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[공학계열] PCR의 이해 평가A좋아요

PCR(Polymerase Chain Reaction)서론PCR은 polymerase chain reaction의 약자로 중합효소연쇄반응이라는뜻을 가지고 있다 적은 양의 유전자를 크게 냉각과 가열이라는간단한 원리로 수십만 배로 손쉽게 증폭할 수 있는 기술이다.PCR은 미국 Cetus사의 Mullis에 의해서 1983년 고안되었고소량의 DNA를 대량으로 증폭가능하다는 이점 때문에 친자 감별이나 바이러스감염의 초기 진단, 법의학적 범죄수사용도, 멸종된 과거 생물 등의 희귀 DNA증폭 등등 다방면으로 이용되고 있다. 처음 고안되었을 당시에는 대장균 유래의 DNA polymerase가 이용되었기 때문에 DNA의 double strand(이중가닥)분리를 위한 열변성 과정에서 DNA polymerase가 쉽게 변성되어 버려서 1회의 반응마다 효소를 첨가하지 않으면 안 되었으나 Thermus aquaticus등의 초고온균의 내열성효소 Taq DNA polymerase유전자를 추출해 대장균의 plasmis에 재조합시켜 고온해서도 쉽게 변성되지 않는 Taq DNA polymerase를 대량으로 생산함에 따라 이런 수고로움은 사라지게 되었다또한 PCR 방법을 기준으로 RT-PCR, PCR for DNA sequencing, SSCP(Single strand conformation polymorphism),RACE(Rapid amplification of cDNA ends), In situ PCR, Differential Display Reverse Transcriptase PCR등의 여러 가지 응용법이 있으며PCR의 단점을 보완한 LA PCR법도 개발되었다본론PCR반응은 크게 다음과 같이 4가지 과정으로 이루어 진다{Step 1 :primer, dNTP, 내열성 DNA polymerase를 함유하는 반응액 중에, 목적으로 하는 두가닥 DNA 단편을 열변성한다(92~98 )Step 2 :열변성에 의해 생긴 한가닥 주형 DNA에 primer를 annealing한다(50~65 )Step 3 :DNA polymerase에 의한 상보성 DNA를 합성한다(72 )Step 4 :증폭 산물로써의 두가닥 DNA를 재열변성하여 한가닥 DNA를 형성한다(step 1로 되돌아 간다)Step 1~4를 1 cycle이라 하며 cycle을 반복하면 DNA가 증폭된다.PCR의 기본 원리는 간단하다 이중가닥의 DNA를 template로 하여온도를 높여 DNA denaturation하면 염기들 사이의 수소결합이 끊어져single strand를 형성하며 primer를 붙여 annealing한뒤dNTP와 DNA polymerase를 첨가하여 상보적인 이중가닥DNA를 합성하고 이를 반복하는 것이다이렇게 기본원리는 간단하나 반응이 일어나는데 필요한 반응조건이 복잡하여 세심한 주의가 필요하다Step 1template인 Double strand DNA를 약 92~98 에서 denaturation하여single strand DNA를 형성한다Step 250~65 정도로 온도를 낮춘 뒤 DNA denaturation를 통해 형성된single strand DNA에 primer를 annealing한다 염기간의 G-C 사이에는 3개 A-T사이에는 2개의수소결합이 있어서 G-C의 비율에따라 적합한 온도를 조절하여 annealing한다primer는 DNA의 3 말단과 5 말단 일부분의 염기와 상보적인 짧은 염기서열가닥을 지칭하며 DNA합성기를 이용하여 합성할 수 있으며현재의 기술력으로는 약 100여개의 염기로 이루어진 DNA까지합성이 가능하다step 3Taq DNA polymerase의 최적활성 온도인 약 70~75 의 온도에서 Primer가 결합된 single strand DNA에다량의 dNTP와 Taq DNA polymerase을 가하면Taq DNA polymerase가 primer에 결합하여 상보적인DNA 사슬을 합성하여 새로운 double strand DNA를 생성한다step4step3까지의 진행으로 template DNA와 동일하게 합성된DNA를 다시 denaturation하고 step1~3까지의 반응을 반복한다step1~4까지의 진행과정을 묶어 1 cycle이라고 하며각 cycle이 진행될때마다 앞선 반응량의 2배의 증폭이 이루어져반응이 끝나면 총 2n 배로 증폭된다 (N=cycle횟수)기타1. Taq DNA polymerase{Taq는 극한 미생물중 온천에서 사는 Thermus aquaticus라는 초고온균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동 적정온도는 70 C 75 C이며 95 C에서 40분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다. 이 효소가 발견되기 전에는 높은 온도에서는 변성되어버리는 효소를 이용하여 매 cycle마다 효소를 첨가해 주면서 반응을 시켜야만 했다.2. RT - PCR(reverse transcription-PCR)PCR의 응용기술로서 mRNA로부터 reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성해낸다음 합성한 cDNA를 이용하여 앞서 기술한 PCR을 사용해 증폭하는 기술이다3. LA -PCR (Long and Accurate PCR)PCR에 사용되는 내열성효소 Taq DNA polymerase의 단점인낮은정확도와 크기가 큰 단편증폭의 곤란성 등을 보완한PCR기술이다4. DNA 합성기DNA합성기는 유전자의 비밀코드에 해당하는 염기서열을 기기에 입력 해 줌에 따라 일정 길이의 DNA를 자동적으로 합성하는 기기로서,이렇게 합성된 DNA는 생물학의 여러 분야에서 유전자의 서열분석,유전자 내의 특정 분야에서의 돌연변이 유도, 탐식자 등으로 널리 이용된다

공학/기술| 2005.04.26| 4페이지| 1,000원| 조회(1,148)

생명공학, PCR, DNA, 법의학

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