??Ⅹ?Ⅸ. 실험 원리0. 배지(media)란 미생물을 발육하기 위한 영양물질로 검사재료, 채취, 재료 보존, 수송, 저장 및 미생물의 접종, 동정의 목적으로 사용한다. 배지의 조성은 발육 미생물의 종류, 생리적 조건, 배양목적에 따라 필요한 성분을 첨가하여 사용할 수 있다. 일반적으로 세균은 인공배지에 잘 증식되나 영양합성 능력이 부족한 Virus, Rickettsia, Chlamydia 등은 생세포(living cell)에서 증식이 가능하다.1. 배지의 성분? 펩톤(peptone) : 세균대사에 필요한 탄소원(carbon source) 및 질소원(nitrogen source)을 제공한다.① 육즙(Meat extract 또는 Beef extract) : 쇠고기의 근육부분에서 수용성 침출물을 추출해서 농축시킨 것으로 냉동진공 건조방법에 의해 분말로 만든 것으로 염류, 발육소, 핵산성분, 당분, 아미노산, 비응고성 단백을 제공한다.② 효모추출물(Yeast extract) : 효모에서 추출한 수용성 침출물질로써 담황색 분말이다. 염류, 발육소, 핵산성분, 당분, 아미노산, 비응고성 단백 등을 세균대사에 제공한다.③ 한천(Agar) : 해조류, 조류 등에서 추출한 함수탄소의 일종인 다당류(polysaccharides)이다. 유기용매에 용해되지 않으며, 한천은 세균의 영양원 보다는 배지를 고형화 시키는 중요한 성분이다.④ 젤라틴(Gelatin) : 동물의 뼈, 피부, 인대, 건 등을 끓여서 그 액체를 건조시킨 황갈색의 입자 또는 분말이며 일명 아교라고도 한다.⑤ 기타 목적에 따라 carbohydrate, buffer, 지시약, 억제제 등이 사용된다.2. 배지의 종류? 배지 성분의 성상에 따른 분류??ⅹ?ⅸ) 자연배지(natural medium) : 단백질의 가수 분해물, 동물조직의 침출물 등 화학적 성질이 분명하지 않은 물질을 혼합하여 만든 것, 세균의 증식, 부리 배양에 널리 사용된다.ⅰ) 합성배지(synthetic medium) : 화학적 성질이 분명한 것으로 합) : 배지 내에 agar 성분이 들어 있지 않은 배지로 액체 상태이다.ⅰ) 고체배지(solid media) : 배지 내에 agar 성분이 약 1.3 ~ 1.5% 함유된 배지로 고체 상태이다.z 평판배지(plate media) : 배양접시에 약 4㎜ 두께(15~20㎜) 정도 넣어 굳힌 것.a 고층배지(butt media) : 시험관을 세운 채로 배지를 굳힌 것.b 사면배지(slant media) : 시험관에 배지가 약 45°C 경사가 되도록 굳힌 것.c 반사면배지(semislant media) : 고층배지의 상부 1/3 정도를 경사지게 만든 것.d 반고체배지(semisolid media) : 배지 내의 agar 농도가 0.3~0.5% 함유된 배지로 반고체상태.② 사용 목적에 따른 분류ⅱ) 증균용 배지(Enrichment media) : 분변과 같은 많은 세균이 혼합된 경우 특정한 균종만을 다른 균종보다 빨리 증식시켜 분리배양이 쉽게 되도록 만든 배지.ⅲ) 특수 증균 배지(special enriched media) : 특수한 영양조건을 필요로 하는 세균을 배양하기 위하여 특별히 배지성분을 가감하여 만든 배지.ⅳ) 선택배지(selective media) : 두 종 이상의 세균이 혼합되어 있는 검체에서 원하는 세균을 분리하는데 사용하는 배지..ⅴ) 감별배지(differential media) 또는 성상확인 배지 : 보통 순수 배양된 세균의 특정한 효소반응을 보통 정상적으로 확인하고 균종의 감별(differentiation) 과 동정(identification)을 목표로 하는 배지.ⅵ) 수송용 배지 또는 보존배지(transport media 또는 preservative media) : 분리 배양하기까지 시간이 늦어지거나 원거리로 재료를 수송하거나 할 때 재료중의 세균이 과 증식하거나 사멸하지 않도록 고안된 배지.3. 멸균 : 많은 종류의 배지는 보통 121°c에서 15~20분의 고압 증기 멸균(auto clave)을 실시한다.Ⅰ. 실험 기구 및 재료0. Complex Agar, Glucose, K2HPO4, NH4Cl, MgCl3, Nicotine acid, 증류수2. 솜마개 : 솜, 가아제, 가위Ⅱ. 실험 방법0. Complex medium : Nutrient Broth Agar Medium? 평판 배지 (Petri dish 용) : 삼각플라스크에 물 100㎖, NB 0.8g, agar 1.5g 을 넣는다. NB가 잘 섞이도록 흔들면서 풀어준다. 알루미늄 호일로 입구 부분을 막아서 autoclave에 1시간 동안 멸균한다. agar 용액이 굳기 전에 Petri dish에 옮긴다. Petri dish에 용액을 부을 때는 뚜껑을 조금만 열고 한쪽 RMx에서 천천히 붓기 시작한다. Petri dish 4/5 정도에 퍼지면 오염을 막기 위해 뚜껑을 2/3 정도만 열고 식힌다. ① 사면배지 (Slant 용) : 삼각플라스크에 물 50㎖와 NB 0.4g, agar 0.7g을 넣는다. NB가 잘 섞이도록 흔들어서 풀어준다. NB가 섞이는 동안 솜마개를 만든다. 솜마개는 솜을 시험관 입구에 들어갈 수 있도록 가늘고 얇게 뭉쳐, 가아제로 싸서 만든다. 용액을 5㎖씩 시험관에 나우어 담는다. 솜마개로 입구를 막은 후 autoclave에서 1시간동안 멸균한다. 배지를 식힐 때 시험관의 중간 정도까지 용액이 오도록 기울여서 사면을 만든다. 1. Defined medium : 각 조마다 조성성분을 달리하여 만든다. 조성 성분은 과 같다. 삼각플라스크에 물 100㎖를 넣은 뒤, 각 조의 조성성분을 넣어준다.(우리 조는 4, 5조의 실험방법인 K2HPO4를 제외하고 다른 모든 성분을 넣어 주었다.) 삼각플라스크의 입구를 알루미늄 호일로 막아서 autoclave에서 1시간동안 멸균한 뒤에 Glucose를 넣는다. Glucose를 첨가할 때 멸균된 Blue tip을 사용한다. 용액이 식기 전에 Petri dish의 4/5 정도에 붓는다. 수증기가 날아갈 때까지 뚜껑을 열어놓은 후 뚜껑을 닫아 완전히 굳힌다. < 모든 조 >1, 14 조2, 3 조4,. 실험 결과0. 솜 마개 만들기 : 손바닥 보다 약간 크게 자른 가아제 위에 솜을 얇게 펴 얹은 뒤에 솜뭉치를 만들어 가운데 놓고 가제를 모아서 매듭을 지었더니 솜 마개가 만들어 졌다. (솜은 비탈지면이어야 하고, 솜 마개는 시험관에 넣었다가 뺐을 때 ‘뻥’ 소리가 날 정도로 잘 막을 수 있어야 하고, 홈이 있어서는 안 된다.)1. 평판배지 : 두 용액 모두 약간 걸쭉하여 흔들면 플라스크 벽면에 묻었다. 또한 Complex medium에서의 용액의 색은 약간 노란 딱풀색이었고, Defined medium에서의 용액은 투명했다. 용액을 Petri dish에 부으니 용액이 접시 표면을 따라 퍼졌다. 4/5 쯤 부었을 때 멈추니 Petri dish의 1/3 정도로 채워졌다. 5개의 Petri dish에 부었는데 시간이 조금 경과한 뒤에 5개중 1개의 Petri dish에 용액을 더 부었더니 표면이 울퉁불퉁하게 되었다. 수증기가 생기지 않게 뚜껑을 조금 열어두었다가 5분 뒤에 뚜껑을 닫아 보관하였다.2. 사면배지 : 용액을 시험관에 부어서 멸균 시킨 후 책에 기울여서 용액이 시험관의 1/2 정도가 되게 하여 굳혔다. 솜 마개는 시험관 속에 들어간 부분과 밖으로 나온 부분이 반반이 되게끔 하였다.Ⅳ. 고찰교수님께서 Complex medium은 임의의 세균일 때, Defined medium은 알고 있는 세균일 때 사용한다고 했다. 각 배지의 구성성분을 볼 때, Complex medium의 경우 Nutrient Broth의 성분을 보면 Bacto Beef Extract와 Bacto Peptone이 있음을 알 수 있다. 즉, 기본적인 필요한 영양분을 넣어주었기 때문에 그 영양분으로 살 수 있는 임의의 세균이 자랄 수 있게 만들어진 듯싶다. 물론 agar도 구성성분이지만 정제된 agar는 영양분을 함유하지 않으며, 특수한 균을 제외하고는 agar를 영양원으로 할 수 없기 때문에 영양분에 포함하지 않았다.Defined medium의 경우 구체적으로 필요한 영양분들을 선별적으로배지이다.) 우리 조(4조)는 Defined medium의 평판배지를 만들었는데 용액이 약간 걸쭉하여 흔들면 플라스크 벽면에 묻었다. 이는 어느 정도 까지는 영양분들을 물에 녹였지만 다 녹이지는 못하여 그 입자가 벽면에 붙은 것으로 생각된다. 왜냐하면 후에 멸균시켜 가져왔을 때는 흔들어도 벽면에 묻지 않았기 때문이다.아직 균을 접종하지 않았기 때문에 알 수 없지만 균의 접종에 실패 할지도 모른다. 이유는 첫째, 처음에 용액을 부을 때, Petri dish의 뚜껑을 많이 열었기 때문에 이미 다른 원치 않는 균들이 침투했을지도 모르기 때문이고, 둘째, 처음에 뚜껑을 너무 많이 열어서 한동안 뚜껑을 닫고 있었다. 그래서 혹시나 배지에 물방울이 생기지 않았을까하는 생각이 든다. 물방울이 맺히는 거 자체는 실험에 균 접종 시 지장이 없다고 한다. 하지만 물방울로 인해 약간이라도 덜 굳은 배지가 울퉁불퉁해지거나 구멍이 나는 경우는 접종이 힘들기 때문에 물방울이 맺히지 않게 하려 한다고 알고 있다. 마지막으로, 용액을 남기기 말고 다 부으라는 교수님의 지시에 용액을 너무 많이 부은 나머지 실험이 끝난 후에도 Petri dish 하나에 용액이 굳지 않았다. 혹시나 배지가 울퉁불퉁하게 만들어졌다면, 균을 접종할 때 매우 힘들 것이라 예상된다.사면배지(slant media)는 세균의 증식, 보존 등에 쓰이는 배지이다.) 이 배지를 만들 때 책 위에 시험관을 기울여놓고 만드는데 이렇게 기울여 만드는 이유는 용액의 표면적을 넓게 하기 위함이라 생각된다. 또한 교수님께서 시험관의 1/2정도에 용액 끝이 오도록 기울이라고 하셨는데 이 이유는 너무 용액이 높이 올라올 경우 원하지 않는 세균들이 침투할 수 있기 때문이라고 하셨다. 원치 않는 세균이 어떤 것일지 생각해보았다. 너무 위로 올라 왔을 경우 약한 (즉 건강하지 않은) 세균들이 자랄 수도 있고 솜 마개 주위에 혹시 따라 들어왔을 세균들이 자랄 수도 있기 때문에 용액을 정당한 선까지만 기울여 굳히는 거 같다.솜 마개에 사용되는 솜은다.
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[미생물학실험]Exp2. Preparation of culture media
