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단백질 추출 레포트

1. Title : 단백질 추출2. Date : 2008년 3월 28일 금요일 7, 8교시3. Name4. Proposal : 다음에 수행할 전기영동 실험을 위해 단백질을 추출한다.5. Materialsplate, pipette, RIPA, scraper, 원심분리기, tube, hot plate, 비커6. Method①cell이 깔린 plate에 lysis buffer로 200λ RIPA를 넣는다.②scraper를 이용해서 cell을 긁어낸다.③scraper로 긁어내어 모은 액체를 pipette을 이용해 tube에 담는다.④12000rpm, 15분 동안 centrifuge해서 cell debris 등을 down시키고 soup만 따낸다.이 때 원심분리기의 균형을 맞추기 위해 같은 양의 증류수를 다른 튜브에 넣고 샘플의 맞은편에 끼운다.⑤다음 표와 같이 3개의 용액을 만들어 튜브에 담고 표시를 한다.#1#2#3sample5λ10λ15λRIPA11λ6λ1λSDS running buffer (5x)4λ4λ4λ합계20λ20λ20λ⑥만들어진 샘플들을 끓는 물에 넣어 5분 동안 가열한다.⑦ice에 박는다.7. Discussion-gel electrophoresis 원리알짜 전하를 띤 분자는 전기장에서 이동하게 된다. 전기영동이라고 하는 이 현상은 단백질 뿐 아니라 DNA, RNA 같은 고분자들을 분리하는 효과적인 수단이다. 전기장에서의 단백질의 이동속도는 전기장의 세기, 단백질의 알짜전하그리고 마찰계수들로 좌우된다.하전된 분자들을 반대로 하전도니 전극 쪽으로 밀어가는 전기력는 이동하는 분자와 매질 사이의 마찰에서 생기는 점성에 의한 저항력의 반대작용을 받는다. 마찰계수는 이동하는 분자의 질량과 모양 그리고 매질의 점성에 따라 정해진다. 반지름이인 구에 대한 마찰력는 다음과 같다.전기영동법에 의한 분리는 겔 gel에서 수행된다. 그 이유는 겔이 분리를 증진하는 분자 체 (molecular sieve)의 역할을 하기 때문이다. 그 중 acrylamide의 중합으로 형성되고 methylenebisacylamide에 의해서 교차 결합되는 polyacrylamide gel은 전기이동을 위한 최상의 매체이다. 이 겔들은 화학적으로 반응성이 없고 쉽게 형성되기 때문이다. acrylamide의 중합과 methylenebisacylamide과의 교차결합 과정에서 gel에는 구멍이 생기게 된다. 겔의 구멍보다 더 작은 분자들은 쉽게 겔을 통과해서 이동하지만, 구멍보다 큰 분자들은 거의 이동할 수 없다. 중간 크기의 분자들은 크기나 모양, 전하에 따라 서로 다른 속도로 겔을 이동한다.그러나 변성제가 있는 조건에서 polyacrylamide gel에서 전기영동하면 단백질을 주로 질량에 근거해서 분리할 수 있다.-lysis bufferlysis buffer는 세포 내 화합물을 분석하는 실험에서 세포를 파열시키는데 이용된다. 화합물을 어떻게 분석하느냐에 따라 다양한 종류의 lysis buffer가 존재한다. 예를 들어 유전자검색(DNA fingerprinting)같은 경우 lysis buffer를 이용하여 세포와 핵막을 파괴하고 그 결과 DNA가 방출되는 현상을 이용한다.-우리가 사용한 RIPA buffer에 0.1% SDS가 들어있다. SDS의 역할은?SDS는 강력한 음이온성 세제로서 자연의 단백질에 있는 거의 모든 비공유결합성 상호작용을 파열시킨다. 자세히 설명하자면 단백질 내의 소수성 부분에 결합하여 단백질 분자들간의 소수성 부분의 결합 가능성을 억제시킨다. 그 결과 단백질의 3차구조가 변성되고 막 구조물이 파열된다. 이를 통해서 RIPA buffer 에 들어있는 SDS는 세포 내 단백질들이 방출될 수 있도록 lysis buffer를 보조하는 것임을 알 수 있다.

자연과학| 2009.05.20| 2페이지| 1,000원| 조회(515)

전기영동, SDS, lysis buffer, gel electrophoresi..

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형질전환

1. Title : DNA work2. Date : 2008년 5월 9일, 16일3. Name :4. Proposal - Principles & Introduction미생물학 실험을 수행하는 데 있어서 가장 기본이 되는 재료가 DNA이므로 많은 양의 DNA를 확보하는 것이 무엇보다 중요하다. 이를 수행하기 위해 외부 DNA를 숙주 세포 내로 도입시키는 방법인 형질전환(Transformation)을 이용하게 된다. 이 방법은 박테리아 세포에 물리적 내지는 화학적 자극을 주어 Plasmid DNA를 받아들일 수 있는 상태로 만들어, DNA가 세포 내로 들어가게 한 다음, 이들 형질전환 된 세포들을 배양함으로써 이루어진다. Recombinant DNA plasmid가 들어가 있는 E.coli로부터 직접 plasmid를 뽑아보고, 특정 염기서열을 인식하여 잘라내는 제한효소를 사용해 직접 DNA를 잘라보는 실험을 첫 주에 진행하고, 이를 전기영동을 통해 크기를 확인하는 실험을 두 번째 주에 진행함으로써 분자 생물학적인 실험에서 기본이 되는 DNA 관련 실험에 대해 이해할 수 있다.-Transformation(형질 전환)형질변환·형전환·형변환 등이라고도 한다. 형질전환은 1928년 영국의 그리피스가 폐렴쌍구균을 이용하여 실시한 실험이 계기가 되어 발견되었다. 폐렴쌍구균·파라이질균·인플루엔자균·뇌척수막염균·대장균 등의 박테리아에서 볼 수 있는 현상이다.폐렴쌍구균을 예로 들면, 다당류로 이루어진 두꺼운 막, 즉 협막을 가진 S형균으로부터 DNA를 추출하여 이것을 다당류성 협막을 가지지 않은 R형균에 작용시키면 R형균의 일부가 S형균으로 변한다. 이것은 S형 세균의 DNA가 R형 세균 속에 들어가서 유전자 발현을 하기 때문이다. 전환을 일으키는 데 필요한 DNA의 최소량은 약 10만분의 1mol이며, DNA의 sigle strand를 주는 것보다도 double strands를 주는 것이 전환을 일으키기 쉽다.이 실험을 통하여 형질전환 실험에 의하여 유전자의 본체가 DNA라는 고 분해해 버리는 현상을 말하며, 그런 작용을 하는 효소를 제한효소라고 한다. 이에 반하여 제한효소가 인식하는 염기배열 중의 특정한 염기를 메틸화하여 제한을 받지 않는 상태로 DNA를 일시적으로 변화시키는 현상을 수식이라고 하고, 이런 작용을 하는 효소를 수식효소라고 한다.제한효소는 그 특성(절단양식이나 활성발현인자 등)에 의해 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ형의 3군(群)으로 대별된다. Ⅰ형 효소는 활성발현에 APT, S-아데노실메티오닌 및 마그네슘이온(Mg2+)을 필요로 하고, DNA 속의 인식염기배열로부터 떨어진 부위를 절단하는데 그 위치는 일정하지 않다. Ⅱ형효소는 유전공학에서 널리 사용되는 것으로 활성발현에 마그네슘이온을 필요로 하여 DNA분자의 특정한 염기배열을 인식하고 그 부위 또는 인식염기배열로부터 일정 염기 떨어진 인접부위를 정확하게 절단한다. 또 이 효소의 인식염기배열은 3~6개의 2회전 대칭구조를 취하고 있는 경우가 많다. Ⅲ형효소는 활성발현에 ATP와 마그네슘이온을 필요로 하고, DNA 속의 인식염기배열로부터 수십 염기 떨어진 부위를 절단한다. 제한효소는 이미 200여 종 이상 발견되었고, 생산균주고유의 특이성을 나타내기 때문에 생산균의 속명의 머리글자 1문자, 종명의 머리글자 2문자 및 주명을 붙여 써서 표시한다. 같은 균주가 2종 이상의 제한효소를 생산하는 경우에는 순차적으로 로마숫자를 첨가하는 명명법이 널리 사용되고 있다. 예를 들면 대장균 Escherichia coli의 B주에서 발견된 제한효소는 Eco B라고 표기하며, 이것은 Ⅰ형효소이다. 같은 대장균 RY13의 경우는 Eco RⅠ이고, 또 R245의 경우는 Eco RⅡ가 되며, 모두 Ⅱ형효소이다.-DNA 전기영동대부분의 생물학적 거대분자들은 전기적으로 전하를 띠며 따라서 전기장에서 이동할 수 있다. 예를 들면 음전하를 띤 DNA가 들어 있는 수평관 양쪽에 전지의 끝을 연결하면 분자들은 관의 음전하 끝에서 양전하를 띤 끝으로 이동할 것이다. 이동방향은 전하의 부호에 따르지만 이동속도는 침강에서처럼를 침투하면서 이동한다. 젤은 분자들이 복잡한 그물 형태를 이루고 있어서 거대 분자들은 좁고 뒤틀린 통로를 통해 비집고 이동하게 된다. 그 결과 작은 분자들은 쉽게 지나 갈 수 있으며 결과적으로 이동속도는 분자량 M이 감소함에 따라서 증가한다. 이동거리 D는 M과 다음과 같은 대수 관계를 이룬다.D = a - b log M여기에서 a,b 는 완충용액, 젤 농도, 온도에 영향을 받는 실험적으로 결정된 상수이다.5. Method1)plasmid DNA 추출 (miniprep)-MaterialsEcherichia coli(Competent cell : DH5α), plasmid DNA(pUC19 vector), 피펫, 원심분리기, E-tube, collection tube, vortex mixer, column, plasmid DNA purification kit, resuspension buffer(glucose, Tris·Cl, EDTA, RNase A), lysis buffer(NaOH, SDS), neutralization buffer(potassium acetate, glacial acetic acid)-Method1. colony 1개를 Ampicillin이 포함된 liquid LB에 접종하고 37도℃ shaking incubator에서 12~14시간(O/N) 키운다. (이 과정은 조교님이 미리 해주셨다.)2. Bacteria가 자란 LB(SoLⅠ)중 1ml을 E-tube로 옮긴다.3. 12,000rpm 30초간 원심분리하고 상층액을 완전히 버린다.4. Resuspension buffer(Re buffer)를 250㎕넣고 vortexing을 하여 pellet을 완전히 풀어준다.5. Lysis buffer(LY buffer)를 250㎕넣고 5~6회 살짝 흔들어준다. 단, 5분을 넘기지 않도록 해야한다.6. Neutralization buffer(SoLⅢ)를 350㎕넣고 9~10회 살짝 흔들어준다.7. 12,000rpm에서 10분간 centrifuge한다. incubation한다.13. 12,000rpm에서 1분간 centrifuge한다.2) 형질전환 transformation-Materialscompetent cell, ice, 피펫, 3차 증류수, (-)DNA(Ampicillin 내성 없음), miniprep한 DNA, spreader, LA agar plate, 알코올 램프-Method1. competent cell을 얼음에 꽂아두고 완전히 녹인다.2. 한 쪽 E-tube에는 competent cell 10㎕, (-)DNA 2㎕, 3차 증류수 38㎕를 넣고, 다른 쪽 E-tube에는 competent cell 10㎕, miniprep한 DNA 2㎕, 3차 증류수 38㎕를 넣는다. 1초간 vortexing하여 DNA와 competent cell이 잘 섞이도록 한다.3. 1∼10분 동안 ice incubation한다.4. LA agar plate(Ampicillin이 포함된 LB agar)에 50㎕를 떨어뜨린 후 spreader로 골고루 펴서 말린다.5. Plate를 뒤집어서 37℃에서 배양한다. 12～16시간 후에 콜로니 형성 여부를 관찰한다.3)제한효소반응(restriction enzyme digestion) 및 전기영동-Materials플라스미드 DNA(recombinant DNA), 제한효소(EcoRⅠ, SacⅡ), 10X buffer, D.W., 6X DNA loading dye (Bromophenol blue(BPB)+Xylene cyanol(XC)), 1 kb size marker(표준 단편), 1X Tris-acetate/EDTA(TAE) buffer, gel running kit, E-tube, 피펫, 37℃ water bath, polyglove, 면장갑, 전자레인지, EtBr(ethidium bromide), 저울, Agarose, 삼각플라스크-Method1.(제한효소 반응) DNA (300ng/㎕) 2㎕, 10X buffer 1㎕, EcoRⅠ(10~20units/㎕) 1㎕, SacⅡ(10~로 이 염색액을 다룰 때에는 반드시 폴리글러브를 사용한다. 사용 후 각 실험실에 비치된 폐액통(TAE전용)에 분리수거한다.)4.(gel 굳히기) large comb을 gel plate에 고정시킨 후 gel maker stand에 따뜻한 agarose 용액을 주형에 붓는다.5.(gel 설치) gel이 완전히 굳은 후 comb를 제거한 다음 gel을 tank안에 설치하고, gel을 1mm 정도의 두께로 덮을 수 있을 정도로 충분한 양의 buffer(1X TAE)를 가한다.(gel이 굳으면 gel maker stand에서 gel maker plate의 돌출된 양쪽 부분을 잡고 들어올리면 된다. 이때 stand 와 plate 사이로 흘러들어간 gel이 굳어 plate뒷면에 붙어있는 경우가 있다. plate의 뒷면에 굳은 젤을 제거하지 않고 tank에 넣을 경우 plate가 tnak 바닥과 밀착이 되지 않으므로 화장지로 plate 뒷면을 닦아준 후 tank에 넣도록 한다.)(gel은 시료가 주입될 홈이 (-)방향에 위치하여 DNA의 흐름이 (-)에서 (+)극으로 이동하게 설치한다. 이번실험에 사용하는 gel caster는 극 전환이 가능하므로 gel을 설치 후 running 하기 전에 극을 설정해주면 된다.)6.(sample 주입) 제한효소 반응을 한 DNA 시료와 그렇지 않은 DNA시료를 6X DNA loading dye와 혼합한 후 pipette을 이용하여 gel의 홈에 혼합액을 조심스럽게 loading한다. (37℃에서 제한효소로 반응시킨 sample은 수분이 증발하여 tube cap이나 벽면에 존재하므로 원심분리기로 2~5초간 가볍게 spin-down 한 후 loading 한다.)7.(sample runnung) gel tank의 뚜껑을 닫고 일정한 전압으로 gel을 running한다. (100V, 20분)8.(UV 관찰) 전기영동이 끝나면 gel을 자외선 하에서 관찰하고 촬영한다. (촬영은 조교님이 해주셨다.)6. Result↓marker←6238bp←5473이다.

자연과학| 2009.05.20| 7페이지| 1,000원| 조회(208)

제한효소, 형질전환, Transformation, EtBr, DNA 전기영동, l..

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효소의 작용에 미치는 온도, salt, pH의 영향

1. Title : 효소의 작용에 미치는 온도, salt, pH의 영향2. Date : 2008년 4월 25일 금요일 7,8교시3. Name4. Proposal-Principles & Introduction효소는 화학 반응에서 자신은 변화하지 않으면서 반응 속도를 빠르게 혹은 느리게 하는 촉매의 역할을 한다. 그러나 단백질로 이루어져 있기 때문에 반응의 범위가 상당히 제한적일 수밖에 없다. 일정 온도 이상을 벗어나거나 pH가 너무 낮거나 높을 경우 효소를 구성하는 단백질의 변성이 일어나 제 기능을 발휘할 수 없다.오늘 실험에 쓰이는 효소는-amylase로 녹말의 1-4 glycosidic linkage 가수분해를 촉매한다. α-amylase에 의한 녹말의 가수분해 과정에서 처음 단계에서는 덱스트린과 더불어 비교적 큰 각종 올리고당이 생성되며 시간이 지남에 따라 덱스트린의 분자량은 감소한다. 분자량이 큰 덱스트린은 녹말과 마찬가지로 요오드와 반응하여 푸른색을 나타내나 분자량이 작은 덱스트린은 적갈색을 나타내고 분자량이 훨씬 작은 덱스트린은 요오드에 의해 착색되지 않는다. 따라서 요오드 시약으로 녹말의 가수분해 정도를 확인할 수가 있다.amylase의 작용이 온도와 salt조건, pH조건에 따라 어떤 영향을 받는지 조사하고 최적조건을 찾자.5. Materials-amylase (from Bacillus amyloliquefaciens), 1% satarch 용액, 0.1N Iodine용액, pH 3.0, 7.0, 10.0 TE buffer (Tris-EDTA buffer), 증류수, 5%, 10%, 20%용액, 항온수조(water bath), 시험관, 시험관대, pipette, 얼음, 온도계, voxter mixer6. Methods1. 효소의 작용에 미치는 온도의 영향1) 6개의 시험관에 ①~⑥까지 labeling 한다.2) 각 시험관에 2㎖의 녹말용액, TE buffer(pH 7.0) 1㎖, D.W 1㎖을 넣는다.3) ①②번 시험관은 4℃(얼음), ③④번 시험관은 40℃(water bath), ⑤⑥번 시험관은 70℃(water bath)에서 5분간 incubation한다.4) 요오드를 20㎕ 넣는다.5) ②④⑥번 시험관에 각 40㎕의 α-amylase을 가하여 voxter mixer로 잘 섞고, 해당 온 도에 놓아둔다.6) 5분 후, 각 온도에서 효소가 들어가지 않은 시험관과 비교하여 발색반응이 어떻게 바 뀌었는지 관찰한다.2. 효소의 작용에 미치는 salt의 영향1) 4개의 시험관에 ①~④까지 labeling한다.2) 2㎖의 녹말용액, TE buffer pH7.0 용액 1㎖을 각각 넣고 잘 섞어준다.3) ①~④ 시험관에 D.W, 5%, 10%, 20% NaCl 1㎖를 넣고 잘 섞어준다.4) 70℃ water bath에 5분간 incubation시킨 후 요오드를 20㎕와-amylase 40㎕를 넣고 voxter mixer로 잘 섞은 다음 다시 40℃ water bath에 놓아둔다.5) 70℃ water bath에 다시 넣고 각 조건에 따른 발색반응의 변화를 통해 효소의 활성을 추정한다.3. 효소의 작용에 미치는 pH의 영향1) 3개의 시험관에 ①~③까지 labeling하고, 2㎖의 녹말용액을 넣어준다.2) ①~③번 시험관에 각각 TE buffer pH 3.0, pH 7.0, pH 10.0 용액 2㎖을 넣고 잘 섞 어준다.3) 70℃ water bath에 5분간 incubation시킨 후, 요오드를 20㎕와-amylase 40㎕를 넣고 voxter mixer로 잘 섞은 다음 40℃ water bath에 놓아둔다.4) pH 조건에 때른 발색반응의 변화를 통해 효소의 활성을 추정한다.7. Result1. 효소의 작용에 미치는 온도의 영향incubation 전incubation 후⑥번 시험관 즉,-amylase를 넣고 70℃에서 incubation 시킨 시험관에서만 효소가 작용하여 녹말을 분해, 색이 달라진다.2. 효소의 작용에 미치는 salt의 영향incubation 전incubation 후salt의 농도가 진해질수록 효소가 덜 활발해져서 요오드에 의한 착색이 많이 남아있다.3. 효소의 작용에 미치는 pH의 영향incubation 전incubation 후pH 3.0인 buffer에서는 요오드의 탈색이 거의 이루어지지 않았고, pH 7.0, pH 10.0 인 buffer에서는 거의 모든 요오드가 탈색되었다.8. Discussion-요오드-녹말 반응의 원리는 무엇인가?녹말은 포도당 사이의 결합각에 의해 나선형 중합체를 형성한다. 이 때 요오드() 용액이 첨가되면 요오드-녹말 복합체를 형성한다. 이 구조는 요오드가 나선형 구조 안쪽으로 선상으로 배열, 포집되면서 만들어지며, 이 때 녹말이 착색된다. 그러나-amylase에 의한 가수분해 작용으로-포도당 사이의 결합이 끊어지면서 녹말이 분해되면 이 복합체는 파괴되며, 요오드는 원래 색인 갈색을 띠게 된다. (실험에서 녹말의 색인 하얀색만 보이는 것은 첨가한 요오드 용액의 양이 너무 적기 때문)-실험 결과에 대해.첫 번째 실험에서 1번, 3번, 5번은 incubation 전과 후에 색이 변하지 않았으며 2번, 4번도 거의 변하지 않았으나 6번 시험관만 요오드가 탈색되었다. 1번, 3번, 5번은 각각 2번, 4번, 6번의 대조군으로-amylase를 넣지 않았기 때문에 색이 변하지 않은 것이다. 또한 2번과 4번은 최적온도 범위를 넘어 효소를 이루는 단백질의 변성이 일어나 탈색되지 않았다. 그러나 6번은 어느 정도 효소의 작용이 이루어지는 범위 안에 들어 녹말이 대부분 저분자 덱스트린으로 분해되었고, 그 결과 요오드가 탈색되었다.두 번째 실험에서도 salt의 농도가 높아질수록 효소의 활성이 줄어들어 요오드가 탈색되는 정도 또한 감소하는 것을 볼 수 있다. 이는 사과의 갈변을 막기 위해 사과를 소금물에 담그는 것을 생각하면 될 것 같다. 사과에는 폴리페놀 산화효소가 있어 껍질을 벗긴 채 공기와 접촉하면 반응하여 사과의 표면이 갈색으로 변한다. 그러나 소금물에 담구어 두면 효소의 활성이 줄어들어 사과의 갈변을 막을 수 있다.세 번째 실험에서는 pH 3.0에서는 거의 탈색이 이루어지지 않았고 pH 7.0, pH 10.0에서 탈색이 이루어진 것을 알 수 있다. 첫 번째 실험결과와 마찬가지로 pH 3.0에서는 최적 pH조건을 크게 벗어났기 때문에 단백질의 변성이 일어나 효소의 활성이 급격하게 줄어들어 녹말이 많이 가수분해 되지 않은 것이다. 반면에 pH 7.0과 10.0에서는 어느 정도의 효소가 활성을 띠는 pH조건을 만족하여 녹말이 저분자 덱스트린으로 분해되었기에 요오드가 탈색될 수 있었다.위의 세 가지 실험을 한 결과-amylase는 온도가 70℃일 때, NaCl의 농도가 0%일 때, pH는 7.0 또는 10.0일 때 높은 활성도를 보였다.일반적으로 우리가 알고 있는 최적온도와 최적 pH조건과 크게 벗어남을 알 수 있는데, 이것은-amylase를 Bacillus amyloliquefaciens라는 미생물로부터 추출했기 때문이다. (조교님께서 이 미생물은 고온의 환경에서도 살아가는 종이라고 말씀하셨다. 이러한 환경에서 적응한 결과-amylase 또한 이러한 조건에서 높은 활성을 보인다.)실제 문헌상으로 이 미생물에서 추출한-amylase의 최적온도는 50℃~70℃, 최적 pH는 5.0정도이다. 그러나 pH 12.0에서도 약 12%의 활성도를 보인다. (pH 10.0에서도 큰 활성도를 보인 것도 이것 때문인 것 같다.)

자연과학| 2009.05.20| 7페이지| 1,000원| 조회(404)

α-amylase, salt, 1-4 glycosidic link, 최적온도, 최적PH

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식물 색소 분리

1. Title : 식물색소분리2. Date : 2008년 4월 11일 금요일 7, 8교시3. Name4. Proposal - Principle & Introduction광합성은와 물로부터 빛에너지를 이용하여 유기화합물을 생성하는 과정이다. 즉, 빛에너지를 화학에너지로 바꾸는 과정이며, 동화작용이다. 광합성은 엽록체라 불리는 식물의 세포 내 기관에서 수행된다. 엽록체는 빛에너지를 흡수하는 광합성 색소를 가지고 있으며 주색소로 엽록소a를, 보조색소로는 엽록소b, β-카로틴, 크산토필 등을 갖는다.식물세포의 엽록체 내의 여러 종류의 색소는 종이 크로마토그래피를 이용하여 여러 개의 점으로 분리할 수 있다. 크로마토그래피는 혼합물 속에 들어있는 각 성분들의 정상상태(stationary phase)에 대한 흡착력(absorption)과 이동상에 대한 친화도(affinity) 등 두 가지 성질을 이용하여 순수한 물질을 분리하는 방법이다. 혼합물 속의 각 성분은 흡착력과 친화도에 따라 이동하는 거리에 차이가 나게 된다. 이동상의 거리에 대한 각 성분의 이동 거리를 Rf라 하고 특정한 고정상과 이동상에 대해 온도 등 실험조건이 일정하면 각 물질은 고유한 Rf값을 가진다.이번 실험에서는 여러 종류의 식물로부터 크로마토그래피를 이용하여 색소를 추출하고, spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정한다. 이를 통해서 추출한 색소가 어떤 색소인지를 알아낼 수 있다.5. Material개나리, 여과지(3M paper), 가위, pasteur pipette, conical tube, 전개용매(petrolium ether : acetone = 9 : 1의 혼합액), 자, tube 고정대, 막자사발 및 막자, centrifuge, e-tube, spectrophotometer, acetone, 이쑤시개, voxter mixer6. Method①개나리 잎을 따서 acetone 5ml를 넣고, 갈아준다.②갈아준 용액을 e-tube에 1ml 덜어 넣는다.③e-tube를 원심분리기에 넣고 13000~15000rpm으로 5분간 원심분리한다.이 때, 다른 e-tube에 증류수 1ml를 넣고 맞은 편에 끼워서 balance를 맞춘다.④원심분리 된 용액에서 상등액을 새 e-tube에 옮긴다.3M paper⑤여과지 끝으로부터 2.5cm 정도 되는 곳에 용액을 5번 정도 점적한다. (많이 할수록 좋다. 단, 다시 점적할 때는 이전에 점적한 것이 마르고 나서!)⑥이쑤시개로 끝부분을 고정한다.⑦전개 용액에 점적한 부분이 닿지 않도록 담근다. (여과지의 옆면이 tube에 닿지 않도록 주의!)⑧색소 분리를 확인하고 전개 용액이 더 이상 올라가지 않으면 Rf값을 측정한다.⑨가장 두드러지게 나타나는 녹색 밴드 부분을 자른다.⑩자른 것을 1ml acetone에 녹인다. (voxter mixer 이용)⑪spectrophotometer로 380~760nm의 파장에서 흡광도를 측정, 그래프를 그리고 최종흡수파장을 확인한다.7. Result-Rf값 :전개액 7cm / 초록색 2.3cm / 아래쪽 노란색 5cm / 약간 위쪽 노란색 6.5cm초록색 색소아래쪽 노란색 색소위쪽 노란색 색소-흡광도 그래프가장 선명했던 위쪽 노란색 색소를 추출하여 흡광도를 측정하였다.7. Discussion-흡광도 그래프에 대해.흡광도(absorbance)는 다음과 같이 정의된다.(: 입사광의 세기,: 시료를 통과한 빛의 세기,: 투광도(Transmittance). 시료를 통과한 입사광의 분율.)그런데 정상적인 경우라면 시료를 통과하기 전의 빛의 세기는 통과한 빛의 세기보다 클 것이므로따라서 언제나 흡광도의 값은 양수가 된다. (만약 음수라면. 즉, 시료를 통과한 후의 빛이 통과하기 전보다 더 세다는 이야기.)양수로 나타나야 할 흡광도 값이 음수로 나타나는 이유는 알 수 없지만(흡광도 측정은 조교선생님께서 하셨으므로) 이런 흡광도 그래프로만으로는 이 색소가 무엇인지 알아내기는 어렵다.-Thin Layer Chromatography (TLC)얇은 막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography; TLC) 방법은 유기 화학 실험실에서 물질의 확인 및 분리를 위해 가장 보편적으로 사용되는 분석 방법 중 하나이다. 뿐만 아니라 반응의 진행 정도를 확인하는 데도 효과적으로 이용된다. 경우에 따라서는 반응 도중의 TLC를 면밀히 관찰하면 수행 중인 반응 메커니즘이나 중간체 생성을 쉽게 이해할 수도 있다.얇은 막 크로마토그래피는 액체상 크로마토그래피(liquid phase chromatography)의 일종이며, 미량의 시료를 손쉽게 빠른 시간 내에 분리할 수 있는 수단이다. 흡착제(cellulose, alumina, silica gel 등)를 얇게 입힌, 유리판 또는 플라스틱판의 한쪽 끝에 미량의 시료를 점적한 후 적당한 전개 용매가 들어 있는 전개 용기에서 전개시키면 흡착제 막의 모세관 작용에 의해 전개 용매가 이동하면서 시료가 각기 다른 위치로 이동되는데, 이동 위치는 시료와 흡착제간의 흡착력과 이동상간의 친화력에 의존한다.분리 시료 반점은 발색 시약으로 발색시키거나 UV 또는증기를 흡착시키는 방법 등으로 확인할 수 있다. 시료 중 방사성 동위 원소가 있을 때는 이를 계수기로 확인할 수도 있다. 또한 TLC판을 염색시킨 후에 스캐닝(scaning)하여 정량할 수도 있고, 반점을 긁어내어 추출한 후 다른 방법으로 정량 및 정성을 할 수도 있다.오늘날 대부분의 연구실에서는 알루미늄판, 유리판 및 플라스틱판에 균일하게 흡착제를 입힌 상품화된 TLC판을 구입하여 사용한다.-분리용 TLC일반적으로 이용하는 TLC는 대부분 분석을 목적으로 이용한다. 그러나 TLC를 혼합물의 분리에도 이용할 수 있다. 이러한 방법을 분리용 TLC(preparative TLC)라고 한다. 분석용 TLC나 분리용 TLC의 원리는 유사하다. 분석용 TLC에서의 흡착제 두께는 약 0.25mm정도이지만, 분리용 TLC(prep-TLC라고도 함)의 층 두께는 최소한 3mm정도이다. 분리용 TLC에서는 보통 20cm×20cm 크기의 판을 사용하며 시료 200mg 정도를 분리할 수 있다. 분리용 TLC판에 연필로 연하게 선을 긋고 여기에 스포이드나 피펫을 이용하여 시료를 반복해 점적한다. 이 때 한 번 점적한 후에 용매를 충분히 건조시키고 다시 점적한다. 가능한 한 넓게 퍼지지 않고 선의 폭이 고르게 점적해야 한다. 선택된 전개 용매로 전개 한 후에 각 성분의 띠를 확인하고 연필로 표시한다. 표시된 부분을 긁어내어 잘 녹는 용매로 추출한다.-이차원 TLC복잡한 혼합물의 경우에는 단일 전개 용매나 한 가지 혼합 용매만으로 분리가 어려울 때가 있다. 이런 복잡한 혼합물 분리에는 이차원 TLC(bi-dimensional TLC; 2D-TLC)를 이용한다. 시료를 정사각형 TLC판의 한 쪽 구석에 점적하고 먼저 선택한 용매로 한 번 전개시킨다. TLC판을 꺼내어 건조시키고 다른 용매로 전개시킨다. 이때 두 번째 전개는 첫 번째 전개 방향에 대해 수직으로 전개시킨다. 이러한 2D-TLC는 구조적으로 유사한 혼합물의 분리에 유용하다. 특히, 단백질 가수분해로 얻는 아미노산 혼합물들의 분리에 유용하다.-크로마토그래피의 종류에 대해 좀 더 알아보자.흡착 크로마토그래피(absorption chromatography)는 고체 정지상과 액체나 기체의 이동상을 이용한다. 시료는 고체 입자의 표면에 흡착되어 정지상과 이동상 사이의 평형으로 분리된다.분배 크로마토그래피(partition chromatography)에서는 액체 정지상이 고체 지지체 표면에 얇은 막을 형성한다. 시료는 이 정지상 액체와 이동상 사이에 분배평형을 이룬다.이온교환 크로마토그래피(ion-exchage chromatography)에서는와 같은 음이온들 혹은같은 양이온들이 수지(resin)라고 부르는 고체 정지상에 공유결합 되어있다. 반대 전하의 이온들은 정전기적 인력에 의해 정지상에 이끌린다. 이 때 이동상은 액체이다.친화 크로마토그래피(affinity chromatography)는 가장 선택적인 크로마토그래피 방법으로서 정지상에 공유결합(고정)된 분자와 용질 중 한 분자가 특별한 상호작용에 의해 분리되는 방법이다. 이 때, 단백질-항체 반응을 이용하기도 한다.-색소의 종류와 역할노란색을 띠고 있으며 Rf값이 크다는 사실을 고려할 때 유력한 색소는 카로틴과 크산토필 둘 중 하나이다. 보통 Rf값은 카로틴이 크산토필보다 크다는 사실을 생각한다면 이 색소를 카로틴이라고 생각하는 것이 타당할 것 같다.카로틴(Carotene)이라는 용어는의 분자식을 갖는 관련된 색소를 일컫는 말이다. 카로틴은 황록색 색소체로 당근과 다른 과일, 야채들은 카로틴 때문에 황록색을 띤다. 엽록소a를 제외한 다른 보조색소들이 그러하듯이 카로틴 또한 엽록소a가 흡수하지 못하는 다른 파장의 빛을 흡수하여 그 빛 에너지를 엽록소a로 전달한다. 하지만 보조색소의 또 다른 중요한 역할은 photoprotection이다. 엽록소가 강한 빛을 흡수해서 산소와 반응한 결과 손상되지 않도록 과도한 빛 에너지를 흡수하고, 분산시킨다. (사람의 눈에서도 이와 비슷한 역할을 하는 카로티노이드가 존재한다.)화학적으로, 카로틴은 여섯 개의 이소프렌으로부터 생화학적으로 합성되며, α-카로틴과 β-카로틴으로 구별된다. (물론 γ나 δ,ε카로틴 또한 존재) β-카로틴은 두 개의 retinyl group을 포함하고 있으며, beta-carotene dioxygenase에 의해 retinal(비타민 A 알데히드)로 쪼개진다. 카로틴은 간에 저장되며 필요할 때마다 비타민 A로 전환되므로 프로비타민으로 분류된다.

자연과학| 2009.05.20| 6페이지| 1,000원| 조회(531)

TLC, 광합성, 종이 크로마토그래피, 베타카로틴, 카로틴

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삼투압의 측정

1. Title : 삼투압의 측정2. Date : 2008년 3월 21일 금요일 7,8교시3. Name4. Proposal‘부피와 질량 변화 측정’과 ‘Chardakov Method', 이 두 가지 방법으로 삼투포텐셜을 구해보고 식물체 내에서 수분포텐셜이 갖는 의의를 알아본다.Principles & Introduction물의 자유에너지 상태를 나타내는 수분포텐셜은 식물 세포 사이에서 물의 이동을 결정하는 요인이다. 수분포텐셜이 높은 곳에서 낮은 곳으로 물의 이동이 일어나기 때문이다. 수분 포테셜을 이루는 세 가지 중요한 요소로는 압력 P, 중력 G, 삼투포텐셜이 있다. 그리고 이들의 관계는 다음과 같은 식으로 표현할 수 있다.= P + G +식에서 나타나듯이 수분포텐셜은 삼투포텐셜과 비례관계를 가진다. 즉 삼투포텐셜이 감소할수록 수분 포텐셜도 감소하며, 삼투포텐셜이 증가할수록 수분포텐셜도 증가한다. 따라서 물의 이동은 삼투포텐셜이 높은 곳에서 낮은 곳으로 이동함을 알 수 있다. 삼투포텐셜을 식으로 나타내면 다음과 같다.=-RTCs(R: 기체상수 T: 절대온도 Cs: 삼투몰랄농도)이제 아래의 두 방법을 이용하여 측정한 삼투몰랄농도를 이용하여 삼투포텐셜을 구해보자.-부피와 질량 변호 측정을 통한 감자괴경의 삼투포텐셜 측정식물 세포를 각기 다른 농도의 설탕용액에 넣은 후 충분한 시간이 경과되면 세포 안팎의의 차이에 따라 세포 내로 물이 삼투하여 조직의 무게나 부피가 증가되거나 물이 빠져나가서 무게나 부피가 줄어들게 된다. 이러한 원리를 이용하여 식물세포의 삼투 포텐셜을 간단히 측정할 수 있다.-Chardakov Method정해진 농도의 용액에 식물조직을 잠기게 하면 삼투에 의하여 물이 식물조직으로 들어가거나 혹은 용액으로 나오게 된다. 이 때 그 용액은 극히 좁은 범위 내에서 농축되거나 희석된다. 만일 용액의 농도가 변하지 않았다면 그 용액의 수분 포텐셜은 잠겨있었던 식물조직의 그것과 같다고 추정할 수 있다. 이러한 밀도의 변화를 알아봄으로써 수분 포텐셜을 구한다.5. Materials감자, 1m(molality) sucrose 용액, 증류수, 비커, 페트리 접시, 시험관, 랩, 면도칼, 흡수지, 저울, weighing boat, 메틸렌블루 솔루션, 온도계, 마이크로파이펫, 시험관대, 핀셋4. Methods①10개의 시험관을 5개 1조로 나누어 각각 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40m 로 표시하고 각 조를 A, B 로 표시한다.②1m sucrose용액을 희석하여 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40m 로 만들고 (실제 실험과정에서는 이미 만들어진 용액을 사용) A시험관에는 20mL씩 B시험관에는10mL씩 각 농도에 해당하는 용액을 담는다.③A실험관의 온도를 측정 후 기록한다.④감자를 잘라 1정도 크기의 정육면체 모양의 감자조각 15개를 얻는다. 그리고 페트리 접시에 담은 후 랩으로 막는다.-랩으로 막는 것은 감자의 수분이 증발하는 것을 막기 위해서이다.⑤감자 조각을 3개씩 취하여 무게를 측정한 후 각 농도별 sucrose 용액이 담겨 있는 A시험관에 담는다.⑥B시험관에는 메틸렌 블루 솔루션을 넣고 잘 섞는다. (각 농도별 dye를 만드는 과정으로 마이크로파이펫으로 200㎕면 된다.)⑦A시험관에 감자 조각을 넣은 후 1시간 정도 되었을 때, 감자를 꺼낸 후 온도를 측정한다. 이 때, 처음 측정한 온도와 차이가 생기면 안 된다.⑧꺼낸 감자는 흡습지로 물기를 닦고 다시 무게를 측정한다.⑨마이크로 파이펫을 이용하여 A시험관 용액의 중간쯤에 B시험관에 들어있는 각 농도의 dye를 떨어뜨리고 떨어뜨린 방울이 이 용액 속에서 가라앉는지 뜨는지 관찰한다. Dye가 움직이지 않는다면 dye의 농도와 시험관 용액의 농도가 같다고 추정할 수 있다.⑩위의 실험을 각 농도의 설탕용액에서 반복하고 감자의 삼투압을 결정한다.7.Result-측정된 무게의 변화량과 설탕용액 농도와의 그래프농도(m)처음 무게(g)나중 무게(g)무게의 변화량(g)0.23.5163.9070.3910.253.7223.622-0.10.33.6233.7240.1010.353.5313.5630.0320.43.6573.647-0.01-용액의 온도: 21℃(변함없음)-메틸렌블루 dye의 움직임0.2m: 위로 뜬다.0.25m: 위로 뜬다.0.3m: 위로 뜬다.0.35m: 위로 뜬다.0.4m: 위로 뜬다.8.Discussion측정된 무게의 변화량과 설탕용액 농도와의 그래프를 그린 결과 대체로 몰랄농도가 증가함에 따라 무게의 변화량도 감소했다. 이는 낮은 농도의 sucrose 용액에서는 감자 세포내 삼투포텐셜이 용액의 삼투포텐셜보다 낮기 때문에 용액에서 세포내로 물이 들어와 감자조각의 무게가 증가했고, 농도가 증가함에 따라 삼투포텐셜 차이가 감소하여 무게의 변화량도 함께 감소했다고 생각할 수 있다. 특히 0.3m~0.4m 사이에는 감자 세포 내 삼투포텐셜과 용액의 삼투포텐셜이 같아서 어느 한 쪽으로 물이 일방적으로 이동하지 않는 지점이 있었고, 그 뒤로는 반대로 용액의 삼투포텐셜이 세포 내 삼투포텐셜보다 낮아져 세포에서 물이 빠져나가는 현상이 발생했다.그러나 0.2m scurose 용액에 넣었던 감자조각은 무게를 측정한 결과 질량이 지나치게 감소했다. 무게를 측정하기 전에 감자조각들의 물기를 제거하는 과정이 있는데, 살짝 손에 힘이 더 들어가 물이 많이 빠져 나왔기 때문이 아닐까 싶다. 물론 최대한 오차를 줄이기 위해 물기를 제거하는 과정을 한 사람에게만 맡겼지만 그것만으로는 부족했던 것 같다. 감자조각들을 핀셋으로 집어서 흡습지에 대는 식으로 물기를 제거한다면 좀 더 정확한 결과가 나올 것이라고 생각한다.메틸렌블루 dye의 움직임은 0.35m까지는 위로 뜨고, 0.4m부터는 가라앉거나 그 자리에 머물러 있을 것이라는 예상과는 달리 모두 위로 떠올랐다. 시험관을 시험관대에 올려놓은 상태가 아니라 손으로 시험관을 잡고 메틸렌블루 dye를 떨어뜨렸는데 손의 미세함 떨림 때문에 중간에 머물러있거나 가라앉을 것도 위로 떠오른 것이라고 생각한다.용액 중 메틸렌블루 dye의 움직임을 관찰할 때 아쉬웠던 것은 어떤 기준을 정해놓지 않아서 메틸렌블루가 떴는지 가라앉았는지 확실히 판단하기 어려웠다는 점이다. 또, 시험관 뒤에 파란색인 메틸렌블루가 잘 보이도록 흰색이나 보색인 노란색 종이를 뒤에 놓고 관찰했어야 했는데 생각이 거기까지는 미치지 못했다.감자조각들의 무게 변화량과 농도와의 관계를 수식으로 나타내면 다음과 같다. (너무 벗어난 결과가 나온 0.2m 농도에서의 무게 변화량은 무시)수식을 그래프로 나타냈을 때의절편, 즉 무게 변화가 생기지 않는 농도는 약 0.3869m이다. 이 농도를 세포 내 농도로 생각할 수 있으므로 삼투포텐셜은π=-RTCs=-(0.082L?atm/K?mol)×(273+21)K×0.3869m=-9.33L?atm?kg이 된다.만약 실험재료를 감자가 아닌 다른 생체조직을 이용한다면 어떤 결과가 나올까?①가공된 시판 sponge와 생체조직으로서 해면(sponge)를 재료로 했을 때시판 sponge를 재료로 하는 것은 의미가 없어보인다. 삼투현상은 기본적으로 ‘반투과성막’을 경계로 이루어지는데, 이미 반투과성막인 세포막이 손상되었다면 실험을 하는 의미가 전혀 없다.더 큰 문제는 생체조직으로서 해면을 재료로 할 때이다. 일단 삼투포텐셜 차에 의해서 삼투현상이 일어나기는 하겠지만 동물세포는 저장액에 넣게 되면 세포 내로 물이 들어와 세포가 터지는 용혈현상이 일어나고 이 때 많은 세포내 물질이 방출된다.. 이 때문에 저장액에 넣었음에도 불구하고 질량이 줄어든다거나 용액의 농도가 크게 달라져 Chardakov Method를 적용할 수 없다는 등의 문제가 발생한다. 게다가 물기를 제거하는 것도 거의 불가능하다. 단단한 감자조각의 물기를 제거하는 과정에서도 오차가 생기는데 물을 빨아들이는 성질이 있는 해면의 물기를 제거할 때에는 얼마나 큰 오차가 발생할까?

자연과학| 2009.05.20| 5페이지| 1,000원| 조회(708)

수분포텐셜, 삼투압, 삼투포텐셜, Chardakov Method

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