉난관은 15~18cm의 길이인데 반하여 산란을 시작하면 4배로 늘어난다. 자궁관은 배란된 난자를 가중으로 운반하는 매우 짧고 꼬여 있는 관으로 각 자궁관은 난자를 받아들이는 팽대된 유리단인 자궁관복강구멍(ostium)을 갖는다. 각 자궁관의 반대끝은 자궁뿔로 든다. 난관은 누두부, 팽대부, 협부로 구성된 관상의 굴곡 된 기관으로, 누두부는 난소표면의 일부를 덮고 있거나 가까이 위치하여 배란된 난자를 수용하기가 용이하도록 되어 있다. 난관내에서는 정자의 수정능 획득, 수정 및 난할이 이루어진다.The epithelium lining this portion of the oviduct (Ep) is a simple columnar type. The nuclei of these cells is basally located.The protein-secreting nature of the submucosal glands is also fairly obvious, although these are not so heavily stained as those of the magnum. The lumen of the crypt is filled with secretory material that lies on topmicrograph), the muscularis (M), and the mucosa (MU). The folding of the mucosa increases the surface area for nutrient delivery, and the cilia on the epithelial cells lining the lumen (L) propel the egg / zygote to the uterus.4) 난모세포(oocyte) : 난모세포(oocyte)는 직경이 25~30㎛ 정도의 큰 세포로, 하나 이상의 뚜렷한 핵소체(nucleolus)와 진정염색질(euchromatin)이 많은 큰 핵이 특징적이며, 핵은 세포질의 한쪽으로 약간 치우쳐 있으며 난자형성 동안 많은 변화를 거쳐 엄청난 크기로 성장한다. 난소에서 만들어진 생식원 세포는 정자 형성 때와 마찬가지로 증식기에 이르면 체세포 분열을 거듭하여 난원세포를 만든다. 난원세포는 감수분열에 들어가기 전인 생장기에 많은 양의 난황 물질을 세포질에 축적하므로 그 크기가 매우 커진다. 이처럼 거대해진 세포를 제 1 난모세포라고 하는데, 제 1 난모세포는 감수분열을 거쳐 1개의 난자와 3개의 극체를 만들게 되고, 결국 난자만이 생식에 이용되고 극체는 퇴화되어 버린다. (1차 난모세포는 1차 감수분열의 전기에 들어가서 발생이 멈춘다. 동물이 생식활동을 할 때까지 더 이상의 제1난모세포의 발달은 없다. 개구리는 성체가 된 후 1년에 한 번 보통 봄에 일어난다. 수 천개의 제1난모세포가 세포성장을 시작하는데 하나의 난자는 여포(follicle)라는 세포 집단으로 둘러싸여 있다. 개구리 알의 부피는 이시기에 백만배 이상 증가한다. 제1난모세포가 성장이 멈춤에 따라 제1감수분열도 완결된다. 세포질은 고르게 분포되지 않고 한쪽 세포에 몰리는데 다른 세포를 극체 (polar body, 제2 난모세포)라 한다.) 이러한 현상은 수정되었을 때의 세포질 양을 일정량 이상 유지하기 위한 방편으로 보고 있다. 난모세포(oocytes)태아다.
[동물발생학 실험 레포트]Exp. 7.Chick embryoⅠ. Introductionembryo(배아)는 일반적으로 난생·난태생을 하는 동물에서는 2세포기부터 개체발생을 마치고 부화(수정막·난막을 가수분해하거나 파괴하고 밖으로 나오는 것)하여 유생으로 되기 전까지의 개체를 배라 한다. 또 태생을 하는 동물은 2세포기 이후 자궁벽에 착상하여 발육해서 모체로부터 출산되기 전까지의 개체를 배로 보며, 특히 이 배를 <태아>라 한다. 이상과 같이 다세포동물에서는 발생을 마치고 단독적으로 이동하고 먹이를 섭취할 수 있는 유생으로 되기 전까지의 개체를 배라 하는 것이며, 특히 배의 시기를 ‘배기’라고 한다. 일반적으로 동물의 배는 초기배 (early embryo)와 후기배(late embryo)로 나눈다. 초기배는 난할이 진행되어 할구가 증가함에 따라 순차적으로 형성되는 2세포기, 4세포기, 8세포기, ···의 배, 열매모양의 상실배, 공모양의 포배, 그리고 포배에서의 형태형성운동·배엽분화로 형성되는 낭배의 총칭이다. 또 후기배는 낭배의 내배엽·중배엽·외배엽을 바탕으로 하여 진행되는 기관형성에 의해 순차적으로 형성되는 신경배·미아배 등 배의 총칭이며, 다 발육된 후기배가 부화 또는 출산됨으로써 유생이 탄생하게 된다. 일반적으로 배기 초기에 포배 형성까지의 과정에서 일어나는 세포분열(체세포분열)을 난할이라 하고, 이것이 반복되는 시기를 난할기라 하는데, 이 난할기까지의 세포(할구)는 미분화 상태이며, 포배기에서부터 낭배기에 걸쳐서 형태형성운동·배엽분화가 일어남으로써 비로소 배의 세포는 분화의 경향을 띠게 된다. 또 난할은 딸세포의 생장기를 거치지 않고 반복되므로 세포주기가 짧고 세포 증식 속도가 크다. 따라서 초기배의 세포는 난할이 반복될수록 크기는 점점 작아지고, 또 수는 급속도로 증가한다. 즉 초파리의 난할기의 세포 증식 속도는 성체인 경우의 100배 이상이다. 이상과 같이 난할의 반복으로 세포가 작아지고 수가 증가하게 되면, 세포들 사이에 간극이 생겨 점점 확대된다 할강이 없거나 거의 없으며, 포배는 복판의 넓은 할강을 세포충(할구층)이 둘러싼 공모양으로 된다. 또 낭배 형성 과정에서는 주로 식물극 쪽의 외배엽이 할강으로 함입됨으로써 원장이 형성되어 할강은 원장벽, 즉 내배엽과 외배엽 사이에 끼어 있는 상태로 되고 배는 대체로 두 겹의 세포층으로 둘러싸인 주머니모양의 낭배로 된다. 이어서 외배엽과 내배엽 사이에, 내배엽 또는 단세포 기원의 중배엽도 완성된다. 이상과 같이 형태형성운동에 의한 배엽분화가 이루어지면, 세포층끼리 서로 접착하게 되어 순차적·단계적인 형성층 유도작용이 활발해진다. 이 결과 신경관·체절 분화 등으로부터 시작되는 기관형성이 질서정연하게 진행됨으로써 신경배로부터 시작되는 후기배가 완성되어 유생으로서 부화, 출산하게 된다.* 10기(29~30시간)이 시기의 가장 현저한 변화는 뇌와 척수원기(spinal cord rudiment), 그리고 9~10쌍의 체절변화이다. 뇌는 원시뇌포(primary brain vesicle)로 발단되고, 안포 역시 크게 발달된다. 그러나 신경관은 아직까지 완전히 닫힌 단계가 아니며, 전반부는 신경공(neuropore), 후반부는 아직까지 신경습(neural fold)이 접합되지 않은 상태이다. 체절이 생긴 후반부에는 아직도 체절화되지 않은 중배엽을 가지고 있다. 이 시기에는 배아 자체가 평평한 구조로 난황 위에 떠 있는 것과 같은 구조를 갖고 있다. 초기 소화관(primitive gut)의 앞부분은 폐쇄되어 난황낭(yolk sac)과 구분되어 있으나 그 전단후부는 복측부가 난황과 연접하여 열려 있다. 전신(pronephros)이 발생되기 시작하고 혈관계가 발생을 시작하며 좌우심장원기가 발생하기 시작하여 유합된다. 또 첫 번째 대동맥궁들(aortic arches)이 발생하고 있다. 배아자체는 좌우대칭을 유지하고 있다.*15기(50~55시간)배아의 머리부위는 뇌가 중뇌 근처에서 직각으로, 우측으로 굴절하여 난황 위에 놓이게 되므로 뇌구조의 관찰이 용이하다. 눈은 이미 동공내에 렌완전히 분리되어 있지 않다. 귀의 원기가 이미 밖으로 돌출되고, 코의 원기는 표피에서 두꺼워진다. 측뇌부는 크게 발달되어 뇌신경절(cranial ganglia)을 형성하고 있다. 체절의 수는 크게 증가하고 있으나 후반부는 아직도 태절성을 갖지 않은 중배엽상태이다. 신경관도 아직 완저히 닫혀지지 않고 원조가 흔적적으로 보이며 분화는 중단되어 있다. 3쌍의 인두낭이 형성되고 혈관계는 현저하게 발달되는데 심장은 크게 돌출되어 두뇌부 아래에 자리잡으며 1쌍의 복대동맥(ventral aorta)이 1쌍의 대동맥궁(aortic arches)으로 혈액을 보낸다. 배대동맥(dorsal aorta)은 전후에 쌍으로 존재하고 dTdmsk 정중면에서 융합된 상태이다. 전주정맥(anterior cardinal vein)이 잘 발달되어 있으나 후주정맥쌍은 매우 적다.* 19기(68~72시간)두부와 체부의 전반부가 심하게 굴곡되고 배아 자체가 보다 좌측으로 눕게 된다. 신경관(neural tube)과 중배엽의 체절화가 완료되어 배아의 후반부가 아래쪽으로 굽는 꼬리를 형성한다. 뇌의 발생이 크게 진전되어 단뇌가 발달된다. 코의 원기가 주머니형태를 보이고, 레즈와 이포(ear vesicle)가 표피에서 완전히 분리된다. 뇌신경절과 뇌신경이 분화되어 나타난다. 입은 개구되어 4쌍의 인두낭이 보이며, 앞의 3쌍은 새열로 외부와 연결된다. 소화기계도 분리되기 시작하여 인두낭을 가진 인두, 폐원기(lung rudiment)를 가진 식도, 간원기(liver rudiment)를 가진 위십이지장부로 구분된다. 원장의 중앙부는 아직까지 난황과 연결되어 있으나 후장부위는 완전히 분리되어 있다. 또 요막이 후장의 복부에서 돌출되어 발생된다. 제 2,3,4의 동맥궁(aortic arches)이 생기고 첫 번째 동맥궁은 퇴화 소멸되어 3쌍의 동맥궁이 관찰된다. 내경동맥(internal carotid arteries)이 발달하며 배대동맥(dorsal aorta)이 크게 발달된다. 난황동맥(vitelline ar 아직까지 쌍으로 존재한다. 쌍으로 된 난황정맥은 하나로 융합하여 정맥동(sinus venosus)으로 이어진다. 난황정맥(extraembryonic vitelline vein)이 매우 크게 발달하며 정맥계가 동맥계보다 체표에 놓이게 된다.< Embryo 관찰하기>1. Collect equipment at your desk: dissection scope and lamp , dissection kit , iris scissors. And, all at 39C: Ringer's solution , depression slide petri dish bottom (or top). Cut a ring of filter paper, size of a quarter with a 5/8 hole which will encircle the embryo. - fiter paper를 링 모양으로 자른다. embryo를 둘러싸게 된다.2. Pick up an egg from the incubator, keeping egg in same orientation as in incubator and keep it warm with a lamp close to its surface. With a pencil, mark a circle 3/8th inch bigger diameter than a quarter on upper surface of egg.Place the egg in petri dish with paper towel cushion underneath. Gently score with a file around the circle with repeated long slow strokes. Do not press hard, or egg will break.3. With scalpel and/or tweezers, flick off the shell inside the circle, trying not to break inner shell membrane. It is not nece but you need room to cut the shell membrane in the next step.4. With iris scissors, cut inner shell membrane close to shell. The yolk will be floating near the surface with the embryo on top. Be careful not to pierce the vitelline membrane which surrounds and contains the yolk, or else you will obscure the operation with yolk. Flake off additional shell if more clearance is needed. The embryo should be float in the center top.5. Carefully place filter paper circle so that it encircles the embryo (still floating in the center of the opened egg, at the top?). Trim paper if necessary before putting it in place.(In this image, the egg has broken into the petri dish, but the embryo is still visible.)6. Carefully cut vitelline membrane just outside of the filter paper to free the assembly. Do not press down or the assembly may sink and be lost in yolk. (Poke down with one blade, sting up and lift slightly, cut the membrane.)7. When cut free, carefully grasp with tweezers both the membrane ably.
[동물발생학 실험 레포트]Exp. 6.RNA analysis (liver, testis, spleen, muscle)Ⅰ. IntroductionRNA와 DNA는 nucleotide가 phosphodiester 결합으로 연결된 고분자화합물(polynucleotide)이다. 인산은 nucleoside의 오탄당의 5'와 3' 위치의 히드록시기를 phosphodiester 결합으로 연결되어 있다. 구조식을 보면 윗쪽으로 더듬어 가면 5'의 위치가 유리되어 있는 말단에 도달하며 이 부분을 5'-말단이라 한다. 반대로 이 구조식을 아랫쪽으로 더듬어 가면 3'-말단이 있다. 5'-말단, 3'-말단이라는 말은 단백질의 N-말단, C-말단과 같이 흔히 사용된다. DNA나 RNA의 구조를 간단히 나타내기 위해 각 nucleoside가 함유하는 염기의 기호를 사용하여 왼쪽에서 5' 말단부터 AGTTCTAG 또는 AGUUCUAC로 나타내는 경우가 있다. RNA를 구성하는 오탄당은 D-ribose이고 함유된 염기는 adenine, guanine, uracil, cytosine이며 주로 세포질 중에 존재한다. RNA에는 messenger RNA(mRNA), ribosomal RNA(rRNA), transfer RNA(tRNA)의 3종류가 보통의 세포 중에 함유된 RNA 이다.< Phosphodiester 결합으로 된 핵산의 구조>1) mRNAmRNA의 분자량은 대장균의 경우 25,000∼1,000,000이고 구성 nucleotide의 수는 75∼3,000이며 세포내 RNA 총량의 2% 정도이다. mRNA는 핵내에서 DNA의 nucleotide의 배열로 기록되어 있는 유전정보의 일부에 근거하여 합성된다. 그 결과 mRNA 분자는 DNA 분자의 일부와 염기배열이 상보적으로 되어 있으며 분자 중에 DNA의 유전정보가 전사(transcription)되어 있다. mRNA는 ribosome이라는 단백질과 RNA의 복합체인 소립자와 결합하여 이 입자상에서 mRNA상에 염기배열로 기록되어 있는 아미소결합을 하지 못하므로 루프형으로 되어 부풀어져 있다. Anticodon 부분에는 1종류의 아미노산에 대응하는 3개의 nucleotide가 존재하며 mRNA 분자상의 대응하는 3개의 nucleotide 단위의 codon과 상호작용하여 단백질의 아미노산 배열을 결정한다. 아미노산이 결합하는 부분(amino acid arm)은 3' 말단이 모든 tRNA에 공통으로 CCA의 구조를 가지고 있으며 그 말단 adenosine의 3'-OH에 그 tRNA와 대응하는 아미노산이 acyl화하여 결합한다. 효모 tRNA의 3차원 입체구조는 그림 15.9와 같으며 클로버잎 모양이 L 자형으로 겹쳐진 입체배위(conformation)를 하고 있음을 알 수 있다.3) rRNArRNA는 ribosome을 구성하는 RNA이다. 대장균과 같이 핵이 없는 생물(원핵세포)에서는 5S(분자량 ∼35,000), 16S(분자량 ∼550,000), 23S(분자량 1,100,000)의 3종류의 rRNA가 존재하고 진핵세포에는 5S, 18S, 28S의 3종류의 rRNA가 존재한다. 이들 rRNA는 50종류의 단백질과 복합체를 만들어 ribosome을 형성한다.RNA 분석은 Northern blotting을 이용하여 이뤄진다. RNA의 크기나 발현량의 정보가 얻어져 mRNA의 발현이 어느정도 이루어졌는지 알 수 있다. 기본적으로 Northern blotting은 Southern blotting과 동일하며 DNA(또는 RNA)를 전기 영동한 후 filter 상에 고정하고 RNA probe로 hybridization 하여 표적 RNA를 검출한다. 그러나 RNA는 이차구조를 만들기 쉽기 때문에 gel 중에서 변성된 상태로 전기 영동을 시행한다.전형적인 포유동물세포는 약 10-5μg의 RNA를 함유하고 있다. 이중 80∼85%는 ribosomal RNA (주로 28S, 18S, 5S)이며 10∼15%는 여러종류의 소분자 RNA(transfer RNA, small nuclear RNA 등)이다. 이런 RNA들은 된 단백질 역시 핵산으로부터 분리된다. 따라서 이들 시약을 이용하여 RNA를 분리하면 RNase가 풍부한 췌장조직에서도 완전한 형태의 RNA를 분리할 수 있다.① Guanidinium/cesium chloride 방법 : 이 방법은 세포나 조직을 guanidinium thiocyanate로 파괴한 다음 균등액을 CsCl 용액 위에 얹어 원심분리하는 방법이다. CsCl 용액 (>1.8 g/ml)에서 RNA의 밀도는 다른 세포 구성성분보다 크므로 원심분리하 는 동안에 DNA나 단백질은 용액내에 떠 있는 반면 RNA는 침전을 형성하게 된다.② Guanidine HCl 방법③ Guanidinium thiocyanate 방법 : RNase가 대량 포함된 조직이나 세포로부터 RNA를 분 리하고자 하는 경우 첫번째 과정에서 guanidinium thiocyanate가 포함된 용액을 사용함 으로써 양질의 RNA를 분리할 수가 있다.④ Poly(A)+RNA 분리 : 전체 RNA로부터 polyadenylated RNA를 분리하기 위한 여러 방법 이 개발되어 왔다. 최선의 방법은 oligo(dT)-cellulose를 개발한 chromatography이며 이 는 Gilham(1964)의 방법에 의해 준비를 하거나 상품화된 것을 사용하면 된다. Oligo(dT)-cellulose ml 당 10 mg 정도의 RNA까지 분리가 가능하다.Northern blot hybridization은 분리한 총 RNA, 혹은 poly(A)+RNA에 존재하는 특정 mRNA 분자의 크기와 양을 결정할 수 있는 효과적인 방법이다. 우선 RNA를 denaturing agarose gel상에서 전기영동하여 그 분자량 크기에 따라 전개시킨 다음 활성화된 cellulose, nitrocellulose, glass 혹은 nylon membrane에 옮긴다. 분석하고자 하는 RNA는 방사선 동위원소로 표식된 특정 DNA 혹은 RNA와 hybridization된 후 자가방사법(autoradiography)을 시행함으로tion하여도 nitrocellulose에 결합된 RNA의 손실이 적다는 것인데, 단지 nitrocellulose는 일반적으로 두차례 이상의 hybridizaion과 세척과정에 견뎌낼 수 있을 만큼 강하지 못한 결점이 있다. 이러한 문제는 전하를 띠도록 변형시킨 nylon membrane이 개발되어 해결되었다. Nylon membrane은 수차례에 결친 hybridization에도 견딜 수 있으며 hybridization signal도 큰 변화가 없다. 그러나 nylon의 경우 background hybridization이 nitrocellulose에 비해 상당히 높다. 본 장에서는 RNA의 전기영동, nitrocellulose 혹은 nylon membrane으로의 이동, 결합된 RNA와 동위원소로 표지된 probe와의 hybridization하는 방법에 대하여 설명한다.1) Formaldehyde agarose gel에서 RNA의 전기영동이 방법은 Lehrach 등(1977)과 Goldberg 등(1980)의 방법으로부터 변형된 것이다. 주의사항으로 formaledehyde가 기화성이 높고 독성이 강하므로 formaldehyde가 포함된 용액은 항상 chemical hood에서 준비되어야 한다는 점이 있다.2) Northern blot hybridization전기영동이 끝난 후 크기에 따라 전개된 RNA를 nylon membrane(HybondTM-N; Amersham, UK)에 이동시킨다. Glyoxal 존재하에 전기영동된 RNA의 경우 곧바로 nylon membrane에 transfer해도 되지만 formaldehyde를 함유한 gel의 경우 transfer하기 전에 증류수로 수차례 세척하여 formaldehyde를 완전히 제거하여야 한다. 또한 gel 농도가 1% 이상이거나 gel 두께가 0.5 cm 이상, 또한 분석하고자 하는 RNA의 크기가 2.5 kb 이상인 경우 0.05 N NaOH에 gel을 약 10여분 담가 놓는다. 이렇게 함으로써 RNA를 된 세포에서 특정 유전자의 발현을 쉽게 관찰할 수 있는 방법이다. 최근 이 방법은 두가지 면에서 개선되어 사용되어지고 있다.① 시료를 membrane에 일정하게 가하는 여과기구(filtration manifolds)의 개량으로 많은 수의 시료를 동시에 동일한 형식(크기 및 양)으로 membrane에 가함으로써 densitometer를 사용할 경우 정량화가 가능해졌다. 이러한 여과 기구들은 시료를 가하는 일정한 수의 dot 혹은 slot 형태의 well이 있는 합성수지로 된 block과 이 block이 맞물려 흡입력을 가해주는 platform으로 구성되며 이 사이에 membrane을 장치한 후 흡입력을 가하면 시료가 membrane 에 침착될 수 있게 고안되어 있다.② 분획되지 않은 세포질내 특정 RNA의 농도를 측정하는 방법으로 slot blot이 개발되어 새로이 배양되거나 냉동되었던 세포나 조직으로부터 신속하고 용이하게 연구할 수 있게 되었다.4) RNase Protection AssayRNase Protection Assay(RPA)는 특정 mRNA를 검출하는 방법으로써 Northern blot hybridization 처럼 정량적인 방법으로 사용되어질 수도 있고, exon-intron 구조와 같은 topological feature를 측정하기위해서도 사용되어질수 실험방법이다. mRNA에 상보적인 RNA probe(riboprobe)를 만들어서 RNA와 hybridization시킨 다음 single strand RNA를 특이하게 절단하는 RNase로 hybridization되지않은 RNA를 제거한후, denaturing acrylamide gel에 전기영동하여 분석한다. S1 nuclease mapping와 마찬가지로 확인되는 RNA probe의 크기로 exon-intron의 junction이나 전사시작부위를 추측할 수 있다. 그리고 RNA probe의 양을 test mRNA보다 과도하게 사용하면 autoradiographic signal의 강도는 시료내의
[동물발생학 실험 레포트]Exp. 9.Negative feedback system(Ⅰ): hemiovariectomyⅠ. Introduction생리적 조건하에서 혈액 내 호르몬 수치는 호르몬을 분비하는 선과 표적 조직사이에서, 때로는 다른 중간선을 통하여 일어나는 민감한 신호에 따라 여러 동적 평형기전에 의하여 항상성(homeostasis)이 유지된다. 특히 hypothalamic-pituitary target gland system 에서는 negative feedback 조절이 이루어지는데, hypothalamus에서 분비되는 releasing 호르몬은 뇌하수체 전엽 호르몬 합성과 유리를 증가시키고, 이것은 혈액을 통하여 표적 기관에 운반되어 표적기관 호르몬의 합성을 증가시킨다. 표적 기관에서 형성된 호르몬이 많으면 hypothalamic 호르몬 합성과 작용을 감소시키고, 반대로 표적기관에서 형성된 호르몬이 낮으면 hypothalamus를 자극하여 hypothalamic releasing 호르몬의 합성과 유리를 증가시켜 표적기관 호르몬 합성과 유리를 증가시킨다. hypothalamic-pituitary target gland system에서는 “short-loop"와 ”long-loop" feedback 억제에 의해서 조절된다. 이와 같은 조절 loop는 부신, 갑상선, 고환 및 난소와 같은 내분비선이 각각 hypothalamic-pituitary target gland system을 이루어 같은 기전에 의한 feedback 조절이 이루어진다. 호르몬이 표적 세포에 작용함으로써 혈중 농도가 변동되는 여러 대사물이나 기질을 통해서 feedback 조절이 일어나는 다른 경우가 있다. 즉 혈당이 높으면 췌장의 β-cell을 자극하여 insulin 유리를 증가시켜 여러 세포내로 포도당 운반이 증가되고, 포도당 산화가 증가된다. 그 결과로 혈장내 포도당 치가 삼소하게 되어 췌장으로부터 insulin 유리가 감소되는 feedback 조절 현상을 볼 수 있다.다시 정리하면, 내분비조직의 분비작용은 feedback 기구에 따라 음성적으로 조절된다. 즉, 호르몬의 농도나 호르몬에 대한 표적 조직의 반응이 호르몬의 합성 혹은 분비에 억제효과를 나타낸다. 이러한 feedback 작용에는 짧은 회로와 긴 회로가 있다. 짧은 회로에서는 표적 조직의 생성물이나 그 조직에 나타난 효과가 그 호르몬을 생성하는 내분비조직에 직접 작용한다. 이러한 작용은 negative feedback일 경우 표적조직에 나타나는 효과의 방향과는 반대 방향으로 나타난다. 즉, 호르몬의 혈액 내 농도가 증가함에 따라 그 호르몬은 내분비조직에 작용하여 호르몬 분비를 억제함으로써 혈액 내 호르몬의 농도를 떨어뜨린다. 긴 회로에서도 위에서 설명한 것과 동일한 조절기구가 작용한다. 그러나 조절단계가 짧은 회로에서 보다 더 복잡하고 많다. 따라서 조절단계의 수에 관계없이 조절효과를 나타내기 위해서는 조절단계에서 일어나는 부호 전환의 횟수가 홀수로 일어나야만 한다. 만약 두 차례의 부호 전화의 일어난다면 다시 positive로 그 효과가 전환되기 때문에 전체적인 효과는 양성적인 결과가 나타난다.negative feedback 조절작용은 다른 종류의 내분비선의 분비를 자극하는 뇌하수체 호르몬의 경우에서도 찾아 볼 수 있다. 즉, 뇌하수체의 호르몬 분비는 뇌하수체 호르몬의 자극을 받아 분비되는 호르몬에 의해 억제될 수 있다. 예를 들어 뇌하수체에서 분비되는 생식선 자극호르몬(gonadotrophic hormone)은 남성 생식소에 작용하여 테스토스테론을 분비시킨다. 이 때 테스토스테론의 농도가 상승하면 이러한 호르몬의 농도상승 자체가 뇌하수체에 신호로 작용하여 뇌하수체로부터 생식선자극 호르몬의 분비를 억제하게 된다. 물론 내분비선(생식선)에서 분비되는 호르몬이 뇌하수체에 작용하는 신호가 될 수도 있지만 호르몬에 의해 나타나는 생리적인 반응이 신호로 작용할 수도 있다. A very simplified scheme of the neural and humoral connections between the differentlevels of the two sides of the neuroendocrine system. L, left side; R, right side; 1, neurons producing hypophysiotropic neurohormones; 2, hypophysiotropic neurohormones; 3, pituitary tropic hormones; 4, target endocrine gland hormones. Broken lines indicate humoral connections. : 호르몬과 호르몬, 호르몬과 신경의 상호 조절에 의한다.① 음성 피드백 : 마지막의 반응이 자극의 크기를 억제시켜 항상성을 유지하게 하는 과정 예) 체온 조절, 혈당량 조절, 수분량 조절 등② 양성 피드백 : 마지막 반응이 원래의 자극을 한층 더 증가시키게 반응을 증대시키는 과 정/ 예) 옥시토신의 분비량 증가와 자궁벽 수축에 의한 출산 등 : 호르몬의 양이 호르몬을 방출하는 기관에 작용하여 호르몬의 양을 통제하는 현상. 늘 일정한 양의 호르몬으로 조절할 수 있다. 호르몬이 스스로 자신의 농도를 조절하기 위하여 되돌아가서 조절담담기관을 자극하는 것┌――――음성 피드백―――――――――――┐과다증(바제도병)↓ TRH TSH │시상하부 ――>뇌하수체전엽――> 갑상선―> 티록신―> 물질대사 촉진-> 호흡증가로 체온상 승, 발열량증가..↑ I└――――양성 피드백―――――――――――┘과소증(크레틴병) : 혈액속의 호르몬량이 증가하면 그 호르몬을 분비하는 내분비선이나 내분비선의 기능을 조절하는 기관의 기능을 억제시켜서 혈액속의 호르몬량을 일정하게 한다* 참고 - 외분비선과 내분비선① 내분비선 : 호르몬을 분비하는 기관. 관이 없어 분비된 호르몬이 혈액을 통해 표적기관 으로 이동② 외분비선 : 관을 통하여 물질을 분비. 젖샘, 땀샘, 소화샘식주기에 대해 좀더 살펴보면, 생식주기는 동물 내에서 일어나지만 많은 종에서 계절의 변화와 수반하여 일장의 변화와 같은 환경적인 신호(environmental signal)에 의해 내적 주기가 유발된다. 척추동물에서 시상하부와 선성뇌하수체의 신경내분비기작이 성적 및 생식적 주기에서 중요한 역할을 담당한다. 뇌하수체의 생식선자극호르몬(LH, FSH)이 정소와 난소의 활동을 유지한다. 이것은 생식선에서 성호르몬의 분비를 자극하고 이 성호르몬의 feedback 으로 시상하부의 해당 방출호르몬이 분비된다. 조류와 포유류의 암컷은 난모세포의 전수를 가지고 태어난다. 각 난모세포는 난소의 한 여포 안에 매몰되어 알(ovum)로 성숙된다. 대부분의 난모세포와 그 여포는 초기에 퇴화되지만 발정기 전에 일부는 난황형성 또는 성숙을 제외한 발생을 한다. 포유류의 암컷에서 FSH는 여포를 성숙형으로 만든다. 여포의 난포막내층(theca interna)은 에스트로겐의 생합성과 분비의 부위이다. 성체의 난소피질은 일차여포에서 그리아프여포까지 모든 단계의 여포를 포함한다. 여포의 FSH 유도성숙은 에스트로겐의 생성과 혈액 내의 방출을 유도한다. 낮은 농도에서 에스트로겐은 시상하부의 FSH 분비세포에 feedback 하여 FSH의 방출증가를 자극하여 여포성숙을 촉진한다. 그러나 높은 농도에서 에스트로겐은 아마 선성뇌하수체 분비세포의 감수성을 감소시킴으로써 FSH의 방출을 억제 하고 있는 FSH/LH 방출호르몬을 통해 황체화호르몬(LH)의 동요를 일으킨다. LH 배출의 이 피크는 배란을 촉진한다. 여포에서 터져나온 알은 나팔관을 따라 내려간다. 이때 에스트로겐 분비는 감소하고 LH의 영향하에서 여포는 일시적 내분비조직인 황체로 변형된다. 황체기에 황체는 에스트로겐과 프로게스테론의 낮은 농도는 방출을 일으키고 이것은 황체의 발달과 더 낳은 프로게스테론의 분비를 야기한다. 프로게스테론의 높은 농도에 달할 때 negative feedback FSH/LH 방출호르몬을 분비하는 시상하부세포에 대한 높은 프로게스테론의 억제적 작용에 의하여 발휘된다. 그리하여 LH 방출을 종결시킨다.