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PCR을 이용한 cloning방법

PCR cloning1. PCR의 정의 : Polymerase Chain Reaction,(PCR)은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 genome과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다.2. PCR의 원리1) DNA 의 변성 (Denaturation)92 °C ~ 95 °C로 가열하여 이중가닥 DNA(dsDNA)를 단일가닥 DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 단일가닥 DNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA 중합효소도 온도가 아주 높은 상태에서는 변성되어 사용하지 못하게 될 수 있으므로 보통 94 °C로 한다. 첫 번째 cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킨다.2) Primer의 결합 (Annealing)50 °C ~ 65 °C에서 진행된다. Primer가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖고 있는 DNA 에 결합하는 단계이다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직 하다. 보통 30초가량 지속되는 이 단계에서 primer의 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작된다.3) DNA의 신장 (Elongation)70 °C ~ 74 °C (Optimal temperature - 72 °C)에서 시행하며 원하는 PCR product의 크기가 크 거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq 중합효소는 보통 1분에 2,000-4,000 염기쌍을 중합할 수 있으므로 원하는 PCR산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배 당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle에는 약 10분 정도 시간을 주는 것이 좋다.3. PCR을 이용한 cloning 방법Figure . T-vector1)T-vectorFigure . Phosphodiester bond between PCR product and T-vectorPCR의 끝부분은 bler에 polynucleotide kinase라는 효소를 넣어 5‘ phosphate를 달 수 있다. 또한 PCR product는 3’ 끝 에 A가 하나 더 존재한다. 왜냐하면 우리가 흔히 쓰고 있는 Taq polymerase는 PCR이 완료 되었을 때 끝부분에 A를 하나 더 붙이고 끝나는 특징이 있기 때문이다.따라서 PCR product를 이용한 cloning에서는 T-vector를 이용한다. (T-vector 제조 방법은 하단의 box참고)T-vector는 PCR product와 match를 이루기 위하여 벡터의 3‘끝부분에 thymine이 붙어있다. T-vector와 PCR product가 서로 결합할 때는 primer쪽은 phosphate가 없어서 서로 연결이 되지 못하고 다른 한 부분만 연결이 되어 있게 된다. 그러나 이렇게 연결이 되어 있다 해도 phosphodiester bond로 붙어 있던 DNA는 효소의 처리 없이 떨어지지는 않는다. 그러나 꼭 T-vector를 이용해야만 하는 것은 아니다.Blunt end로 잘려지는 enzyme을 이용하여(EcoR,SmaΙ 과 같은 enzyme)vector를 blunt end로 만든 후 전기영동한다. gel에서 완전히 잘린 DNA만 잘라 정제하고 vector 5ug당 dTTP를 5mM로 고농도로 처리한 후 Taq DNA polymerase를 두시간 동안 처리한다. 처리 후 다시 정제하여 ligation반응 당 10~25ng씩 사용한다.Box1. T-vector의 제조 방법T-vector를 이용하지 않고 cloning하는 방법은 PCR product에 Klenow enzyme을 처리하여 말단에 붙은 A를 제거하여 blunt end로 만들어 준 다음에 T4 polynucleotide kinase를 처리하여 5‘phosphate를 달아 주면 blunt end로 잘린 vector와 ligation이 가능해진다. 이 방법 외에 최근에 소개된 TOPO TA Cloning kit를 이용하면 Vaccinia virus에서 칠 수 있다.2)Primer에 enzyme site를 붙여서 cloning하는 방법Figure restriction site가 들어 있는 primer를 이용한 cloning위의 방법 외에 restriction site를 가지고 있는 primer를 고안하여 cloning하는 방법도 있다. PCR후에 증폭된 단편들을 제한효소로 처리하면primer 서열내부에서 각 분자가 절단되어 결국 standard cloning vector내부로 효율적으로 ligation 될 수 있는 sticky-end를 가진 단편들이 남게 된다. 이 방법을 사용할 때에는 primer 제작에 유의해야하는데 제한효소 서열의 부가가 primer자체의 특이성을 저하시키지 않고 hair pin이나 dimer를 형성하지 않아야 한다.또한 primer를 디자인할 때는 5‘말단이 A가 되지 않도록 한다. 또한 여분의 nucleotide를 추가해야 하는데 제한효소는 linear strand DNA의 말단에 있는 인식서열은 절단하지 않는 경우가 있기 때문이다. PCR primer는 5‘ 말단 쪽에 mismatch가 있어도 거의 문제가 없기 때문에 adaptor를 추가해준 primer를 사용한다. PCR의 2cycle동안은 제한효소의 인식서열을 포함하는 adaptor 부분은 primer의 anealing에 영향을 미치지 않기 때문에 Tm의 예상값은 adaptor 부분을 제외한 유전자 특이적 영역을 기준으로 한다. 3cycle째 이후에는 adaptor 부분에 상보적인 서열이 합성되므로 실제의 anealing은 더 높은 온도에서 되지만 처음의 온도로 하여도 무방하다. 이 방법을 이용하면 2개의 primer에 다른 제한효소 인식부위를 만들어 vector에 들어간 insert의 방향을효소oligonucleotide 서열절단효율(%)2시간후20시간후BamHⅠCGGATCCGCGGGATCCCG10>9025>90SmaⅠTCCCCCGGGGGA>90>90KpnⅠGGGGTACCCCCGGGGTACCCCG>90>90>90>90XbaⅠG한 Primer를 제작한 cloning은 제한효소가 PCR product의 제한효소 인식부위를 인식하지 못한다는 단점도 있다. 이러한 단점은 실험 전 디자인을 잘 하면 극복 할 수 있는데 특히 제한효소에 따라 요구되는 추가염기수가 다르므로 사전에 이에 대한 충분한 이해가 필요하다. 따라서 제한효소의 특성 표를 사전에 반드시 확인해 봐야한다. 또한 DNA농도가 너무 높은 경우 DNA 용약의 높은 점성으로 인해 반응이 저해될 수 있다. 0.05-1 μg/μl의 DNA가 적절하다.Methyl화의 영향도 생각해 볼 수 있는데 DNA의 메틸화는 제한효소활성에 중대한 영향을 주므로 사용하고자하는 제한효소의 메틸화 특성과 자르고자하는 DNA의 메틸화 여부를 사전에 반드시 확인해야 한다. 생명체에 존재하는 methyl화 반응은 크게 Dam methylation, Dcm methylation, CpG methylation으로 나눌 수 있는데, Dam과 Dcm methylation은 주로 미생물의 메틸화 반응이고 고등생물의 경우엔 CpG 메틸화 반응이 주를 이루고 있다. 따라서 고등 동식물로부터 추출한 genomic DNA를 절단하고자 할 때 사용할 제한효소가 CpG 메틸화에 영향을 받는지 반드시확인을 해야 한다. 가령 Ava I, Not I, Sma I 등의 효소들은 인식자리의 C에 메틸기가 붙어있을 경우, 그 부위를 절단 할 수 없다. 또한 Apa I 이나 Ban I 등은 인식자리의 다음 염기가 G가 되고 마지막 C염기에 메틸화가 되어 있으면 그 부위를 절단하지 못한다. 사전에 제한효소의 메틸화 특성표를 충분히 살펴보아 주의를 기울인다. 흔히 Plasmid DNA의 cloning에 사용하는 대장균주들은 dam과 dcm 유전자를 가지고 있다. 이와 같은 대장균주에서 정제한 DNA는 GATC의 A염기에 그리고 CCWGG의 처음C염기에 메틸화가 되어 있는데, 몇몇 제한효소는 이와 같은 메틸화에 의해 절단이 제한되고 있다. Bcl I, Dpn II, Mbo I은 Dam 메틸화 DNUMP를 포함한 서열로 한다.5‘ CAUCAUCAUCAU 3' 이 primer를 이용하여 얻은 PCR 산물은 primer에서 유래한 5’말단에 Uracil 을 함유한 DNA가 된다. 이 DNA에 Uracil DNA gycocylase에 의해(UDG)가 작용하여 DNA에 포함된 Uracil을 제거한다. 그 결과 생기는 탈 염기 부위(AP site)는 약 알칼리성 조건에서 쉽게 가수분해 되어 3'쪽에는 12염기가 긴 한 가닥 영역이 형성 된다. UDG cloning vector는 이 한 가닥 영역에 상보적 결합을 포함하는 특수한 3‘돌출 말단을 갖고 있어 PCR 산물과 쉽게 두 가닥을 형성한다. 이 두 가닥 영역은 37℃에서 안정하므로 ligation하지 않고 직접 competent 세포에 도입하면 대장균내의 수복계로 결합되어 그대로 형질전환체를 얻을 수 있다. insert를 포함하지 않은 vector의 self ligation은 이론상 있을 수 없으므로 얻어진 subclone은 insert를 가질 확률이 매우 높다. 이 방법은 조작이 간단한 반면에 특별한 adaptor서열을 가직 primer가 필요하다는 것과 vector의 자체제작이 불가능하다는 단점이 있다.uracil DNA glycosylase는 AP endonuclease와 같이 cytosin의 탈 amino화로 생기는 이상 염기인 Uracil을 제거, 수복하는 기능을 갖는다. 이 3‘돌출부분의 서열은 vector에 따라 CATCATCATCAT와 CTACTACTACTA의 2종류가 있고 vector에 넣을 때에 PCR산물의 방향을 결정할 수 있도록 되어 있다.4. Cloning후 plasmid DNA 분리 methodcloning할 때 transformation 과정에서 문제가 생겨 clear한 clone을 얻지 못하는 경우가 있기도 하지만 보통은 prep과정에 대한 자세한 숙지가 없기 때문에 clear한 결과를 얻지 못하는 경우가 많다. 보통 사용되는 방법은 Alkali lysis method로 cell 다.

자연과학| 2011.11.01| 4페이지| 1,500원| 조회(822)

PCR, restriction enzyme, cloning, TA vector, CpG methylation

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Hybridoma Selection

Hybridoma Selection1. Polyclonal antibody와 Monoclonal antibody항체는 일반적으로 외부물질을 생물체 내에 주입, 체액성 면역반응을 유도하여 항원에 대한 항체 생성을 유도하고, 혈액을 채취하여 얻게 된다. 이러한 방법으로 얻은 항체는 대게 polyclonal antibody이다. 체액성 면역반응에서 항원은 여러 가지 APC(antigen presenting cell)에 의하여 작은 조각 -epitope(항체가 인식할 수 있는 최소한의 단위)으로 B cell에 보여 지게 되고 B cell을 활성 시킨다. B cell은 이러한 활성과정에서 항체를 만드는 전체 유전자 가운데 항원에 반응할 수 있는 항체를 만드는 유전자만이 재배열되고 나머지 불필요한 유전자는 제거되어 한가지의 항체만을 다량으로 생성하여 체외로 분비하는 plasma cell로 분화한다. 항원은 일반적으로 여러개의 epitope을 가지므로 분화된 plasma cell도 여러종류이며, 따라서 생성되는 항체도 여러 가지이다. 이렇게 여러종류의 plasma cell에서 분비된 여러종류의 항체의 전체집합을 polyclonal antibody라 하며, 한종류의 plasma cell에서 만들어진 한 종류의 항체만을 monoclonal antibody라 한다.2. Monoclonal antibody의 필요성 & 얻는 방법Polyclonal antibody는 여러 가지 종류의 항체가 섞인 것이므로 항체를 이용한 실험을 할 때, 원하지 않는 다른 항원에도 반응을 보이는 경우가 있다. 그러므로 Monoclonal antibody가 필요한데 얻는 방법은 Polyclonal antibody를 affinity chromatography 등을 이용하여 분리하는 방법, plasma cell자체를 완벽하게 한 종류의 세포만 배양하여 배양액에서 분비된 항체를 얻는 방법, hybridoma를 통해 얻는 방법이 있다. 첫 번째 방법은 효율성이 떨어지고 실제로 잘 분리되지 않는다. 두 번째 방법은 plasma cell은 분화가 끝난 세포이므로 계대배양을 얼마 거치지 못하고 죽어 버리는 단점이 있다.그림 1- hybridoma3. Hybridoma의 생산plasma cell과 myeloma cell을 융합하는 방법이다. 즉, plasma cell의 항체 생산 능력과 체액성 암세포주인 myeloma cell의 immortality 능력을 두 세포의 융합에 의하여 동시에 얻고자 고안되었다.세포융합은 Sendai virus나 polyethylene glycol(PEG)를 이용하여 이루어지며 두 세포가 성공적으로 융합되었다면 그 융합된 hybridoma는 항체 생산 능력과 immortality를 동시에 갖는다. 이 과정에서 세포융합은 반드시 다른 종류의 세포를 선택하여 일어나는 것이 아니라 같은 종류의 세포 사이에서, 혹은 2개 이상의 세포 사이에서도 일어나므로 반드시 두 종류의 다른 세포사이에서 만들어진 hybridoma를 선택하는 과정이 수행되어야 한다.3. Hybridoma selectionHAT(hypoxanthine, aminopterin, thymidine)배지를 이용한 선택과정이 수행되며 사용되는 myeloma 세포주는 반드시 Ab-HGPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)의 성질을 가지는 것이 사용되어야 한다. 즉, myeloma 세포 자체에 의하여 만들어지는 항체가 없어서 만들어진 hybridoma가 원하지 않는 항체를 생산하지 않아야하고 HGPRT 효소의 기능이 없어야 한다.포유류의 세포는 DNA합성 시 두 가지의 경로를 사용하는데, 하나는 de novo pathway이고 다른 하나는 salvage pathway이다. de novo pathway에서 phosphoribosyl pyrophosphate는 THF(tetrahydrofolate)에 의하여 methyl, 혹은 formylrl를 받아 uridine과 결합, 핵산염기의 기본구조를 만드는데, HAT배지의 aminopterin은 THF와 유사한 구조를 가져 이 과정을 억제한다. 따라서 HAT배지에서는 이 경로를 통한 핵산의 생합성이 일어날 수 없다. 곧 세포는 salvage pathway를 사용하여야 하는데, 이 경로에서 hypoxanthine과 thymidine이 결합하여 핵산염기를 만드는데 관여하는 효소가 HGPRT이다. 따라서 사용하는 myeloma 세포는 이 경로를 통하여 핵산을 만들 수 없다.즉, plasma cell 만의 융합체는 자체의 immotality에 의하여 죽게되고 myeloma cell만의 융합체는 핵산합성이 억제되므로 죽게 된다.따라서 이 배지에서 생존 가능한 세포는 두 종류의 세포 융합체 만이 살게 된다. 초기에 이 융합체는 원래의 두배수 이상의 염색체를 가지므로 매우 불안정하며, 세포분열을 거치는 동안 본래의 염색체 수를 가지기 위하여 계속적으로 유전자를 제거해 나간다. 이 과정에서 생존에 필수적인 유전자가 제거되면 hybridoma는 죽으며, 항체생산에 관련된 유전자를 제거하여 항체를 생산하지 않는 세포가 되기도 하므로 형성된 hybridoma의 유용한 항체생산 여부를 조사하여야 한다.

자연과학| 2009.03.22| 2페이지| 1,500원| 조회(512)

단일클론항체, selection, hybridoma, monoclonal an..

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IgG의 Specific의 원인

IgG의 Specific의 원인1. IgG의 기능면역글로불린 중 가장 농도가 높다. 유일하게 태반을 통과해서 태아와 신생아를 감염으로부터 방어하는 역할, 1차 감염후기와 2차 감염 시 혈액에 존재하며 보체를 활성화 시킨다.▲ 그림 IgG의 구조2. IgG 분자의 기본 구조2개의 heavy chain과 2개의 κ나 λ중 하나인 light chain으로 구성된 단량체(Monomer)이다.(그림1 참고)IgG는 항원과 결합하기 위하여 hinge region의 변화로 형태가 변형될 수 있다. (그림2에 보충설명 있음)IgG 아형은 γ chain의 다형성 항원 결정부위에 대한 항혈청으로 구분할 수 있다.IgG 아형들은 탐식구 결합과 보체 활성도에서도 차이가 있다.각 chain은 4-5개 및 2개의 domain으로 구성되며,각 domain은 110개 가량의 아미노산으로 이루어졌다.Ig마다 C region은 구조가 유사한 반면, V region은 구조가 다양하다.- heavy chain은 400 amino acids (50 kDa)- light chain은 200 amino acids (25 kDa)하나의 IgG는 두 분자의 항원과 결합- heavy chain과 light chain 각각 동일한 polypeptide- 하나의 항체에는 두 개의 똑같은 항원결합부위가 존재▲ 그림 2 IgG의 Hingeregion경첩부위(Hingeregion) : 중쇄의 CH1과 CH2 도메인 사이에 다른 도메인과는 상동관계가 없는 신장된 폴리 펩티드 서열. 프롤린 잔기가 많이 존재하여 유연함.IgG, IgD, IgA에 분절의유연성(segmental flexibility) 제공그 결과 Fab 두 팔이 항원과 결합했을 때 여러가지 각도를 가질 수 있게함.펩신이나파파인에의해끊어지는부위3. 항체의 배열(lgG)a. light chain : V region + C regionb. heavy chain : V region + C regionc. light chain의 V지역과 heavy chain의 V 지역은 항원결합 부위인 Fab 구성

자연과학| 2009.03.22| 1페이지| 1,500원| 조회(344)

IgG, Hingeregion, 경첩부위, Specific, 면역특이성, V re..

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세포주기 점검점

G1/S 전이 점검점 (관련유전자, 단백질중심)1. G1기와 S기의 특징1) G1기 → 세포성장(cell growth)① 딸세포가 어미세포로 성장되는 기간② cyclin과 cdk(cyclin dependent kinase)의 신호를 받아 세포분열을 할 것인지에 대한 결정의 시기③ DNA 복제에 필요한 물질을 합성하는 기간2) S기 → DNA 합성(DNA synthesis)① DNA 합성기로 DNA가 복제되어 양이 2배로 증가되어짐(2n→4n)② 염기성 단백질인 히스톤(histone)도 2배로 합성되어짐2. 세포주기의 조절인자: cyclin, cdk1) 사이클린(cyclin): 진핵생물의 세포주기 조절 단백질G1/S-specific cyclin① G1/S-specific cyclin Cln1: G1기에서 S기로 넘어가는 G1/S(START) transition에서 세포주기를 조절하는 중요하며, Cdc28 protein kinase와 상호작용하여 S기 촉진인자(S-phase promoting factor; SPF)를 형성한다.② G1/S-specific cyclin Cln2: Cln1과 같은 기능을 수행한다.③ Cyclin D-Cdk 4 는 G1에서 작용한다. “Cyclin D-Cdk 4”복합체가 작용하는 지점은 나머지 세포주기를 총괄하는 부분으로 ‘제한점’이라고 불린다.④ Cyclin E-Cdk 2는 G1·S기 부근에서 작용하며 DNA복제를 시작 및 유지시킨다.⑤ Cyclin A-Cdk 2는 S기 부근에서 작용하여 DNA복제를 자극 및 유지시킨다.S-phase entry cyclin C1B5, C1B6: S기가 되기 전에 많은 양이 발현되어져 세포주기를 조절한다.2) 사이클린 의존성 키나제(cyclin dependent kinase; cdk): cdk 종류에 따라 각각의 세포주기의 사이클린과 결합하여 인산화(phosphorylation)시켜 세포주기의 각 단계를 조절하게 한다.3. 조절기작G1기에 DNA손상이 감지되면 G1/S 전이 점검점은 활성화된 p21의 증가에 의해 매개되는데, 이적으로 G1 cyclin-CDK의 저해가 초래되고 G1/S기가 억제된다.DNA손상에 대한 S기의 반응 : p21, GADD45 단백질에 의해 매개되면, 이것들은 다른 단백질과 복합체를 이루어 DNA중합효소의 진행도를 감소시키게 된다.DNA중합효소의 진행도 : DNA 중합효소가 주형으로부터 떨어지기 전에 동일 주형에서복제하는 연속적인 뉴클레오티드의 수를 말한다. 그러므로 진행도의 감소는 DNA합성을 지연시키게 되고 결과적으로 DNA손상을 수리하는데 시간을 벌게 된다.

자연과학| 2008.04.06| 1페이지| 1,500원| 조회(421)

p53, CDK, cyclin, G1기 S기, p21

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세포가 G1기에서 S기로 넘어갈때의 점검

세포주기 조절 (어떻게 DNA가 손상되면 G1기에서 머무르는가)1. 암암이 세포 성장 조절의 이상이라고 한다면 세포 성장에 가장 중요한 세포 주기의 조절 기 구가 암 발생에서의 표적이 되리라는 것은 쉽게 예상할 수 있다. 이론적으로는 세포 분열 주기의 어떤 단계에서도 암을 발생 시킬 수 있는 결함이 생길 수 있지만 현재 암에서 주로 이상이 발견되는 것은 G1/S 조절이다. 이 시기에 관여하는 세포 주기 기구로는 D-형 cyclin, CDK4와 CDK6, CDK 저해인자 (CDKI)인 p16INK4, p21Kip/Cip, 그리고 Rb 및 Rb에 의해 조절되는 전사인자인 E2F, cyclin E-CDK2, CDC25A등이 있다. 이중 암에서 변이에 의해 가장 흔히 불활성화 되는 것은 p16 CDK 저해인자 이다. p16은 처음 암 세포주기에 서 변이나 결손이 흔히 발견되어 암 관련성이 제시 되었다. 인체 암에서 p16의 발현 이상 기전은 결실, 프로모터의 메틸화 그리고 점 변이에 의해 일어날 수 있으나 앞의 두 기전이 대부분을 차지한다.? 따라서 p16-cyclin D/Cdk4-Rb로 이어지는 세포 주기 억제 시스템이 많은 암에서 불활성화 되어 결과적으로 Rb가 구조적으로 기능을 하지 못하게 되어 세포는 계속적으로 G1에서 S기로 진행하게 된다. G1/S 조절에 관여하는 또 다른 CDKI로 p16보 다 광범위한 저해 특이성을 갖는 p21의 변이는 인체 암에서는 흔하지 않으나 유방암, 임 파암, 전립선암등에서 드물게 변이가 보고되었다.2. p53DNA 손상에 의해 활성화된 p53은 표적 유전자의 발현을 촉진 또는 억제하는데 CDKI 인 p21의 발현을 유도하여 세포 주기를 G1에 머물게 한다. 정상세포에는 상당한 양의 p53 mRNA와 단백질이 존재하지만, 활성화된 p53 단백질의 양은 매우 낮다. p53의 활성은 Mdm2라는 또 다른 단백질에 의해 매우 낮게 유지된다. p53이 전사인자로 작용하기 위해서는 인산화 및 아세틸화의 순차적 변형에 의해 활성화되어야 한다. Mdm2는 p53에 결합하여 p53이 전사인자로 작용하는데 필요한 인산화 및 아세틸화 반응을 저해한다.3. cyclinG0상태를 벗어나 세포주기가 시작되면 세포는 일상적인 작업을 중지하고 세포분열에 필요 한 각종 단백질을 합성하는데, 사이클린 (cyclin)이라고 불리는 단백질들이 여기에 포함된 다. 사이클린 단백질들은 사이클린 의존성 키나제 (Cyclin Dependent Kinase, CDK)라고 불리는 인산화 효소와 복합체를 형성하여 이들 키나제를 활성화하는 역할을 담당한다.

자연과학| 2008.04.06| 1페이지| 1,500원| 조회(393)

세포, 암, Rb, CDK, cyclin, G1/S 점검점

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