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Telomer에 대한 이론적 배경과 전기영동 실험

0. 실험목적Polyacryamide gel을 이용하여 사람의 telomere DNA를 크기별로 전기영동하여 결과를 분석한다.1. 실험 이론Telomere는 진핵세포의 염색체 말단에 위치한 특별한 복합체로서 알려져 있고 또한, 선형 DNA의 보전과 안정유지에 있어서 중요한 요소이다. Telomere는 DNA damage와 recombination, fusion으로부터 염색체 말단부분을 보호한다. 인간이나 쥐 등의 동물에서 telomere는 G-T 염기가 많은 TTAGGG의 반복적인 구조로 이루어졌다. 이 실험에서 우리는 최소단위의 telomere를 polyacrylamide gel을 이용하여 관찰해 보겠다.. Telomere0)생물체염기서열 (5'에서 3'을 향함 )사람, 생쥐, 아프리카발톱개구리TTAGGG붉은빵곰팡이TTAGGG애기장대TTTAGGG클라미도모나스TTTTAGGG누에나방TTAGG효모TTAC(A)(C)G(1-8)정의Telomere는 염색체의 양끝 부위로서 그리스어로 telos(끝)와 meros(부위)가 합쳐진 합성어이다. telomere는 non-coding 지역으로 일정염기가 수없이 반복되어있는 형태를 보이고 있다. 이들의 역활은 DNA의 양 끝부분에 존재하여 replication시 양 끝부분이 조금씩 영구적으로 없어지는 것을 방지하고 있다. telomere의 반복 모티프는 상당히 보존적으로서(T₂AG₃)n이라는 염기배열을 하고 있다.텔로미어의 경우 아래의 표에서 볼 수 있듯이 종에 따라서 다르다.1) 기능DNA polymerase는 DNA의 5'-end 부분에 결합해 replication을 수행하게 되는데 이때 primer를 필요로 하게 된다. 생체내에서 primer는 RNA primer가 사용되는데 이것이 DNA의 5'에 결합하고 DNA polymerase는 primer가 결합한 double strand 부위를 인식하여 결합하고 replication을 수행하게 된다. 문제는 replication이 끝난 뒤 RNA primer인데 본질이 RNA이기의 죽음으로 이어지고 이는 organ, 또한 organism인 생명체의 죽음으로 이어진다. 이 과정들이 노화의 과정이라고 규명되고 있다. Telomere는 그 구조에서 DNA의 짧아짐을 방지하고 있다. Non-coding region이 반복적으로 되어있으므로 DNA replication시 짧아지는 역활을 자신이 하고 있는 것이다. 그러나 telomere도 그 길이에 한계가 있기 때문에 지속적인 분열시 없어지게 되고 결국 euchromosome에 까지 피해가 가며 앞서 말한 cell의 죽음 까지 이르게 된다. Telomere는 자신이 짧아짐으로 chromosome을 보호 할 뿐만 아니라 짧아진 반대 strand의 보호역활도 하게 된다. Loop 구조로써 짧아진 DNA의 end를 자신이 대신하며 in vivo에서 발생하는 자연적인 DNA의 손상을 막게 된다.가. Telomerase0) 정의Telomerase란 RNA component를 template로 해서 염색체의 말단 DNA(telomeric DNA)를 합성하는 ribonucleoprotein성분의 효소를 말한다.1) 특성염색체 말단의 telomeric repeats는 세포가 분열할 때마다 짧아져서 결국에는 세포가 죽게 된다. 그러나 암세포 혹은 피부세포, 조혈세포, 염증세포등과 같이 계속하여 분열하는 세포에는 telomerase가 작용하여 telomeric repeats가 짧아지는 것을 막아주기 때문에 계속해서 세포가 살 수 있는 것이다.2) 기작DNA polymerase는 복제후 제거되는 RNA primer를 요구하기 때문에 DNA 복제가 계속됨에 따라 5`-말단부위의 손실이 생기게 되어 결국 telomere의 길이가 짧아지게 되는 염색체 말단 복제의 문제점(end-replication probrem)을 나타내게 된다. 진핵세포에서는 이러한 문제점을 해소하기 위하여 역전사활성을 이용하여 telomere를 복제할 수 있는 telomerase를 사용한다. 사람의 정상 체세포에서 telomerase는 비활성화 eric DNA의 합성의 template로써 제공되어진다. telomeric DNA는 새롭게 합성된 선도가닥 위의 돌출된 3'end를 가진 단순 반복 서열이다. 즉 Telomerase는 일종의 reverse transcriptase다. Telomerase는 telomere 길이를 특이적으로 연장시킬 수 있는 효소로써 1985년 Carol Greider and Elizabeth Blackbarn에 의해 제창되었고, 원핵생물중 섬모충에서 telomerase의 존재가 확인되었다.나. Telomerase 활성 조절 단백질(Tankyrase)0) 발견1998년 11월20일자 Science에서 록펠러 대학교의 수잔 스미스와 티티아 드랑그 연구팀은 사람의 세포에서 tankyrase라는 효소를 발견하였다고 발표하였다. 록펠러 연구팀의 연구 결과에 따르면 tankyrase는 telomerase가 염색체 말단에 접근하는 것을 막는 또 다른 단백질에 작용하여 telomerase가 제대로 역할을 수행할 수 있도록 조절한다. telomere의 길이를 어떻게 조절하는지를 알아내기 위해서 연구팀은 연관이 있는 단백질 조사 과정에서 얻어진 것이 tankyrase이다.1) 구조tankyrase에는 ankyrin 반복 구조가 24개 있으며, 이 구조는 단백질-단백질 상호 작용에 이용된다. 그리고, tankyrase의 다른 부위는 PARP(poly adenosine diphosphate-ribose polymerase)의 활성 부위와 비슷한 구조를 가지고 있다.2) Tankyrase와 Telomerase새로운 DNA를 합성하는 다른 단백질이나 자신을 변형시키는 방법으로 DNA복구에 있어서 중요한 역할을 수행하고 있다. PARP는 NAD+에서 ADP-ribose부분을 떼어내어 다른 단백질에 첨가하는 역할을 한다. Tankyrase도 이러한 기작을 수행하는지를 확인하기 위해서 연구팀은 NAD+, TRF1과 tankyrase를 혼합하여 실험관 실험을 수행하였다. 연구가들은 tankyrase가 ADP할 것이다.다. 다. 이 쥐의 세포들에서는 telomerase의 활성을 전혀 찾아볼 수 없었으나 이 쥐는 여러 세대 동안 계속 살아남아 telomerase가 생명에는 큰 지장이 없다는 사실을 보여 주었다. 뿐만 아니라 이 쥐에서 세포를 취하여 배양하면 telomerase는 매 세대마다 4.8±2.4kb정도 짧아짐에도 불구하고, 영원히 분열할 수 있는 세포주의 형성이나 발암유전자에 의한 암세포로 변형이 가능하고, 이 암세포를 면역력이 없는 쥐에 넣었을 때 종양을 만들 수 있다는 사실을 발견하였다. 인체의 정상적인 세포들은 자신이 노화에 들어간 후 오랜 기간 자기증식을 계속하고, 대개 세포에서 telomere는 철저하게 짧아지는 것을 알게 되었다. 하지만 이때 telomerase는 손실을 보이지 않고 실제로는 세포의 죽음이 뒤따라 발생하게 된다. 하지만 암세포내의 telomere는 작지만 그들이 자유롭게 복제를 시작한 후인데도 암세포는 telomerase의 작용에 의해 죽지 않는다.2. 실험 시약. Telomere (18-mer, 36-mer)0) 18-mer telomere sequence5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'3'-AATCCCAATCCCAATCCC-5'1) 36-mer telomere DNA sequence5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'3'-AATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCCAATCCC-5'가. Ammonium persulfate자유 라디칼을 생성하여 acrulamide와 bis-acrylamide의 폴리머를 형성시 킨다.나. 30% A-B(29:1)29g acrylamide + 1g N,N`-metylene- bisacylamide ->100mL mass up다. TEMEDammonium persulfate로부터 생기는 자유 라디칼(free radical)의 형성을 촉매함라. EtBrEthidium bromide는 DNA base pair 사이로 stacking 된다. 발암물) running gel을 조립된 gel caster에 붓는다.나) TEMED는 반드시 cast에 apply하기 직전에 넣어야 한다. 그렇지 않으면 gel이 apply하기 전에 굳어버린다.다) comb을 꽂는다. (콤을 꽂을시 에는 기포가 생기지 않도록 주의한다.라) gel이 굳을 때 까지 기다리며, 젤이 줄어들지 않도록 관찰한다.㎕18-mer telomere36-mer telomereladder①②③④⑤⑥ddH207537540.5M Hepes111111DNA2462456x dye2222221) 전기영동할 시료를 만든다.아래와 같이 micro tube에 번호를 라벨한 후 파이펫을 이용하여 시료를 준비한다.2) 시료를 setting된 젤에 순서대로 로딩(loading)한다. 로딩 시에는 정확하게 로딩 하도록 주의하고 첫 번째 well과 마지막 well은 로딩하지 않는다.3) 전기영동 장치의 cap을 덮은 후 power supply와 연결한다. 120V에서 10분, 140V에서 60분의 Running time을 준다.나. Staining and documentation0) EtBr staining) Staining dish에 staining buffer를 붓는다. (EtBr 5λ/100ml 1 TBE)가) 전기영동이 끝난 gel을 staining buffer에 넣는다.나) 10분동안 Staining해준다1) Gel documentation system으로 Gel을 관찰한다.) UV transilluminator위에 gel을 올려 놓는다.가) Darkroom을 덮는다.나) PC에서 'Remote capture' program을 실행한다.다) Gel image를 PC로 옮겨 저장한다.4. 결과 및 분석. band pattern of 18 mer telomere1번, 2번, 3번 모두 진한 단일 band가 관찰된다. band의 위치는 ladder의 10bp와 20bp 사이에 위치한다. 이로부터 18mer라는 것을 알 수 있다. 또한 2번, 4번, 6번에 telomere

자연과학| 2010.10.30| 6페이지| 1,000원| 조회(240)

염색체, 생화학, 실험, 진핵세포, Telomer에 대한 이론

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SDS_PAGE 발표 자료

SDS PAGE of ProteinWhat is the SDS-PAGE ?SDS PAGEBiochemistry Exp.SDS PAGE* Laemmli, U.K. 에 의해 개발 (1970) * SDS PAGE = (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) * Protein을 가열하여 denature 시킨 후, Polyacrylamide gel에서 electrophoresis (질량에 따라 분리)SDS PAGEBiochemistry Exp.SDS* SDS : protein의 거의 모든 non-covalent bond를 방해 * Protein의 main chain에 붙어 음전하를 띄게 함 * 두 개의 아미노산당 한 개의 SDS가 붙음SDS PAGEBiochemistry Exp.2-mercaptoethanol* 2-mercaptoethanol : protein 내의 disulfide(S-S)결합 환원 * Dithiothreitol도 같은 역할SDS PAGEBiochemistry Exp.Polyacrylamide Gel* supporting media * Chemically inert * Readily formed by this reaction * Methylenebisacrylamide : cross-linkingSDS PAGEBiochemistry Exp.Polyacrylamide Gel* persulfate : persulfate로부터 sulfate radical을 만들어 낸다 * sulfate = initiator* TEMED N,N,N,N -Tetramethyl-Ethylenediamine 촉매 반응으로 sulfate(initiator) 생성 촉진SDS PAGEBiochemistry Exp.Polyacrylamide Gel* gel은 separation을 더 잘 되게 함 * 많은 구멍들이 체와 같은 역할SDS PAGEBiochemistry Exp.Polyacrylamide Gel* Relative mobility는 Mass의 log값에 선형 비례 (carbohydrate-rich protein의 경우는 이렇지 않음.)SDS PAGEBiochemistry Exp.Staining* Coomassie blue * Silver stainProcedureProcedureBiochemistry Exp.Procedure실험기구 조립 2) Comb 제거 후, Running gel 용액에 7ul 25% ammonium persulfate 4ul TEMED 첨가 신속히 섞고(거품X) 유리판 사이 공간에 부음 3) Gel 혼합문 표시선까지 - 증류수 1ml (gel 상부 덮을 정도) 30분간 방치ProcedureBiochemistry Exp.Procedure4) Gel 굳으면 상층액(증류수) 버림 5) Stacking gel 용액에, 8ul 30% ammonium persulfate 4ul TEMED 첨가 신속히 섞고(거품X) 유리판 사이 공간에 부음 comb설치 6) 2x SDS gel loading buffer에 들어있는 시료를 100℃ 에서 3분 가열ProcedureBiochemistry Exp.Procedure7) Gel 굳으면 comb 제거, gel 찌꺼기 제거 8) 전기영동기구에 굳힌 gel 장치, 위 아래 buffer 통에 buffer를 채움. 9) 전기 영동끝{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2010.09.30| 15페이지| 1,000원| 조회(223)

질량, SDS_PAGE 발표 자료, 음전하, 아미노산당

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Angiogenesis & Tie2 보고서

Ⅰ. Introduction우리 조에게 주어진 sequence는 Tie2 receptor였다. Tie2는 혈관형성(angiogenesis)을 조절하는데 중요한 역할을 하는 membrane protein 이다. 혈관의 형성은 tumor가 자라는데도 필수적인 과정이기 때문에 암 예방 차원에서 angiogenesis와 Tie2에 대한 연구계의 관심도 굉장히 높다. 우리 조는 이번에 angiogenesis와 그에 관여하는 protein인 Tie2와 Ang에 대한 조사를 통해 반응의 개념과 protein의 구조 및 역할에 대해서 알아보겠다. 뿐만 아니라 현재 연구에서는 어떤 식으로 application 되는 지(Drug, 앞으로의 연구 방향)에 대해서도 살펴보도록 하겠다.Ⅱ. Angiogenesis Concept① 혈관계의 형성(vascularization) : 혈관형성 (angiogenesis) 와 혈관발생 (vasculogenesis) 두 과정에 의해서 이루어진다. Vascularization은 혈관이 내피세포 전구세포(endothelial cell precursor) 또는 혈관모세포(angioblast)에서 새로이 생성되는 것을 말하고, angiogenesis 는 말초혈관이 이전에 존재하는 혈관에서 새로운 혈관이 가지 치듯 생성되는 과정이다. 정상적인 생리작용으로 발생과정과 상처치유(wound healing), 여성의 생식 사이클에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.② Angiogenesis의 과정Angiogenesis는 혈관내피세포의 단순한 증식만이 아닌, 여러 단계의 복잡하고 순차적인 과정으로 구성되며, 각각의 단계는 vascular network 구축에 반드시 필요하다. 첫째, 종양이나 상처난 조직에서 다양한 angiogenic growth factor들이 분비되고, 이러한 pro-angiogenic factor 들이 주변의 기존 혈관 내피세포의 해당 receptor 에 결합한다. 이러한 growth factor receptor interaction 키고, VEGF 와 같은 자극에 대해 혈관내피세포를 sensitization 하게 만드는 것으로 해석되고 있다. Tie 2① Angiopoietin 와 결합하는 Tie receptor는 Tie1과 Tie2로 이루어지며, Transmembrane protein RTK 이다. Tie 2는 4종류의 Angiopoietin과 모두 interaction 하지만, Tie-Ligand 의 결합 관계는 아직 밝혀진 것이 없다. Angiogenesis 에서도 major 역할은 Tie 2 에 초점이 맞춰져 있다.② 구조 (실험자료로 주어진 2006년 nature 논문으로 부터 발췌)- Tie 2 ligand binding domain = ectodomain - immunoglobulin 3개 (Ig1,Ig2, Ig3), epidermal growth factor 3개 ( EGF1 , EGF2 , EGF3 ) , fibronectin type 3 3개(FN3)로 이루어져있고, membrane 내부에는 kinase subunit 가 존재한다. (그림)(* 참고 : membrane 에 박혀 있는 protein 부분까지 crystal 로 만들어서 구조를 밝혀내기는 힘들기 때문에 cell membrane 바깥쪽의 ectodomain 에 대한 연구만 활발히 진행 중이다. )Tie2 의 개략적인 구조 / a 에 나타난 색과 b를 매치 시켜서 나타낸 Tie 2 의 3차원적 구조- Tie 2 의 자세한 구조적 설명1. 전체적으로 arrowhead(화살촉) 모양이다.2. Ig EGF region이 compact → global structure. Angiopoietin 을 인식하고 결합하는 site이다.3. tie 2 arrowhead의 tip에 Ig2 가 존재 Angiopoietin와 직접적으로 interaction . Ig 3는 바닥에 존재, arrowhead 의 양쪽 side는 각각 Ig1과 EGF3, core에는 EGF1, 2가 packing 되어있다.4. EGF 각각은 β- sheet in-1 (Ang1) 와 Angiopoietin-4(Ang4) 은 Tie2에 Binding 하여서 Tie2 kinase 의 tyrosine phosphorylation 을 하는 반면 Angiopoietin-2 (Ang2) 와 Angiopoietin-3 (Ang3) 은 이러한 phosphorylation을 inhibition 한다. ( Tie2- Ang Binding에 관한 자세한 내용은 아래에서 다시 설명하겠음) Angiopoietin① Angiopoietins은 secreted protein family로서 현재까지 4종의 human angiopoietins (Ang1, Ang2, Ang4, Ang3)이 알려져 있고, endothelial cell 에 특이적으로 발현하는 Tie2 receptor tyrosine kinase 에 주로 결합하는 것으로 알려져 있다. Angiopoietins과 그 receptors는 VEGF와는 별개로 angiogenesis에서 주로 혈관의 성숙 및 안정화 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.② Ang1 (70 kD) 과 Ang2 (68 kD)의 역할 비교 : 약 60% 의 아미노산 identity를 보이며 Tie2 receptor 에 대해 서로 유사한 affinity 를 보이며 결합하는데, Ang1 단백질은 Tie2 receptor의 tyrosine phosphorylation을 유도하는 반면, Ang2 는 Ang1에 의해 유도되는 Tie2의 phosphorylation을 저해하는 성격을 가지고 있다. Ang2의 기능은 cell type 에 영향을 받고 context-dependent 한 것으로 보고되고 있다. 혈관내피세포가 아닌 다른 종류의 세포에서 Ang2는 Tie2의 phosphorylation을 유도하며 그 외 cell culture model 이나 Ang2 단백질 처리시간, 농도 등에 따라 혈관내피세포에서도 Ang2 에 의해 Tie2 phosphorylation이 유도되는 것으로 나타났다. 따라서 Ang2 구조알려진 4가지의 angiopoietin들의 N terminus에는 angiopoietin clustering을 조절하는 region이 존재하며 C terminus에는 coiled-coil과 fibrinogen-like region이 존재한다. 이 중 fibrinogen-like region은 Tie2의 Ig2 domain과 interaction하여 결합한다. 그리고 coiled-coil과 fibrinogen-like region은 ligand oligomerization을 중재하기 때문에 signaling에 꼭 필요하다. 여기서 oligomerization은 recepter activation에 필수적이다.⑤ Ang1과 Ang2의 발현 양상 : Ang1은 정상조직에서 비교적 광범위하게 발현되는 양상을 보이는데 반해, 종양조직에서는 발현이 높지 않은 경향을 보인다. Ang2는 정상조직으로는 태반, 난소, 자궁같이 vascular remodeling이 활발하게 일어나는 기관에서 발현되며 또한 신경교아세포종(glioblastoma), 위암, 대장암과 같이 혈관생성 정도가 높은 암 조직에서 높게 발현된다. 그리하여 원래 존재하던 혈관을 destabilization을 시킨 뒤 새롭게 여러 개의 혈관을 형성한다. 암 조직에서 Ang1, Ang2 각각의 발현 정도는 대체적으로 뚜렷한 pattern 을 보여주지 못하지만 Ang1:Ang2의 비율에서 Ang2가 높은 경향이 나타났다. 즉, angiopoietins발현의 절대량보다 상대적 level이 중요하며, 상대적으로 Ang-2가 Ang-1보다 높아지는 경우 결과적으로 tumor angiogenesis가 시작되는 것으로 보인다. Interaction between Tie2 and Ang① Tie2 에서 C-terminus는 membrane 안쪽에 존재하고, Ligand가 결합하는 N-terminus 는 membrane 바깥쪽에 존재하는데, 특별히 Ig2 domain부분과만 결합한다. 특히 Ig2의 His 163 의 Cainflammation associated molecules③ Ang2 는 혈관내피세포의 경우에서는 tyrosine residue를 phosphorylation시키지 않고, Ang1의 binding에 의한 Ang1-mediated signaling을 방해 → destabilization of vascularⅢ. Applications Anti-angiogenic therapies for the treatment of cancer비정상적인 angiogenesis는 많은 질환의 원인이 되고 있으므로 이를 조절함으로써 치료가 가능하다. cancer와 같이 angiogenesis가 과도한 질환은 angiogenesis inhibitor를 이용하여 angiogenesis를 억제한다. Cancer치료제로서의 angiogenesis inhibitor 로는 bevacizumab(Avastin™, humanized anti-VEGF monoclonal antibody) 이 대규모의 임상시험에서 전이성대장암 환자들의 생명연장의 효과를 나타남으로써 2004 년 FDA 승인을 받았다. 현재 40 종 이상의 다양한 angiogenesis inhibitor 들이 다양한 종류의 cancer에 대해 임상개발이 진행되고 있다. drug① Greenstatin (그린스타틴)2006년도에 녹십자는 (재)목암생명공학연구소와 공동으로 개발한 신생혈관 억제 항암제인 ‘그린스타틴’과 관련해 미국 MD앤더슨암센터(MD Anderson Cancer Center)와 공동 임상이행연구 협약을 체결했다. ‘그린스타틴’은 암세포에 영양을 공급하는 신생혈관의 생성을 억제함으로써 암의 성장과 전이를 막는 항암제로, 암 분야에서 세계적인 권위를 인정받고 있는 미국의 MD앤더슨 암센터와 공동 임상이행연구를 시작한 것은 ‘그린스타틴’이 국내 최초다. ‘그린스타틴’은 지난 2002년 과학기술부 G7 신기능 생물소재 기술개발 사업의 지원을 받아 후보 물질 도출 및 항암효능을 규명했으며, 2005년 12월 보건복지부 신약개발.

자연과학| 2010.09.30| 8페이지| 1,000원| 조회(190)

생화학, 상처치유, 말초혈관, Angiogenesis & Tie2, 혈관모세포

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Angiogenesis보고서 평가A+최고예요

0. Introduction- Angiogenesis : 기존 현관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미한다. 적당한 angiogenesis는 발생과정과 상처치유, 여성들의 생식사이클에서 중요한 역할을 한다. 그러나 과도한 angiogenesis가 일어난다면 종양의 성장과 전이와 같은 부작용이 일어나게 된다.- Angiogenesis의 이용 : 종양의 성장과 전이가 angiogenesis에 의해 지배적인 영향을 받으므로, antiangiogenic therapy를 이용한 획기적인 고형암 치료방법 개발이 가능할 것이라는 가설이 1971년 J.Folkman박사에의해 제기되었다.- Mammalian cell 들은 생존을 위하여 혈관으로부터 공급되는 산소와 영양분을 필요로 한다. 따라서, 혈관으로부터 산소가 자연스럽게 확산되어 공급될 수 있는 거리인 100um이내의 거리에 세포가 존재하게 된다. 이 공간을 벗어난 위치에 있는 세포들은 생존을 위하여 새로운 혈관의 형성(angiogenesis)을 유도한다.- Angiogenesis과정의 on/off는 생체 내의 pro-angiogenic factors와 anti-angiogenic factors의 종합적인 balance에 의해 결정된다. 종양의 생성과 전이를 막기 위하여 현재까지 많은 종류의 angiogenesis inhibitor들에 대한 전임상, 임상실험이 진행되었고 또한 진행되고 있다.- 성과 : 2004년, Genentech에 의해 개발된 Bevacizumab(Avastin ; humanized anti-VEGF monoclonal antibody)이 angiogenesis inhibitor로서는 최초로 대장암치료제로서 미국 FDA,의 승인을 받았다. 이로 인해, cancer에 대한 anti-angiogenic therapy의 가능성과 효능이 증명되었다1. Angiogenesis process- 혈관 생성의 경로1) Vasculogenesis : angioblast와 같은 혈관전구세포로부터 혈관내피세포가 새운 혈관이 성숙되고 안정화된다.- Tumor angiogenesis : 정상적인 antiogenesis와는 달리 endothelial cell-pericyte structure형성이 결여되어 있다. Tumor 조직의 저산소(hypoxia) 지역에서 대표적인 pro-angiogenic factor로서 Vascular endothelial growth factor(VEGF)가 분비되고, angiogenesis 과정의 대부분의 단계에서 영향을 미친다. 이에 반해, Ang 1은 후반부에서 혈관 안정화 및 성숙을 유도하고, Ang 2 는 초기단계에서 up-regulation되어 혈관내피세포아 pericyte의 interaction을 저해함으로써, 혈관을 destabilization시키고, VEGF와 같은 자극에 대해 혈관내피세포를 sensitization하게 만드는 것으로 해석되고 있다.2. Endogenous angiogenesis regulators2.1. Pro-angiogenic factors- Vascular endothelial growth factor(VEGF) : Pro-angiogenic factor중 한가지이다. 발생과정의 vasculogenesis와 angiogenesis 및 tumor angiogenesis에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. VEGF를 분리, 정제한 결과 혈관 투과성을 유도하는 Vascular Permeability Factor와 동일한 단백질로 밝혀졌다. VEGF는 약 45kD의 homodimeric glycoprotein으로서, ,alternative splicing에 의해 VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206등의 isoform이 존재한다. 가장 흔한 VEGF165 는heparin에 결합하는 능력에 의해 세포표면 및 세포외기질에 부분적으로 머물러 있다. 혈관내피세포에는 두 종의 RTK(VEGFR1과 VEGFR2)가 발현되며 VEGF가 high affinity로 결합된다. 그러나 주로 VEGFR2ffinity를 보이며 결합한다.1) Ang1 (70 kD) : Tie2 receptor의 tyrosine phosphorylation을 유도한다. 혈관 내피세포의 migration, adhesion, survival을 유도하고, 주로 pericyte의 recruitment를 유도함으로써 혈관의 안정화에 기여한다. 정상조직에서 광범위하게 발현되는 반면, 종양조직에서는 발현이 높지 않다. Ang-1이란 혈관에서 특징적으로 나타나는 trans membrane으로써 ligand인 Tie-2의 binding site를 가지고 있다. 이 Tie-2가 Ang-1에 결합을 하게 되면 autophosphorylation이 일어나게 된다. 즉 다른 Tie-2가 인근의 Tie-2를 phosphorylation시키고 이렇게 해서 서로가 서로를 phosphorylation하게 되는 mechanism이다. 이 Ang-1은 tyrosine kinase receptor로 자신의 residue 중 tyrosine에 phosphorylation이 일어나고 kinase의 활성을 가지게 된다. 참고로 이외에 kinase receptor에는 serine/threonine receptor가 있다. active한 Ang-1은 PI-3 kinase를 activation하게 되고 Akt를 활성화 시킨다. 또한 Akt는 FKHR-1도 phosphorylation시킴으로써 cell은 stabilization이 되고 혈관 생성은 중지된다. 이와 더불어 ABIN-2와도 반응하는데 이는 중요한 transcription activator인 NF-kB를 inhibition 한다. 그럼으로써 염증과 관련된 유전자와 혈관과 관련된 단백질의 발현은 block된다.2) Ang2 (68 kD) : Ang1에 의해 유도되는 Tie2의 phosphorylation을 저해하는 성격을 가지고 있다. Ang2는 Tie2에 대해 Ang1의 결합을 저해하는 natural antagonist로 보고되었다. Ang1-Tie2 signal을a chain of human fibrinogen과 Tachylectin-5A 의 site와 유사하다.두 side chain의 산소 원자와 몇몇의 주 사슬(main chain)의 카보닐 산소원자(carbonyl oxygen) 는 칼슘이온과 착 화합물을 형성한다. 하지만 Ang/Tie2 상호작용에서 칼슘이 하는 역할은 아직 밝혀지지 않았다.6) Ang-2와 sequence의 관계어떤 물질이 결합하는 수용체와 관련된 residue가 angiopoietin protein family에서 보존되는 것으로 보아 Ang-2 분자 표면의 염기서열의 정밀조사는 Tie2를 인식하는 영역을 알 수 있게 해준다.위는 Ang1, Ang2, Ang3, Ang4의 sequence를 비교하여 얼마나 유사성이 있는지를 알아보는 것으로 위의 조사를 통하여 어느 부분이 receptor와 binding하는지를 알 수 있게 한다.위 그림은 sequence 보존에 따라 색칠된 Ang2-RBD 표면을 나타내고 있다. 4개의 angiopoietin을 비교해서 -> 빨강 100%, 파랑75%, 녹색 50%, 흰색25% 이하 일치.노란 원은 human fibrinogen과 Tachylectin 5A의 fibrinogen 영역에 있는 리간드 binding 위치다. Ang2에서 그 영역은 높게 보존되어 있고, receptor 인식과 결합이 일어나는 장소를 포함한다는 가설을 세울 수 있다.실제로도 P 영역에서의 보존된 부분의 역할을 연구하기 위해서 보존된 부분에 있는 몇몇 잔기를 돌연변이 시켜 연구하였다.(K467,F468,K472,Y474,Y475 - in conserved region, K371E, H373A in nonconserved region)- 3개의 Ang2 돌연변이 :1 : K467E , K472E 삽입 - conserved region 삽입2 : F468A , Y474A , Y475A 삽입 -conserved region 삽입3 : K371E, H373A 삽입 - nonconserved retumor를 제거할 경우 secondary tumor의 성장이 갑자기 두드러진다. 이것은 primary tumor로부터 tumor의 성장을 막는 인자, 즉 pro-angiogenic factor들에 대항하는 anti-angiogenic factor가 존재함을 알 수 있다. 현재까지 약 30종의 anti-angiogenic factor가 밝혀졌다.- Thrombospondins(TSP)최초로 알려진 anti-angiogenic factor로 약 140kD의 분비단백질이다. TSP-1과 TSP-2가 억제 효과가 있다. 다양한 동물모델에서 TSP-1과 TSP-2를 과발현시킬 경우, angiogenesis 및 종양의 성장과 전이를 억제하였다. 관련 기작으로는 혈관내피세포의 migration 저해 apoptosis의 유도 등이 알려져 있다. 또한 만약 TSP-1,-2의 발현정도가 낮은 것은 폐암, 방광암, 대장암 등에서 임상적으로 나쁜 예후와 관련되어 있는 것으로 보고 되었다.- Angiostain약 38kD의 단백질로 효과적으로 angiogenesis를 저해하고 종양의 성장 및 전이를 막는다. 그 기작으로는 혈관내피세포의 ATP synthase, angiomotin 등과 결합하여 결과적으로 세포 증식과 migration을 방해한다.- Endostatin20kD의 circulatory protein으로 collagen XVIII의 carboxy-terminal fragment에 해당한다. collagen XVIII 자체는 angiogenesis의 저해 효과가 없지만, 거기서부터 유래한 endostatin은 효과적인 inhibitor이다. 이 단백질은 선택적으로 혈관내피세포의 apoptosis를 유도하고 동물모델에서 종양의 성장 및 전이를 강력하게 억제한다.3. Anti-angiogenic therapies for the treatment of cancer비정상적인 angiogenesis는 많은 질환의 원인이 되고 있다. 허혈성 질환같이 angiogenesis가 부족한 상된다.

자연과학| 2010.09.30| 13페이지| 1,000원| 조회(327)

생화학, 산소, Angiogenesis보고서, 대장암치료제, 고형암 치료방법

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Magnetic resonanceElectron spin resonance 발표자료

Magnetic resonance : Electron spin resonance1. 실험목적자기장 하에서 자유전자의 에너지 갈라짐을 이용하여 상자성 물질에서의 전자스핀공명현상을 실험한다. 실험을 통해 공명진동수의 자기장에 대한 의존성을 알아보고 g-인자를 결정한다.2. 실험이론전자스핀공명(ESR)이란? 전자스핀공명 (Electron Spin Resonance, ESR)은 전자의 스핀에 의한 자기 공명이다. 자기공명은 전자나 원자핵에 자기장을 가했을 때 이것에 대응하여 전자기파를 흡수 또는 방출하는 현상으로, 이 원리를 이용하여 물질의 원자와 핵의 성질을 분석할 수 있다. 이는 전자의 스핀 각 운동량과 이에 연관된 전자의 자기 모멘트를 알 수 있는 방법 중 하나이다.전자스핀 (electron spin) 전자스핀이란 전자의 고유한 각 운동량에 적용되는 용어이다. 다시 말해, 전자가 회전하여 각운동량을 가지면 전자는 음으로 대전 되어 있기 때문에 전자가 각운동량 벡터 s와 반대 방향의 자기모멘트를 갖는다는 것이다. 스핀 각운동량 벡터는 2개의 방향을 가지며, 상향스핀과 하향스핀이 있다.Zeeman Effect (제만효과) 자기장과 자기모멘트의 상호작용으로 인해 에너지 준위가 분열하는 현상. 즉, 광원을 강력한 자기장 안에 두고 거기서 나오는 빛의 스펙트럼을 조사하면, 하나 뿐이어야 하는 스펙트럼선이 여러 개로 갈라져 보이는 현상으로 1896년 P. 제만이 발견하였다. 그 중 비교적 간단하게 갈라지는 경우를 정상 제만효과, 복잡하게 갈라지는 경우를 이상 제만효과 라고 한다.g-factor (g-인자) 독일의 과학자 랑데가 제만 효과를 연구 분석하여 '랑데의 g공식'을 발견하였다. 이것은 원자에서 스핀 궤도의 상호 작용을 명확히 하는 것으로서, 원자, 분자의 전자 구조를 연구하는데 크게 기여하였다. g공식에서 주어져 있는 g-인자는 고전역학으로는 이해할 수 없는 값이며, 쉽게 표현해서 전자스핀갈라지기인자 g 라고도 표현한다.위의 그림을 통해서 알 수 있는 사실은, 외부 자장이 없을 때는 측정할 에너지 차이가 없다는 것이고 또한 측정한 에너지 차이는 자장의 세기에 비례한다는 것이다.3. 실험과정Setting up 1. Helmholtz coil 2개를 평행하게 두고, 그 사이 거리를 코일의 반지름 R 과 같게 한다. 2. 각 코일에 I 의 전류가 흐르도록 한다. 병렬연결 이므로 전류계엔 2I가 흐 르는 것으로 나타난다.3. Oscilloscope를 setting한다. 4. high frequency AC field 의 frequency range에 맞게 plug-in coil을 고른다. - Plug-in coil (E) (f approx. 13 - 30 MHz) Plug-in coil (F) (f approx. 30 - 75 MHz) Plug-in coil (G) (f approx. 75 - 130 MHz) 5. DPPH-sample을 넣는다. - AC field와 DC field의 겹침이 작으면, DC field의 크기를 천천히 증가시켜서 screen에 impulse가 나타나도록 한다.Note - 2개의 impulse가 관찰되는 경우가 있는데 이는 DC field가 2개의 resonance position을 가지기 때문이다. (범위 안에서) 1. impulse가 화면의 가운데에 나타나게 한다. 2. HF oscillator의 frequency f를 증가시키면resonance line이 screen 상에서 오른쪽으로 이동한다. 이는 큰 자기장 B에서 resonance가 일어나기 때문이다.3. magnetic DC field를 증가시키면 resonance line이 원래의 위치로 돌아온다. (screen의 가운데로 돌아옴) 4. f와 DC의 크기 I를 측정한다. (이 DC의 크기는 B에 비례한다.) - 전류 I를 정확하게 측정하기 위하여 진폭 변조를 감소시키면서 ESR신호를 가능한 한 감소시킨다. 그리고 남아있는 ESR신호를 x=0에 대하여 대칭되도록 조정한다. 계속 반복하여 f와 I의 값을 측정한다. 5. 측정한 f 와 I를 이용하여 그래프를 그려본다.- THE END -감사합니다.{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2010.09.30| 12페이지| 1,000원| 조회(158)

물리화학, 모멘트, 원자, 전자스핀공명, Magnetic resonanceEl

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