Isolation of Plasmid DNA Quantitation of DNA by UV spectroscopy화학과 61982 김정준실험 목적Plasmid DNA를 분리해 내고 분리 해 낸 DNA를 UV spectroscopy 를 통해 정량 해 낼수 있다.실험 이론Plasmid- microorganism (특히 bacteria) 내에 존재하는 extrachromosomal circular DNA실험 이론Plasmid-세균의 세포 안에 존재하는 DNA 이외의 또 다른 작은 원형의 DNA 분자를 말함 특징-이중나선으로 된 원형의 구조 세균의 유전자와 독립적으로 분열 가능 Insertion Site 가 존재 ( 때문에 유전자 재조합시 제한효소로 이 부분을 끊은 뒤 필요한 유전자를 삽입하여 DNA운반자 (Vector)로 사용 가능)실험 이론플라스미드는 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자(R인자), 세균의 자웅을 결정하는 성결정인자(F인자) 등이 발견되고 있다. 세균 생존에 플라스미드의 존재가 필수적이지 않으며 또 다른 세포 내에도 전달이 가능하다. 그리고 R인자로 인해 항생제가 있는 배지에서도 생존이 가능하다.실험 이론Plasmid Vector-유전물질의 운반체 원하는 DNA를 가진 생물체로부터 DNA를 얻는 클로닝을 거친 후, 이 DNA를 벡터에 넣게 된다. (박테리아의 경우에 플라스미드 벡터) 박테리아의 경우 번식이 빠르다는점을 이용해 원하는 유전자를 많이 발현시키는게 가능하다. 주로 플라스미드 vector는 10kb 이하의 insert DNA의 경우에 사용한다.실험 이론10kb 이상의 인설트 DNA는 파지 벡터에 넣는다. 바이러스 Vector 사용은 병원성(pathogenicity), 발암성(oncogenicity), 숙주에서의 면역반응 등 안전성 상의 고려사항들이 여전히 우려되고 있다. 예를 들어 SCID-X1 유전자 치료제에 대한 여러 임상에서 분명한 성공에도 불구하고 심각한 이상반응이 관찰돼왔다. 이는 레트로바이러스 벡터 삽입으로 유발, 백혈병이 발달되른 비바이러스 방식을 취해야 한다. 비바이러스벡터는 크게 양이온(cationic) 지질과 양이온 중합체 두 개 군으로 나뉜다. 두 물질 모두 DNA를 압축하고, 음이온 프로테오글리칸(anionic proteoglycan)을 인식하는 양이온 복합체를 형성, 세포표면 수용체와 결합 및 그 결과인 세포이물흡수(endocytosis)를 허용하게 된다.실험 이론-plasmid dna 추출법Alkaline lysis miniprep alkaline lysis procedure은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될 수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다. 여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다. 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.실험 이론-plasmid DNA 추출법Boiling miniprep Plasmid를 지닌 bacteria는 lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리 등으로 깨어질 수 있다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을수 있으며 plasmid DNA는 상등액에서 isopropanol로 침전시켜 분리할 수 있다. boiling miniprep는 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 plasmid리를 통해 제거할 수 있다. 이러한 분리절차로 chromosomal DNA 등을 제외한 plasmid DNA만을 얻을 수 있다. 이번 분리방법은 가장 빠르게 plasmid DNA를 분리하는 방법이며 대부분의 생물학적 적용면에 이용할 수 있는 정제된 plasmid DNA를 분리할 수 있다.실험 이론제한 효소 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제(핵산분해효소의 하나)로서 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소이다.실험 기구 및 시약Solution I. (25mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 50mM Glucose) Solution II (0.2N NaOH, 1%SDS : 2N NaOH 1/10Vol과 10%SDS 1/10Vol과 0.8Vol의 증류한 물을 섞어 사용 직전에 만들어 쓴다.) SolutionIII(3M sodium acetate pH4.8) 100%, 70% EtOH, RNase, TE(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA),Phenol, CHCl3실험 기구 및 시약solution Ⅰ: resuspension solution Tris-cl 은 ph를 맞추기 위한 것이다, EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. 이 과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨 지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것이다.실험 기구 및 시약solution Ⅱ: lysis solution :SDS, NAOH SDS는 계면 활성제로 cell을 lysis시키고, NaOH는 DNA가 세포가 깨지면서 밖으로 나왔을 때 DNA을 변성시키는 역할을 한다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거되고 상층액에 plasmid DNA가 있게 된다.실험 기구 및 시약PCI solution : phnol과 chloroform은 단백질을 변성시켜서 침전되도록 한다. isoamylalcohol 은 소포제로써 거품이 생성되지 않도록 한다. ① TE-saturated phenol ② chloroform ③ isoamyl alcohol 70% EtOH : DNA pellet을 washing 할 때 사용된다. 100% EtOH : DNA로 하여금 물에 대한 용해성을 잃도록 한다. elution buffer : DNA를 용해시킬 때 사용되는 buffer ① 10mM glutathione ② 50mM Tris-Cl (pH 8.0)실험 방법1) 적당한 항생물질이 섞인 LB나 YT배지에 세포를 밤새 배양한다. 2) 키워진 세포를 1.5ml의 멸균된 Eppendorf tube에 옮겨담고 12,000rpm에서 5분간 원심분리한다. 3) 상층액을 제거하고 침전물을 말린다. 4) 100[mu]l solution I을 넣고 심하게 흔들어 섞는다. 5) 200[mu]l solution II을 넣고 5초간 약하게 아래위로 흔들어 섞는다. 6) 상온에서 10분간 둔다. 7) 150[mu]l solution III을넣고 가볍게 5초간 흔들어 섞는다. 8) 얼음에 5분간 둔다.실험 방법9) 12000rpm ,4oC, 10분간 원심분리 10) 상층액을 새 tube에 옮겨담는다. 11) 2Vol 의100% EtOH을 넣고 가볍게 섞는다. 12) 12000rpm, 4oC, 15분간 원심분리 13) 상층액은 버리고 침전을 말린다. 14) 70% EtOH 을 1ml 넣어 3초간 약하게 흔든후 12000rpm, 4oC 5분간 원심분리후 상층액을 버리고 침전물을 65oC에서 10분간 말린다. 15) 50[mu]l의 [TE(600[mu]l) + RNase(1mg/ml)10[mu]l]을 넣어 가볍게 손가락으로 tube를 쳐서 녹이고 원심분리(몇초간)한다. 한 핵산이 단가닥(ssDNA)인지, 이중가닥(dsDNA)인지, DNA인지, RNA인지 혹은 올리고뉴클레오티드냐에 따라서도 흡광도가 달라지므로 핵산의 종류에 따라 그 흡광도에 적당한 수를 곱해서 핵산의 농도(ng/㎕)를 산출해 낸다.실험 이론이러한 측정은 얻고자 하는 시료 농도의 직접적인 계산을 가능하게 해 준다 : [dsDNA] μg/ml = A260 × 50 × dilution … (i) A260 = 260 nm에서의 흡광도 dilution = 희석율 50 = A260 값이 1 일 때의 dsDNA의 양실험 이론260 nm와 280 nm에서 흡광도 값 사이의 비율은 핵산의 순도에 대한 측정값을 보여준다. 순수하게 분리된 DNA와 RNA는 각각 1.8과 2.0 이상의 A260/A280값을 갖는다. 만약 시료가 단백질이나 페놀에 오염되어 있다면, A260/A280 값은 위의 값보다 낮게 측정될 것이고 이러한 경우에는 시료의 정량이 정확하지 않을 수 있다.(단백질이나 페놀의 유입으로 오염가능성이 있다.)실험 이론UV를 이용한DNA정량 계산법 EX) 10㎕ plasmid DNA용액에 TE buffer 990㎕넣고 uv측정하면 DNA양이 얼마나 되는가? A260=1 은 DNA 농도가 50 μg/ml임을 의미 [dsDNA] μg/ml = A260 × 50 × dilution 1:50=A260에서 나온 값:x 농도 X μg/ml라고 가정하면 희석배율을 곱해주게 되면 농도가 나온다(Dilution Factor)실험 이론Beer-Lambert's Law 흡광도는 용액의 농도와 셀 층의 길이에 비례한다. 비어-램버트 법칙은 흡광도와 전자기방사를 흡수하는 물질의 농도 사이의 선형 관계에 관한 법칙으로서 일반적으로 다음과 같이 표현할 수 있다: A: 측정된 흡광도 a: 흡광계수(파장에 따라 다름) b: 셀의 길이 c: 분석물질의 농도 비어-램버트 법칙이 적용되지 않는 경우 - 광원의 파장폭이 흡수대의 폭보다 충분히 좁지 않을 때 - 시료액과 대조액으 굴절율이 다를 때 - 시료액에 how}
물리화학 이원자 분자의 진동 - 회전 스펙트럼실험목적 할로겐화 수소의 진동 - 회전 스펙트럼을 측정하여 이 스펙트럼으로부터 분자의 진동 에너지의 전이 , 동위원소에 의한 스펙트럼의 분리를 관찰하고 분석하므로써 , 관성 모멘트 , 평형 핵간 거리 , 힘 상수 , 동위원소의 효과 등을 계산한다 .실험이론 - 조화 진동자 조화진동 : 변위가 시간의 사인함수 또는 코사인함수로 표현되는 진동 조화 진동자 : 고전역학에서 다루는 기본적인 계들 중의 하나로 , 평형점에서 물체가 이동했을대 , 다음과 같은 Hook 의 법칙에 의한 복원력 F=-kx 를 받는 계를 말한다 .실험 이론 - 조화 진동자 조화 진동자는 이동한 만큼의 복원력 (F) 를 받게 된다 . 실제의 진동에선 마찰력 , 즉 외부 자극이 주어지므로 감쇠 운동을 한다고 할 수 있다 . 감쇠운동의 종류 : 과감쇠진동 , 저감쇠진동 임계 ( 한계 ) 감쇠진동실험 이론 - 그림 1. 검은 선 ( 조화 진동자 ) 과 붉은 선 ( 실제 이원자 분자 ) 의 차이 : 결합길이의 증가는 입자의 척력 , 실선이 빠지는 것은 인력의 존재로 인하여 운동에너지가 제한되기 때문이다 . 영점에너지 : 평형의 위치는 위치에너지가 최소인점이지만 불확정성의 원리에 의해 동시에 확정이 불가 . 이때 최소의 에너지로 나타내는 지점 .실험 이론 - 조화 진동자 조화 진동자의 퍼텐셜 에너지 양자역학에서 허용되는 퍼텐셜 에너지실험 이론 - 조화 진동자 조화진동자의 전이 에너지 ! 전이 할 때 선택규칙을 따름실험 이론 – 강체 회전자 강체 : 질점과 마찬가지로 취급되는 가상물체 . 물체를 구성하는 두 입자들 사이의 거리가 모두 절대로 바뀌지 않을때의 물질 강체 회전자 : 회전하는 두 입자 사이의 길이가 절대로 변하지 않는 물질실험 이론 – 강체 회전자 강체 회전자의 에너지 준위 파수의 단위를 가지는 회전상수실험 이론 - 비조화 진동자 비조화 진동자 : 선택규칙을 따르지 않는 것들 ( 진동양자수의 변화 ) ∆ v = ± 2, ∆ v = ± 3 도 관찰이 가능 비조화 진동자의 운동에너지 : Morse 함수실험 이론 – 비조화 진동자 Morse 함수식을 이용한 양자역학의 에너지 χ e 는 비조화성 상수실험 이론 – 비조화 진동자 분자 진동의 선택 규칙에 의한 전이 에너지실험 이론 – 비강체 회전자 비강체 회전자 : 회전하는 두 입자의 사이가 진동에의해 가변한 물질 분자의 진동 a) 신축진동 (stretching vibration) : 두 원자간의 결합 축을 따라 원자간 거리가 연속적으로 변함 ① 대칭 신축 진동 ( Symmetric stretching vibration ) ② 비대칭 신축 진동 ( Asymmetric stret. vib. ) b) 굽힘 진동 (bending vibration) : 결합 사이의 각도 변화 ① scissoring ( 가위질 ) ② rocking ( 좌우 흔듦 ) ③ wagging ( 면외 앞뒤 흔듦 ) ④ twisting ( 면외 꼬임 )분자진동의 종류 . ( + : 지면으로부터 독자를 향한 운동 , - : 독자로부터 멀어지는 운동 ) ★ 진동 방식 : 2 개 이상의 원자를 갖는 분자에서 가능 + + - + - 대칭 비대칭 (a) 신축운동 면내 좌우흔듦 면내 가위질 면외 앞뒤흔듦 면외 꼬임 (b) 굽힙운동실험 이론 – 비강체 회전자 비강체 회전자의 에너지 준위 비강체 회전 상수실험 이론 - 진동 - 회전 스펙트럼 진동 회전 스펙트럼 분자스펙트럼 가운데 분자를 이루고 있는 원자 진동사태의 변화에 따라서 회전상태가 변하게 되는 적외선 스펙트럼실험 이론 – 진동 회전 스펙트럼 실제 이원자 분자의 에너지 준위실험 이론 – 선택 규칙 선택 규칙 : 에너지 준위 사의의 전위는 일정한 조건을 만족시키는 준위 사이에서만 전이가 일어남 조화진동자와 강체 회전자의 선택 규칙은 ∆ v = ± 1 이지만 실제 분자는 조화진동자가 아니므로 ∆ v = ± 2, ∆ v = ± 3 등의 약한 전이도 관찰이 가능실험 이론 – 선택 규칙 선택 규칙에서 각각의 전이들에 해당하는 진동수 R 가지 P 가지실험 이론 – 선택 규칙 는 v″=0, J″=0 에서 v′=0, J′=0 으로의 금지된 전이의 진동수 이며 , 다음과 같은 관계식을 갖는다 .실험 이론 – 동위원소의 효과 동위원소의 효과 : 이원자 분자에 동위원소 치환시 환산질량에 변화가 생겨 진동과 회전에 영향을 주는 효과 동위원소 분자의 진동파수 V*/V= */ =√(μ/μ*) 회전의 경우에 동위원소 효과 (B*/B)=( μ/μ*){nameOfApplication=Show}
