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이온통로 유전자의 클로닝, 발현, 이온통로 단백질 정제 및 전기 생리학적 특성 파악

이온통로 유전자의 클로닝, 발현, 이온통로 단백질 정제 및 전기 생리학적 특성 파악1. Abstract이번 실험은 클로닝된 유전자를 T7 RNA polymerase를 이용하여 cRNA를 합성하고(in vitro transcription), 이종 발현계(hetero expression system)인 개구리 egg에 주입, 발현시켜 전위고정법(voltage clamp method)으로 이온 통로의 전기 생리학적 특성을 파악하는 것이었다.pGEM-HEA라는 vector에 voltage-gated Ca2+ channel 중 하나인 α1H라는 유전자를 집어넣고 이를 E.coli에 주입시켜 영양배지에서 키웠다. 재조합 된 plamid DNA를 가지고 있는 E.coli로부터 plasmid DNA를 소량 분리하였는데 그 방법을 mini preparation이라고 한다. mini preparation를 통해 얻은 DNA를 RNA로 바꾸어주는 transcription 과정을 거쳤다.transcription시킨 RNA를 개구리 egg에 auto injector를 이용해 injection한다. 개구리 egg는 하나의 세포로 이루어졌음에도 불구하고 우리 눈에 잘 보일 뿐만 아니라 closed system이고 튼튼하기 때문에 사용한다. Voltage clamp를 이용해서 current를 측정함으로써 칼숨 이온채널의 발현여부를 확인할 수 있다. 실험에서는 Ca2+대신 Ba2+을 사용하였는데 그 이유는 Ca2+가 세포 내에서 단백질에 활성을 갖게 하여서 작동 기작의 function이 바꾸기 때문에 더 정확한 실험을 위해 Ca2+와 charge carrier가 비슷한 Ba2+을 사용하였다.Voltage clamp는 전위를 고정시켜 전위차를 유지하기 위해 흐르는 전류의 양을 측정함으로써 이온의 이동을 측정하는 방법으로써 칼슘이온채널이 발현되었는지를 확인할 수 있었다.실험결과 DNA가 injection된 egg에서는 voltage clamp에서 current의 변화가 나타났지만 injecti나선의 구조를 가지며 베타 쉬트의 구조를 갖는 것도 일부 존재한다. 지질막을 관통하는 알파 나선은 22개 정도의 아미노산으로 이루어져 있는데 대부분 소수성 아미노산으로 구성돼 있다. 컴퓨터 알고리즘으로 비교적 정확하게 막관통 부분을 예측할 수 있다. 막관통 나선은 하나일 수도 있고 여러개 일수도 있다. 막관통 단백질은 계면활성제, 비극성 솔벤트등을 사용하여야 막으로부터 분리해 낼 수 있다.2_3. PCR (Polymerase chain reaction)중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다.중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105∼108배까지 수시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 다음과 같이 여러가지 실험에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.중합효소 연쇄반응은 다음과 같이 세 단계로 이루어진다.1) DNA의 변성(denaturation)90°C∼96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.2) Primer의 결합(annealing)50°C∼65°C에서 진행조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, 과정2)는 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 Northern blot hybridization과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR을 통해서 전체 길이의 cDNA를 간단하게 합성하여 cloning 할 수 있다.2_4. Voltage-ClampKenneth Cole 에 의해 1949년에 개발되었던 voltage-clamp technique은 1952년 Alan Hodgkin과 Andrew Huxley가 오징어 거대 축삭을 연구하는데 이용되었다. 축삭이 voltage-clamp 될 때 전압-개폐(voltage-gated) 이온통로는 막전위에 부가된 변화에 반응하여 열리거나 닫히지만 voltage-clamp는 막전류의 변화가 막전위에 영향을 주지 못하게 방지한다. 그래서 개개의 이온의 전도의 변화가 막전위의 함수로써 측정될 수 있다.voltage clamp는 세포내부에 한 전극과 세포외부에 한 전극, 두 개의 전극에 연결된 전류 소스로 구성된다. 세포막을 가로질러 전류를 흘림으로써 미리 정해진 탈분극 수준으로 막전위를 빠르게 변화시킬 수 있다. 이러한 탈분극은 전압-개폐 Na+와 K+ 통로를 연다. 그래서 세포막을 통한 Na+와 K+ 이동이 막전위를 변화시키게 되나 voltage clamp 상태에서는 정해진 수준으로 "clamp"된 막전위로 유지된다. 일반적으로 중등도의 탈분극에 반응하여 Na+ 통로가 열릴 때 전기화학적 경사에 따라 Na+ 이온이 이동하므로 안쪽으로 흐르는 전류가 발생된다. 이러한 Na+ 유입은 막 안쪽의 양전하를 증가시키고 막 바깥쪽의 양전하를 감소시켜서 막의 탈분극시킨다. voltage clamp 는 세포안에서부터 양전하를 . Spread on pre-warmed plate, incubate at 37℃ for 12hrInoculation1. 4㎖ LB medium + 4㎕ ampicillin2. Pick single colony → into 1.Mini preparation1. Cell down, discard medium2. + 100㎕ Sol Ⅰ+10㎕ RNase → vortexing3. + 200㎕ Sol Ⅱ→ inverting4. + 150㎕ Sol Ⅲ → inverting5. Incubate on ice (10min)6. Centrifuge (10min)7. Supernatant + phenol:chloroform → vortexing, centrifuge (2min)8. Upper layer + 1000㎕ 100%EtOH → vortexing, centrifuge (10min)9. Pellet + 700㎕ 70%EtOH → vortexing, centrifuge (3~5min)10. Discard medium → Air dry (5~10min)11. +DDW 30㎕ → vortexing, spin down, store at -20℃*SolutionsSol ⅠSol ⅡSol ⅢGlucoseTris-Cl (pH 8.0)EDTA(pH8.0)NaOHSDSPotassium acetateGlacial acetate acidH20* Target vectorVector: pGEM-HEA (3kb), AmpRElectrophoresisIn vitro transcription1. Linearization of template DNA (37℃, 1hr)DNA(5~10㎍)Buffer8㎕AflⅡ5㎕DDWTotal80㎕2. Purification: RNA용 PCR kit로, 마지막에 50℃의 DEPC-DDW 15㎕에 dissolve → 확인: O.D.로, 200㎍/㎖ 이상 필요3. cRNA 제작: in vitro transcription (37℃, 2hr)2XNTP/CAP5㎕T7 GTP0.5 않는다. SolⅢ는 renatuaion시키는 과정으로 potassium acetate와 glacial acetic acid는 산성으로 pH를 급격히 7.0까지 복구시킨다. 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 SDS와 potassium과 함께 엉기게 된다. 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거하면 상층액에 plasmid DNA가 있게 된다. solution 처리를 한 후 ice에 incubate하는데 이는 불순물이 더 잘뭉쳐지는 효과가 있다. 그 후 phenol:chloroform을 넣고 vortexing을 해주는데 phenol은 불순물을 없애주고 chloroform은 가벼워서 centrifuge가 안 되는 phenol을 잡아 centrifuge되게 한다. EtOH로 washing을 해주면서 이온을 제거하고 centrifuge해주고 건조시킨 후 마지막으로 DDW으로 vortexing 해주면 DNA만 남게된다. 이를 -20℃에서 보관한다. 이렇게 얻은 DNA가 잘 재조합 되었는지 확인하기 위해 전기영동을 해주었다. 그 결과는 fig2 와 같다. 왼쪽에서 4번째 열은 DNA 크기를 비교할 수 있는 ladder로써 6.0kb, 3.0kb, 1.0kb가 진한 선으로 되어있다. 이와 같은 라인에 있는 것을 비교하여 우리가 전기영동 한 DNA의 크기가 몇인지 알 수 있다. 내가 실험한 data는 7열과 8열에 나타나 있는데, 7열에 나타난 10kb는 vector에 α1H가 재조합 된 상태를 나타내고 8열의 3kb와 7kb로 나누어져 있는 것은 제한효소에 의해 α1H의 앞 뒤에서 잘라주었기 때문이다. 7열을 자세히 보면 DNA의 크기가 정확히 10kb가 나온 것이 아니라 그 밑에 희미한 잡밴드가 새겼는데 이는 plasmid가 원형이고 꼬여있기 때문에 linear한 DNA를 측정하는 방법인 전기영동에서는 정확3

자연과학| 2008.09.27| 20페이지| 2,000원| 조회(512)

PCR, 막 단백질, 이온통로 유전자, ion channel, Voltage-C..

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당 센서 제작 및 당 측정 실험

당 센서 제작 및 당 측정 실험1. PurposeCyclic voltammetry와 choronoamperometry의 기본 개념을 이해하고 이를 이용한 기초적인 전기화학 실험을 수행한 다음, 대표적인 바이오센서(biosensor)인 당 센서(glucose sensor)를 glucose oxidase(GOD)를 이용하여 제작하고, 이렇게 제작할 glucose sensor를 사용하여 전기화학적으로 glucose를 측정한다.2. Introduction당 센서(glucose sensor)는 여러모로 바이오센서(biosensor)의 대표적인 모델이라고 볼 수 있다. 1962년 Clark가 처음으로 산소 센서를 이용한 효소전극을 제안하였을 때 소개한 센서가바로 당(glucose)을 재는 센서였다. Glucose의 검출은 당 산화 효소(glucose oxidase : GOD)를 고정시킨 백금전극을 이용함으로써 이루어지는 것이 가장 일반적이다. GOD는 생체 내에 존재하는 수많은 효소들 중에서도 험한 생체 외 환경에서도 활성도를 유지하는 몇 안되는 효소들 가운데 하나이다. 그러므로 효소 센서에 이용하기 가장 쉬운 효소라고 할 수 있으므로 교육적으로나 산업적으로 가장 널리 쓰이고 있다. 또한 바이오센서가 측정할 수 있는 대상 물질 중 glucose는 의학적으로나 산업적으로 가장 수요가 많은 대상에 속한다. 의료 목적으로는 해마다 급증하고 있는 당뇨병 환자로 인해 혈중 glucose 농도의 확인을해야 할 필요성이 늘어나고 있으며, 산업적으로는 여러 가지 식품산업에서도 요구되고 있다. 이 때문에 수많은 바이오센서들 중 glucose 센서가 시장의 압도적인 비율을 차지하고 있다.한편 유사한 발상으로 효소반응을 할 때에 발생하는 열을 thermistor에 의하여 검지할 수 있는 효소 thermistor도 효소전극과 더불어 발전하였다. 효소 thermistor는 10-4K 정도의 미세한 온도변화를 1% 이내의 정밀도로 잡아서 시료중의 특정성분을 측정하는 biosensor이다. Bio간 낮은 전위에 환원(음극)전류 봉우리가있다. 이 경우에 확산방정식에 대한 해를 구하기 위하여 수치 변환을 한 결과를 이용한다. 봉우리 전류밀도는 다음과 같으며 산화전류나 환원전류나 봉우리 전류의 크기는 훑기 속도의 제곱근에 비례한다.i p = 2.69*105n3/2(Dv)1/2C。v: 전위 훑기속도(V/s), C。: 용액 중 반응물의 농도(mol/cm3), D : 확산계수(cm2/s)3-3. 일정전류 전위차법 (Chronoamperometry)Chronoamperometry란 일정한 전압을 걸어 준 후 시간에 따른 전류의 변화를 측정하는 방법으로, 용액에서의 물질의 이동에 대한 전류량을 확인 할 수 있다. 한계전류(limiting current)는 다음과 같은 식으로 주어진다.Il = nFAm0C0*위의 식에서 m은 물질의 이동 계수가 되며, 용액을 저어 줄 때와 저어주지 않을 때는 아래와 같은 그림으로 한계전류가 나타난다.< 그림3. Convection 유무에 따른 I-t curves >Convection이 없는 경우, 과 전위가 걸린 전극 표면 근처의 농도변화에 대해 살펴보면, 농도는 전극에 접한 위치, 즉 x=0 인 곳에서는 0이며 먼 거리에 이르면 c0(bulk solution의 농도)에 가까워짐을 알 수 있다. 또 시간 t가 길수록 거리에 따른 농도의 증가가 완만하고 실제적으로 용액 내부(x=∞)에 비하여 농도의 결핍이 있는 층(이를 확산층이라고 함)의 두께가 두꺼워짐을 알수 있다.3-4. 바이오센서 (biosensor)센서는 목적하는 물질의 존재 유무 또는 농도에 따라 물리적인 변화나 화학적인 반응이 재현성 있게 일어나도록 하고 이를 비례적으로 감지하여 전기적 신호로 변환하여 수치화 하는 기기라 할 수 있다. 바이오센서는 가스센서나 이온센서와 같이 화학물질을 검출하는 센서이다. 일반적의 화학센서와 차이는 생체물질을 교묘히 이용하는 점에 있다. 바이오센서의 다음과 같은 뛰어난 특징은 생체물질을 이용함으로써 생겨난다.① 측정 대상에 대한 선택성이 탁월 Enzyme Kinetics효소 촉매반응의 동력학에 대해 특히 유용한 모델은 1913년 Leonor Michaelis Maud Menten에 의해 제안되었다. 전형적인 반응은 어떤 기질 S를 생성물 P로 변형시키는 것이다. 이 반응의 화학당량식은 다음과 같다.S ㅡㅡㅡㅡ> P (3.1)효소촉매반응의 기작은 다음과 같은 식으로 요약될 수 있다.k1 k2E+S ↔ ES → E+P (3.2)k-1이 반응에서 k1은 기질 S와 효소 E로부터의 효소-기질 복합체인 ES형성에 대한 반응속도 상수이다. K2는 ES복합체가 생성물 P로 전환되어 효소가 해리되는 반응의 속도상수이다. 여러 기질농도에서 효소반응 속도를 측정해보면 속도는 기질농도[S]에 따라 달라지는 것을 알 수 있다. 농도가 낮은 지역에서 속도V가 기질농도 [S]에 비례함을 보여주는 1차 반응이다. 농도가 높은 지역에서 반응속도는 기질농도에 관계없는 영차 반응이다. 이 경우 효소의 활성부위가 모두 기질로 포화된 상태이며 반응은 최대속도 Vmax로 진행된다. 최대속도의 1/2로 일어나는 반응의 기질농도는 특별한 의미를 가지고 있다. 이것은 Km으로 표시되며 효소의 기질에 대한 친화성과 반비례되는 척도로 여겨진다. Km이 낮을수록 친화성은 높아진다.효소는 기질을 매우 효과적으로 처리할 능력을 가지고 있어 효소-기질 복합체 ES의 형성속도와 이의 분해속도가 동일하게 되는 정류상태(staady state)에 곧 도달하게 된다.k1[E] = k-1[ES] + k2[ES] (3.3)효소의 총 농도 [E]T역시 아는 값이지만 효소의 많은 부분이 복합체 형태로 있을 것이다. 기지리 결합되지 않은 유리효소 농도[E]는 총 농도[E]T에서 [ES]를 뺀 값으로 다음과 같은 식으로 표시된다.[E] = [E]T ? [ES](3.4)각 반응의 속도 상수를 모아 정리하면([E]T ? [ES])[S] / [ES] = (k1+k2)/k1 = KM (3.5)여기서 KM을 Michaelis상수라 한다. 이를 효소-기질 복합체 농도인 [ES]이 동시에 처리 가능하여 유전적 분석을 단지 10㎕ 이하의 적은 양의 시료를 가지고 수 센티미터의 칩을 이용하여 수일 만에 분석할 수 있다.3-8. 당 측정의 응용금 나노입자를 이용해서 사람의 눈물 속에 포함되어 있는 극미량의 글루코오스(glucose) 농도를 측정할 수 있는 방법이 미국 중앙플로리다대학(University of Central Florida) 프로렌시오 헤르난데스(Florencio Hernandez) 교수 연구진에 의해 개발되었다. 헤르난데스 교수의 설명에 따르면, 금 나노입자를 이용한 새로운 검사 방법은 검출한계가 매우 낮아서 건강한 사람의 눈물 속에 포함된 극미량의 글루코오스도 확인할 수 있기 때문에 초기에 당뇨병 진단이 가능할 뿐만 아니라 매일 손가락 끝을 바늘로 찌르지 않고도 혈당치를 확인할 수 있다.우리말로 '포도당'이라고 부르는 글루코오스는 대표적인 단당류 물질이다. 탄소 6개로 이루어진 알데히드(aldehyde) 작용기를 포함하는 단당류를 의미하는 알도헥소오스(aldohexose)의 일종이다. 글루코오스는 6각 고리형(cyclic)과 선형(open chain)으로 존재할 수 있다. 용액에 녹아 있는 글루코오스는 모두 한 가지 형태로 존재하는 것이 아니라 일부는 선형으로 존재하고 일부는 고리형으로 존재하게 된다.연구진은 금 나노입자를 이용해서 알데히드 작용기와 염화금산(chloroauric acid)의 반응을 검출해내는 접근방식을 이용했다. 이는 톨렌스 은거울 반응(Tollen's silver mirror test)을 이용해서 알데히드를 확인하는 방식과 유사하다. 톨렌스 은거울 반응은 알데히드가 카복실산(carboxylic acid) 작용기로 산화되면서 은 양이온(Ag+)을 환원시키면서 시험관 벽에 은(0)이 침착되는 현상을 이용해서 알데히드의 존재를 확인하는 방법이다.헤르난데스 교수 연구진은 선행 연구를 통해 금 나노막대(nanorod)를 이용한 수은 센서를 개발한 바 있다. 금 나노막대 수은센서는 염(salt) 형태의 금 화합물이GODred + gluconolactonGODred + O2 → GODox+ H2O2H2O2 → O2 + 2H+ + 2e-4-3-2. 시약 및 기기- Glucose(Sigma G8270, FW 180.2)- Glucose oxidase (Sigma G6891, Type V-S, 1200unit/mL , 4.9mg/mL)- Potassium chloride(KCl)- 0.1 M, pH7.0 phosphate buffer- Potentiostat- Pt working electrode (BAS, A = 0.01 cm2- Pt counter electrode(0.5mm wire)- Ag/AgCl reference electrode(BAS)- Nafion (Ald. 27470-4, 5wt % solution in alcohols)4-3-3. 실험 방법ⓐ 백금 작업 전극( Pt working electrode)을 polishing 한다.ⓑ Polishing 한 백금 전극표면에 GOD 1μL loading한다.ⓒ GOD가 완전히 마른 후 GOD를 전극표면에 고정시키기 위해 Nafion 1μL를 loading한다.ⓓ 이렇게 준비된 작업 전극을 상대 전극(Pt counter electrode), 기준 전극(Ag/AgCl reference electrode)과 함께 potentiostat에 연결하고 0.1M, pH7.0 phosphate buffer 5mL에 담근다. 이때 용액은 magnetic stirrer를 이용하여 계속 저어준다.ⓔ GOD에 의해 glucose가 산화되면서 생성되는 H2O2 를 측정하기 위해 0.6V(vs. Ag/AgCl)의 산화전압을 걸어준다.ⓕ Background가 안정되면 0.25 M의 glucose를 micro-syringe를 이용해서 20μL씩 Injection 한다.(1mM식 증가한다.)4-4. 다채널(multichannel) 당 센서 제작 및 당 측정4-4-1. 실험 목적Biochip sensor의 원리를 이해하기 위해 다채널(multichaion

공학/기술| 2008.09.27| 26페이지| 2,000원| 조회(844)

바이오센서, 당센서, Cyclic Voltammetry, Chronoamper..

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FT-IR(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)

FT-IR(Fourier TransformInfrared Spectroscopy)1. 실험목적IR의 작동 원리를 이해하고 solid 및 liquid 형태의 물질에 대한 시료 준비 방법과 그에 대한 실험 결과를 분석하고자 한다.2. 서론분광광도법의 감도를 향상하기 원할 때 FT(Fourier Transformation) 방법을 이용한다. FT 방법은 IR뿐만 아니라 거의 모든 분광법에 사용하는 방법이다. FT-기기는 1891년 Michelson에 의해 개발된 간섭계(interferometer)를 주로 사용한다. 광원은 파장범위에 따라 보통의 세라믹 광원도 사용하지만 적외선 범위에서는 헬륨-네온 레이저를 사용한다.1)3. 기기의 용도(1) 정성분석유기 또는 무기물질을 합성할 때 합성된 물질을 확인하거나 개략적인 순도를 알아보려 할 경우 또는 혼합물로부터 분리 정제된 물질이 순수한가 아닌가 등을 빨리 알아보려 할 때 등 정성적인 목적으로도 자외-가시선부의 전자 흡수스펙트럼은 매우 유용하게 이용된다. 또한 어느 화합물에 작용기를 도입하거나 치환하는 경우 자외-가시선부 스펙트럼으로 비교적 간단히 확인할 수 있다.2)(2) 적외선 분광 광도법의 정성적인 응용비교적 간단한 화합물에 대해서도 적외선 흡수 스펙트럼은 당황할 정도로 많은 선명한 봉우리의 최소점을 가지는 경우가 많이 있다. 작용기를 확인하는데 유용한 봉우리들은 적외선의 짧은 파장 영역에 위치한다 (2.5~8.5㎛ 근처), 여기서 최대점의 위치는 작용기가 결합한 탄소 골격에 의해 조금밖에 영향을 받지 않는다. 따라서 이 영역의 스펙트럼을 조사하면 분자의 전체적인 구성에 관련된 많은 정보를 얻을 수 있다. 분자내의 작용기를 확인하는 것으로는 화합물을 명확하게 확인하는데 충분하지 못하므로 2.5에서 12㎛까지의 전체 스펙트럼을 알려진 화합물의 것과 비교하여야 한다. 이런 목적으로 수집해 둔 스펙트럼을 이용할 수 있다.3)(3) 정량분석어떤 화합물의 자외-가시선 흡광도를 측정하여 정량분석을 하려면 다음의 몇 가지사항을 유념하여야 한다. 첫째, 분석하고자 하는 물질의 흡수 스펙트럼을 측정하여 최대흡수가 일어나는 파장과 흡광계수를 결정하여야 하며, 이미 그 시료물질의 스펙트럼이 알려져 있다 하더라도 최대흡수가 일어나는 파장과 흡광계수를 확인한 후 실험 측정할 파장을 선택하여야 한다. 왜냐하면, 최대흡수가 일어나는 파장에서 측정하는 것이 감도가 높고 측정오차가 적기 때문이다. 둘째, 검정곡선을 그려야 한다. 화합물 자체에 연유하지 않더라도 기계적인 이유로 Lambert-Beer의 법칙에서 벗어나는 수가 흔히 있으므로 검정곡선은 정량분석에 꼭 필요한 것이다. 마지막으로, 시료물질의 흡광도를 측정할 때 꼭 유념해야 할 사실이 있다. 아무리 측정 실험 조작을 정확히 한다 하더라도 흡광도의 측정범위를 잘못 선택하면 많은 측정오차를 유발하게 된다.4)(4) 적외선 분광법의 정량적인 응용적외선 분광 광도법은 거의 모든 분자들이 적외선 영역에서 흡수하기 때문에 아주 많은 수의 물질들을 정량할 수 있는 능력을 가지고 있다. 더욱이, 적외선 스펙트럼의 독특성은 다른 분석법을 능가하거나 견줄만한 특성이 있다. 이 독특성으로 인해 비슷한 유기 화합물들의 혼합물 분석에 특별히 응용될 수 있다. 대기 오염물질에 대한 최근 정부의 규제가 확대됨에 따라 다양한 화합물에 대한 감도가 좋고, 바르며 고도로 정확한 방법의 개발이 요구되고 있다. 적외선 흡수 과정은 어떤 다른 단일 분석 방법보다 이런 요구를 만족시키는 것으로 알려져 있다.5)(5) FT-IR의 장점① 측정시간이 신속하여 짧은 시간에도 여러 번 측정을 반복할 수 있다.② 낮은 농도의 시료도 분석이 가능하다.③ 정밀도가 매우 우수하다.④ 거울의 속도를 일정하게 유지시키면분해능은 항상 일정하게 유지된다.⑤ 정성 및 정량분석의 정확도가 매우 높다.⑥ 고장날 확률도 비교적 낮고 유지하기도 쉬운 편이다.⑦ 시료의 열분해 또는 변질할 우려가 거의 없다.(6) FT-IR의 단점① 기기가 복잡하다.② 가격이 비싸다. (정교한 컴퓨터가 필요하기 때문에)③ 위상의 보정을 해주어야 한다.4. 이론(1) 분자의 진동 방식분자의 진동 방식은 먼저 신축 진동과 굽힘 진동의 두 가지로 나눌 수 있는데 이들은 다시 여러 가지로 세분할 수 있으며, 일반적으로 한 분자가 나타내는 진동 방식은 분자를 구성하고 있는 원자의 수 및 결합 상태에 따른다. 간단한 이원자 분자는 기하학적 결합 각을 가지고 있지 않기 때문에 굽힘 진동은 일어나지 않는다. 따라서, 이원자 분자의 진동 방식은 신축 진동에 의한 것뿐이고, 실제 스펙트럼도 1개만이 나타난다. 그러나 3원자 분자 이상의 다원자 분자일 때에는 이원자 분자의 경우보다 비교적 복잡한 진동 방식을 가진다. 분자의 구조가 x,y,z의 3축으로 이루어진 공간에서 분자의 운동은 진동, 회전 및 병진운동으로 구성된다.단순한 이원자 및 3원자 분자의 경우 진동수와 종류를 유도하고 이들 진동이 복사선의 흡수를 유발할 것인지의 판단이 가능하다. 복잡한 분자는 수많은 진동이 가능하여 적외선스펙트럼을 분석하기 어렵게 한다.다원자 분자가 가질 수 있는 가능한 진동수는 다음과 같이 계산할 수 있다. 공간에서 한 점을 나타내는 데는 세 개의 좌표가 필요하다. 따라서 N개의 점을 고정시키기 위해서는 각 점에 대해 세 개 좌표가 필요하여 전체로 3N이 요구된다. 다원자분자에서 각 좌표는 원자 한 개에 대한 자유도 한 개에 해당한다. 이런 이유로 해서 N개의 원자를 포함하는 분자는 3N개의 자유도를 갖는다.분자운동을 정의함에 있어서 ① 공간에서 전체 분자의 운동. ② 무게 중심을 축으로 전체 분자의 회전운동 및 ③ 원자 각 개의 다른 원자에 상대적인 운동을 고려할 필요가 있다. 병진 운동의 정의는 세 개의 좌표를 필요로 하며 세개의 자유도를 사용한다. 전체분자의 회전을 기술하는데 또 다른 세 개의 자유도가 필요하다. 나머지 (3N-6)의 자유도가 원자간 운동에 따라서 분자 내에서 가능한 진동의 수를 나타낸다. 선형분자는 모든 원자가 단일의 직선 상에 나열되어 있는 특별한 경우이다. 결합 축에 관한 회전은 가능하지 않고 회전운동을 기술하기 위하여 두 개의 자유도가 사용된다. 따라서 선형분자의 진동의 수는 (3N-5)로 주어진다. (3N-6) 또는 (3N-5)가지 진동을 기준진동 방식(normal mode)이라고 한다.기준진동 방식의 계산에서 예상되는 수보다 더 적은 수의 봉우리를 만들 때는 다음 네 가지 원인을 생각할 수 있다.분자의 대칭성으로 말미암아 어떤 진동에서 쌍극자 변화가 일어나지 않는 경우.두 개의 진동에너지가 서로 같거나 거의 같을 때.흡수 세기가 검출될 수 없을 만큼 낮을 때.진동에너지가 측정기의 파장영역 밖에 있을 때가끔 기준방식의 기대했던 것보다 더 많은 수의 봉우리가 나타날 수도 있다. 여기에는 기준진동 봉우리의 정수배 주파수를 가진 과진동(overtone) 봉우리가 나타난다. 또, 광자가 동시에 두 개의 진동 방식을 들뜨게 할 때 복합띠(combination bands)가 가끔 얻어진다.6)(2) 결합성질과 흡수 경향첫째, 강한 결합은 약한 결합보다 더 큰 힘 상수를 가지며 더 높은 주파수에서 진동한다. 둘째, 질량이 무거운 원소 사이의 결합은 가벼운 원자들 사이의 결합보다 더 낮은 주파수에서 진동한다. 일반적으로, 같은 두 원자 사이의 삼중결합은 이중결합 혹은 단일결합보다 강하며 높은 주파수를 나타낸다.C≡C C=C C-C2150cm-1 1650cm-1 1200 cm-1----- Increasing K -------C-H 신축은 3000 cm-1 에서 일어난다. 탄소에 결합한 원자의 질량이 증가하면, 환산질량도 증가하여, 진동 주파수는 감소한다.굽힘 운동은 전형적인 신축 운동보다 낮은 에너지에서 일어나는데, 힘 상수값이 낮기 때문이다.C-H stretching C-H bending~3000 cm-1 ~1340 cm-1혼성화(hybridization)도 힘 상수 K에 영향을 미친다. 결합은 sp3

공학/기술| 2008.09.27| 16페이지| 2,000원| 조회(1,389)

FTIR, 분자의 진동 방식, 신축 및 굽힘 방식, 퓨리에 변환 분광기

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화학전지 & 연료전지

화학전지 & 연료전지※ 화학전지1. 실험목적실생활에 사용하는 화학 전지의 원리와 구조, 종류와 특성을 이해한다. 그리고 화학전지의 용도와 전지구성 물질을 이해한다. 이를 위해 간단한 화학전지를 만들어 전류가 흐르게 되는 원리에 대하여 관찰하고자 한다.2. 서론2_1. 전지자발적인 산화 환원 반응을 통하여 화학에너지를 전기에너지로 바꾸는 장치, 원소(또는 화합물)마다 전자를 원하는 정도가 다르다.(표준환원전위차) 이렇게 전자를 원하는 정도가 다른 화학종들을 특별하게 연결하면, 외부 회로를 통해 전자를 흐르게 할 수도 있다. 다시 말하면, 두 화학종이 서로 전자를 잃고, 얻는 자발적인 화학 반응을 통해 전위차를 얻고, 이는 외부 회로를 통해 전자가 흐르게 되는 화학 전지를 꾸밀 수 있다.2_1_1. 전지의 구조① 산화 반응이 일어나는 부분과 환원반응이 일어나는 부분이 직접 접촉하지 않도록 만듦② 산화 반쪽 반응에서 생긴 전자 → 외부도선 → 환원 반쪽 반응이 일어나는 곳으로 이동양극 : 산화가 일어나는 전극 : (-)극 → 이온화 경향이 큰 금속음극 : 환원이 일어나는 전극 : (+)극 → 이온화 경향이 작은 금속연료전지 배경③ 반쪽전지 : 산화 환원반응이 일어나는 각 부분 금속. 금속 양이온으로 구성④ 염다리 : 용약과 용액이 서로 섞이는 것을 방지하고 이온만 이동시킴2_1_2. 전극전위① 기전력 : 전지의 전압 (측정 시 외부도선에 전류가 흐르지 않을 때 최대전압)② 표준기전력 : 용액의 농도가 1몰 농도이고 1기압 에서의 기전력③ 전극 전위 : 반쪽 전지에 대한 위치에너지의 높이에 해당하는 양1) 전극 전위가 작은 반쪽 전지 : (-)극 → 산화2) 전극 전위가 높은 반쪽 전지 : (+)극 → 환원3) 전자의 이동 : 전위가 작은 (-)극에서 높은 (+)극으로 이동4) 전류의 이동 : 전위가 큰 (+)극에서 낮은 (-)극으로 이동2_1_3. 표준 전극 전위① 표준 수소 전극에 금속이온 I 금속의 반쪽전지를 연결하였을 때 반쪽 전지의 전극 전위(금속 이온농도 , 과산화수소, 중크롬산칼륨 등2MnO2 + H2 → Mn2O3 + H2O2_3 과일전지과일전지는 사과, 레몬과 같은 산성과일에 구리판과 아연판을 끼워 전기를 만들어낸다. 그 원리는 아연이 과일의 산에 부식(산화반응)되며 가지고 있는 전자를 잃게 되고 그 전자들이 과일을 타고 구리로 흘러 들어가(환원반응) 전기를 만들어낸다.3. 실험장치(1) 과일전지산화구리, 아연전극, 클립, 과일접시, 전지테스트기, 레몬, 가위, 과일칼(2) 볼타전지구리아연전극이 달린 플라스틱 용기, 10wt% 희석 황산, 전지테스트기4. 실험 방법(1) 과일전지A. 레몬을 가공한다. 이 때, 레몬의 머리 부분을 1/3~1/4 정도로 잘라 보관한다.B. 전극을 꽂기 쉽게 하기 위해 레몬의 심과 껍질을 가위로 자른다. 이 때, 과즙이 부서지지 않도록 주의하면서, 아래 방향을 여러 차례 자른다. 껍질을 눌러서 찌르면 과즙이 나오므로, 신중하게 작업한다.C. 과즙을 많이 만들기 위해 알맹이를 부순다. 이 때, 너무 부서졌을 때는 A에서 잘라 놓은 머리 부분을 손으로 짜 보충한다.D. 과일 그릇의 지지대로 레몬을 끼워 고정시켜 받침대에 얹는다.E. 가공이 끝난 레몬은 심의 잘린 결을 따라 전극을 깊숙이 꽂는다.F. 전지테스트기를 사용해, 운동(프로펠러 회전)과 소리(전자멜로디)와 빛(발광다이오드 점등)으로, 전기가 발생함을 확인한다.(2) 볼타전지A. 구리아연전극이 달린 플라스틱 용기에서 전극이 달린 뚜껑을 열고, 10wt% 희석 황산을 8부(약 130ml)정도 붓고, 뚜껑을 닫는다.B. 전지테스트기를 사용해 전기가 발생되는지 확인한다. 구리는 +이고 아연은 -이다. 전자멜로디와 발광다이오드는 극성이 있어 역으로 하면 작동되지 않는다. 또, 발광다이오드의 경우, 전지 2개를 직렬로 접속해야 한다.5. 실험결과 및 토의과일전지의 경우 레몬을 한 개 연결했을 때에는 전자테스트기 중 소리(전자멜로디)만 작동을 했고 프로펠러 회전과 발광다이오드에는 빛이 들어오지 않았다. 레몬을 직렬로 두 개를 연결했을 것이다. 분극현상이 일어나 전압이 떨어지게 되며 분극제를 써서 다시 전압을 회복시킬 수 있다. 또한 전자가 회로를 거치지 않고 반대로 흐르는 역전류가 발생하여 전압이 낮아졌을 수도 있고 전해질(황산용액)과 전극판이 가지고 있는 전기저항 때문일 수도 있다. 우리가 사용한 황산용액에 불순물이 포함되어 있어서 이온화가 잘 안되고, 사용했던 아연판이 이미 부식이 되어서 산화가 잘 안되었을 수도 있다.※ 연료전지1. 실험목적화학적 에너지를 직접 전기로 변환시키는 연료전지의 원리와 특징을 이해하고, Membrane Electrode Assemble(MEA)를 제작한다. 이 MEA의 구성 요소 및 역할을 이해하며 연료전지의 성능을 측정한다.2. 이론2_1. 연료전지연료전지는 연료(수소)의 화학에너지가 전기에너지로 직접 변환되어 직류 전류를 생산하는 능력을 갖는 전지(Cell)로 정의되며, 종래의 전지와는 다르게 외부에서 연료와 공기를 공급하여 연속적으로 전기를 생산한다.2_2. 연료전지의 기본개념연료전지의 기본 개념은 수소와 산소의 반응에 의하여 생성되는 전자의 이용으로 설명할 수 있다. 수소는 Anode를 통과하고 산소는 Cathode를 통과한다. 수소는전기 화학적으로 산소와 반응하여 물을 생성하면서 전극에 전류를 발생시킨다. 전자가 전해질을 통과하면서 직류 전력이 발생하며 열도 부수적으로 생산된다. 직류 전류는 직류 전동기의 동력으로 사용되거나 인버터에 의해 교류 전류로 바꾸어 사용된다. 연료전지에서 발생된 열은 개질을 위한 증기를 발생시키거나 냉난방 열로 사용될 수 있으며, 사용되지 않을 경우에는 배기열로 배출된다.연료전지의 연료인 수소는 순수 수소를 이용하거나, 메탄이나 에탄올 같은 탄화수소를 이용하여 개질이라는 과정을 통해 생산된 수소를 이용한다. 순수한 산소는 연료전지의 효율을 높일 수 있지만 산소 저장에 따른 비용과 무게가 증가하는 문제가 있다. 따라서 공기 중에 산소가 많이 포함되어 있으므로 효율은 좀 떨어지지만 공기를 직접 이용한다. 종합적으로 다음과 같은 , DMFC)상온-100℃이온(H+)전도성고분자 막수소메탄올개발 및 실증단계소형전원자동차인산형(PAFC)150-200 ℃인산(H3PO4)천연가스메탄올상용화단계분산전원용융탄산염(MCFC)600-700 ℃용융탄산염(Li2CO3-K2CO3)천연가스석탄가스개발단계복합발전열병합발전고체산화물(SOFC)700-1000 ℃고체산화물Yttria-stabilized zirconia천연가스석탄가스개발단계복합발전열병합발전알칼리형(AFC)상온- 100 ℃수소사용중특수목적< 연료전지의 종류 >2_4. 고분자 전해질형 연료전지고분자전해질형 연료전지의 전해질은 액체가 아닌 고체 고분자 중합체(Membrane)로써 다른 연료전지와 구별된다. 인산형 및 알칼리형 연료전지 시스템과 비슷하게 멤브레인을 이용하는 연료전지는 촉매로써 백금을 사용한다. 멤브레인 연료전지의 개발 목표는 최소 1.5g/kW의 백금 촉매를 쓰는 것이다. 이 백금 촉매는 일산화탄소에 의한 부식에 민감하므로 일산화탄소의 농도는 1000ppm 이하로 유지하여야만 한다.고분자전해질형 연료전지 시스템의 소형화는 자동차 응용에 가장 중요한 역할을 한다. 개발 사업은 인산형 연료전지보다 약 10년이 뒤져 있지만, 인산형에 비해 저온에서 동작되며, 출력 밀도가 크므로 소형화가 가능하며, 기술이 인산형과 유사하여 응용 기술의 적용이 쉽기 때문에 현재는 고분자전해질형 연료전지의 이용 규모가 적을지라도 상업화할 수 있다. 더욱이 현재 몇 개의 시범용 고분자전해질형 연료전지의 전원에 의한 자동차는 실험 결과 우수성이 입증되어 더 많은 연구 계획을 진행 중에 있다.2_5. 연료전지의 장점① 저공해 고효율 에너지원이다.연료전지는 도심지에서의 대기 공해를 환상적으로 줄일 수 있다. 연료전지는 동력원의 시스템 효율이 50% 이상이고(기존 내연기관의 효율은 25% 이하이다), NOx, SOx 등의 유해 가스의 배출이 1% 이하인 청정 고효율 발전 시스템이다.② 차세대 에너지원이다.70년대의 오일쇼크 이래로 선진 각국에서 꾸준히 대체에너지원의 개발에 이 때, anode에서 촉매는 수소와 반응하여 수소 분자와 전자로 분리시킨다. 수소 분자만이 membrane을 지나 cathode로 이동하고, 전자는 외부의 circuit을 따라 electrical current를 형성하며, cathode로 이동한다. Cathode에서는 전자와 양성의 수소이온이 산소이온과 결합하여 물을 형성한다.Cell 전압을 E(Volts)라 하면 -2FE(J/mol)을 외부에 행하는 것이 되며 바로 이 전지에너지가 Δ= -2⇒Gibb's energy의 변화량은 다음과 같이 표현된다.따라서 연료전지 cell의 기전력은 아래의 Nernst 식으로 표현된다.Gibb's free energy는 어떤 계의 엔탈피, 엔트로피, 및 온도를 이용하여 정의하는 열역학적 함수이다. 이 값을 이용하면 일정한 온도와 압력이 유지된 상태에서의 화학반응의 평형조건을 알 수 있다. 또, 정반응과 역반응 중 어느 것이 더 자발적인지도 계산할 수 있다.A, B, C를 포함하는 화학반응에서 aA + bB ⇔ cC 반응의 free-energy change는이 때 free energy를 다음과 같이 표기한다.: standard state에서species의 free energy pure solid 에서는 (1atm, at T)∴()이것으로 standard-state free energy를 나타낸다.표 3에 나타낸 것은 온도와 H2O의 상태에 따른, 그리고 한계효율이다. 한계효율은로 정의된 것이다. 이제의 온도에 대한 관계를 고려하여 정리된 식은 다음과 같다.Nernst식으로 주어진 cell의 기전력은 열역학적 가역상태에서 얻을 수 있는 이상 기전력이며, 흔히 open circuit voltage라고 부른다. 그것은 부하측으로 흐르는 전류가 0A일 때에 나타나는 전압이며, 전류가 흐르기 시작하면 여러 비가역적인 현상에 의해 기전력이 낮아진다.Temp (℃)Form of H2O(KJ/mole)(V)한계효율 (%)25liquid-237.21.238380liquid-228.21.1

공학/기술| 2008.09.27| 20페이지| 2,000원| 조회(876)

연료전지, 화학전지, 볼타전지, Nafion

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단백질의 분리와 분석( 1-D 전기영동 )

단백질의 분리와 분석( 1-D 전기영동 )1. 실험목적단백질의 기본적인 개념과 단백질의 분리정제에 대해서 이해하고, 단백질의 분리의 가장 일반적인 방법인 1-D 전기영동 실험을 이용하여 목적하는 단백질의 분리 및 단백질체학(proteomics)의 기본적인 지식을 배양하도록 한다.2. 이론1) 아미노산(Amino acid)- 아미노산의 구조자연계에 있는 단백질을 가수분해(hydrolysis)하면 약 20가지의 L형 a-아미노산이 산출된다. 그러나 D형도 박테리아의 세포막 같은데 들어 있다. 아미노산들에서 아미노기(NH2)는 전부 카르복실기(COOH)가 붙어 있는 a위치의 탄소에 붙어 있으며, 이 a-C에 결합되어 있는 그룹 4개가 모두 다르므로 부제탄소 우너소로서 이성체(isomer)를 가질 수 있다. 각 아미노산 들은 R만 서로 다른데, 이것은 각종 측쇄를 가리킨다. 예컨대 R이 H원자일 때, a-아미노산은 글라이신(glycine)이다. 그러나 아미노산은 최소한 2개의 이온화될 수 있는 약산기(week acid group), 즉 COOH와 –NH3+를 가지고 있어서 용액 내에서는 각각 두 가지 형태(하전, 비하전)로 되어 평형을 이루고 있다.- 아미노산의 분류아미노산을 분류하는 데는 여러 가지 방법이 있으나 편의상 측쇄(side chain.R)의 구조에 따라 7가지로 나눈다. 그 밖에 특수 단백질에 들어있는 아미노산들이 여러 가지 있다. 예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline)과 하이드록시라이신(hydroxylysine)은 콜라겐 단백질에 들어 있으며, 타이록신(thyroxine)은 갑상선 단백질인 타이로글로불린(thyroglobulin)에 들어있다.생체내에서 중요 기능을 갖는 비 a-아미노산2) 단백질(protein)단백질은 살아있는 생명체에서 가장 중요한 기능을 갖고 있다. 단백질은 구조적으로 작용하는 것 외에도 대사조절 작용을 하거나 운반작용, 방어작용, 촉매작용을 한다. 폴리펩티드는 아미노사의 중합체이다. 단백질은 한 개 이상의 폴리펩티경우는 치사적일 수도 있다.단백질의 합성 장소는 리보솜이다. DNA로부터 전사된 mRNA와 아미노산을 운반하는 tRNA는 리보솜으로 이동한다. 단백질이 합성되기 위하여 아미노산은 활성화되어야 한다. 아미노산은 우선 각 아미노산에 특이적으로 반응하는 효소와 ATP에 의하여 아미노산-AMP분자를 형성한다. 이 분자는 다시 효소에 의하여 유리되며 아미노산은 특정한 tRNA와 결합하여 아미노아실 tRNA를 형성한다. 활성화된 아미노산으로 단백질합성은 초기화(initiation), 연장(elongation), 종료(termination)의 순서로 일어나게 된다. 작은 리보좀아단위(small ribosomal subunit)에 특정한 초기화tRNA(initiation tRNA)가 부착되며 초기화과정이 시작된다. 모든 생물은 단백질합성을 아미노산인 메티오닌(methionine)을 인지하는 암호인 AUG로부터 시작한다. 메티오닌은 N-사포밀메티오닌으로 변조되어 폴리펩티드 사슬에 처음으로 나타나는 아미노산이 된다. 초기 tRNA가 리보좀의 아단위에 부착되면 mRNA가 이 복합체에 부착하게 된다. 이와 같은 복합체가 형성되면 mRNA의 초기화 코돈인 AUG와 초기화 tRNA의 안티코돈이 정열하게 된다.초기화 tRNA가 리보솜의 P부위에 결합 함으로서 A부위 tRNA가 열리게 되어 다음의 코돈에 의하여 인지되는 아미노아실tRNA가 부착하게 되며 새로이 합성되는 아미노산의 사슬은 길게 연장이 된다. 이와 같은 반응은 계속되어 한번에 두 코돈인 여섯 개의 mRNA염기가 리보솜에 놓여지면, 놓여진 코돈에 상응하는 염기의 배열을 가진, 활성화된 tRNA가 mRNA와 염기간 수소결합을 하게 된다. tRNA에 부착되어있던 아미노산은 폴리펩티드로 중합되고 tRNA는 유리되며 다음의 mRNA 염기가 같은 방법으로 폴리펩티드 사슬을 연장하게 된다. mRNA상의 코돈이 UAA, UGA 혹은 UAG인 종결코돈이 되어 아무런 아미노산을 중합할 수 없게 되면 단백질 합성이 종결되어 모든 분자는 리보솜으 사용되는데 전기영동법은 간혹 단백질을 불활성화하기 때문이다. 그러나 전기영동은 분석 방법으로서는 특히 유용하다. 이 방법이 유리한 점은 단백질이 분리될 뿐 아니라 눈으로 볼 수 있게 할 수 있으므로, 혼합물 중의 단백질의 수 또는 특정 단백질의 조제의 순도를 연구자가 재빨리 예견할 수 있는 것이다. 또한 전기영동에 의해서 등전점(isoelectric point)과 대략적인 분자량(molecular weight)과 같은 단백질의 중요한 성질을 결정할 수 있다.단백질의 전기영동은 가교 중합체(cross-linked polymer)인 폴리아크릴마이드(polyacrylamide)로 되어 있는 겔(gel)중에서 한다. 폴리아크릴마이드 겔(polyacryl-amide gel)은 분자의 체(molecular sieve)로서 작용하고 정량 또는 그들의 분자량에 대한 전하의 비에 비례해서 단백질의 이동을 늦추게 된다. 이 폴리아크릴아미드 젤의 농도가 증가할수록 구멍의 크기가 작아지므로 분리하고자 하는 단백질의 분자량을 알아서 폴리아크릴아미드 겔의 농도를 정한다.이동은 단백질의 형태에 의해서도 영향을 받는다. 전기영동에 있어서 거대분자를 이동시키는 힘은 전위, E가 된다. 분자의 전기영동의 이동도, μ는 전위에 대한 입자의 속도, V의 비가 된다. 전기영동의 이동도는 또한 분자의 실 전하, Z를 마찰계수, f로 나눈 것과 같다. 즉,전기영동의 과정 중의 겔 상태에서의 단백질의 이동은 단백질의 크기와 모양에 의해 결정된다.▪ SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)폴리아크릴아미드 젤은 분자체(molecular sieve)의 역할을 하므로 각 단백질은 거의 그들의 질량에 비례하여 이동한다. 그러나 단백질을 이루는 대부분의 아미노산이 띄는 전하량의 정도가 다르기 때문에 단위 질량당 전하의 정도가 달라지고, 단백질 분자의 모양도 다양하여 그들의 이동속도를 예상하는 것은 간단하지가 않다. 따라서 단백질의 순도의 분석 및 분자량의 결정을 ) Nature 227, 680-685). 불연속 전기영동법의 가장 큰 장점은 많은 용적의 시료를 로딩하더라도 좋은 해상도로 얻을 수 있다는데 있다.전기영동용 완충용액(running buffer)에 포함된 glycine은 의가약산으로서 음전하와 양전하를 동시에 띨 수 있다. 이와 같은 zwitter이온의 성질을 이용하면 gel내의 pH조건에 따라 glycine의 net charge와 이로 인한 전기영동속도를 조절할 수 있다. 전기영동을 시작하면 leading 이온인 Cl-이온과 단백질, glycine이온이 모두 양극을 향해 출발하게 된다.Glycine은 stacking gel의 낮은 pH 조건에서는 거의 중성을 띠므로 국부적인 전류의 감소현상이 유발된다. 따라서 낮은 pH 조건에서도 이동도가 빠른 Cl- 이온과 이동도가 느린 glycine 이온 사이에 매우 높은 전위차가 형성되는데 이러한 전위차에 위해 glycine이온이 Cl- 이온을 빠르게 뒤따르게 된다. 이때 상대적인 이동속도는 glycine < 단백질 < Cl- 이 되며 따라서 단백질은 Cl- 와 glycine 이온사이에 축적되어 이동하게 된다. Cl- 와 glycine 이온의 간격은 수mm로서 많은 용적의 시료에 있던 단백질도 running gel에 들어가기 전에 이사이에 축적되어 해상도를 높이는 효과를 나타내게 된다. Stacking gel은 large-pore gel이므로 단백질의 molecular sieving현상은 나타나지 않는다 (gel내의 미세통로 크기에 따라 단백질이 분리되는 현상).이동 중인 이온들이 running gel에 이르게 되면 running gel의 높은 pH는 glycine이온을 음전하로 강하게 대전시켜 glycine의 이동속도가 단백질보다 빠르게 되며 단백질은 gel내에서 molecular sieving현상에 의해 분리된다.Stacking gel은 acrylamide 농도가 3~5%인 것을 사용하며 pH는 6.8이다. Running gel (resolving gel 또는 se까지 부어주면 된다.SDS-PAGE (Laemmli's discontinuous) 방법1.5 M Tris-HCl, pH 8.818.17g Trisma base in 100ml DW and adjust pH with HCl (6N)1 M Tris-HCl, pH 6.812.11g Trisma base in 100ml DW adjust pH with HCl (6N)10% SDS10g/100ml DWTEMED10% Ammonium persulfate1g/10ml DW30% acrylamide/bisacrylamide stock solution (29:1 mix)29g acrylamide (ultra pure)1g bisacrylamidedissolve in 100ml DW and filterstore at 4℃ in dark2x Sample Loading Buffer125 mM Tris-HCl, pH 6.8 25ml20% Glycerol 10g2% 2-mecaptoethanol 5ml0.04% bromophenol Blue 20ug4% SDS 2gtotal 50ml가 되게 초순수 가한다.10 x Running Buffer0.250M Tris-HCl (pH8.3) 3.03g1.92M Glycine 14.4g1% SDS 1gtotal 100ml가 되게 초순수 가한다.Coomassie R250 Staining SolutionBrilliant R250 0.5gMethanol 10mlAcetic acid 15mltotal 200ml가 되게 초순수 가한다.Destaining SolutionMethanol 50mlAcetic acid 15mltotal 200ml가 되게 초순수 가한다.MaterialsGel PreparationRunning gel %의 선택5% ➸ 100-300Kda , 7.5% ➸ 40-250Kda, 10% ➸ 20-200Kda ,12% ➸ 14-150Kda , 15% ➸ 4-100KdaRunning GelsStacking Gels4. 실험결과< 그림 1 >< 30

자연과학| 2008.09.27| 27페이지| 2,000원| 조회(697)

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