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소변에서 줄기세포 분리에 관한 보고서 1

1. 간략한 줄기세포 소개 줄기세포(Stem cell)는 스스로 계속 분열하면서 적절한 환경에서 몸을 구성하는 여러 기관이 나 조직을 구성하는 세포로 분화(differentiation)와 자가재생(Self-renewal)을 할 수 있는 미 분화 세포입니다. 줄기세포에는 배아줄기 세포(Embryonic stem cell)와 성체줄기세 포(Adult stem cell)로 나눌 수 있으며, 배 아 줄기세포에는 전능줄기세포(Totipotent stem cell)와 만능줄기세포(Pluripotent stem cell)가 있습니다 그림1). 전능줄기세 포(Totipotent stem cell)는 모든 세포로 분화가 가능해서 완전한 한 개체를 만들 수 있습니다. 발생과정 수정란에서 포배기 이전까지의 세포입니다. 만능성 줄기세포 도 대부분의 세포로 분화가 가능합니다. 전능줄기세포와 차이점은 태아발생 초기에 필요한 태반을 못 만듭니다.

의/약학| 2017.08.27| 16페이지| 2,000원| 조회(151)

줄기세포, stem cell, 세포배양, 세포분화, 소변, 지방세포, urine, 유..

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분화 배지 및 초세포(CHO cell line) 무혈청 및 무단백 배지

preparation of differentiation media(원서)Reagent stock solution concentrarion volume of Reagent Needed(mL) Final concentrationA. Preparation of odontogenic differentiation mediumα-MEM 1x 404.5 1xFBS 75 15%Glutamate 200 mM 5 2 mML-Ascorbic acid phosphate 10 mM 5 0.1 mMP/S antibiotics 10000 U/ml 5 100 U/mlDexamethasone 10 μM 0.5 0.01 μMKH2PO4 180 mM 5 1.8 mMFinal volume 500B. preparation of adipogenic differentiation mediumα-MEM 1x 398.25 1xFBS 75 15%Glutamate 200 mM 5 2 mML-Ascorbic acid phosphate 10 mM 5 0.1 mMP/S antibiotics 10000 U/ml 5 100 U/mlIsobutylmethylxanthine 50 mM 5 0.5 mMHydrocortisone 0.5 mM 0.5 0.5 μMIndomethacin 6 mM 5 60 μMInsulin 4 mg/ml 1.25 10 μg/mlFinal volume 500C. prepatation of neural differentiation mediumNeurobasal A 1x 484.45 1xB27 supplement 50x 10 1xEGF 200 μg/ml 0.05 20 ng/mlbFGF 40 μg/ml 0.5 40 ng/mlP/S antibiotics 10000 U/ml 5 100 U/mlFinal volume 500Preparation of differentiation media(서울대논문)Reagent stock solution concentrarion volume of Reagent Needed(mL) Final concentrationA. Preparation of osteogenic differentiation mediumα-MEM 1x 413 1xFBS 50 10%Ascorbic acid sesquimagnesium salt hydrate (289.54) 2 100 μMP/S antibiotics 10000 U/ml 5 100 U/mlDexamethasone 10-3M 5 10-8 Mβ-Glycerolphosphate 100mM 25 5 mMFinal volume 500B. preparation of adipogenic differentiation mediumα-MEM 1x 441.9 1xFBS 50 10%Ascorbic acid sesquimagnesium salt hydrate (289.54) 2 100μMP/S antibiotics 10000 U/ml 5 100 U/mlHydrocortisone 0.5mM 0.5 0.5 μMIndomethacin 20mM 0.6 60 μMFinal volume 500C. prepatation of Chondrogenic differentiation mediumPreparation of differentiation media(DMEM)Reagent stock solution concentrarion volume of Reagent Needed(mL) Final concentrationA. Preparation of osteogenic differentiation mediumDMEM 1x 385 1xFBS 50 10%Ascorbic acid 20mM 5 0.2mMP/S antibiotics 10000 U/ml 5 100 U/mlDexamethasone 10-3M 5 10-8 Mβ-Glycerolphosphate 100mM 50 10mMFinal volume 500B. preparation of adipogenic differentiation mediumDMEM 1x 388.5 1xFBS 50 10%Dexamethasone 10-3M 0.5 10-6MP/S antibiotics 10000 U/ml 5 100 U/mlMethylisobutylxanthine 5mM 50 0.5mMInsuline 1mg/ml 5 10μg/mlIndomethacin 50mM 1 100μMFinal volume 500prepatation of Chondrogenic differentiation mediumReagent 논문 1 논문 2 논문 3 논문 4High-glucose DMEM o o o DMEM/F12TGF-β3 10 ngml 10 ng/ml 10 ng/ml 10 ng/mldexamethasone 100 nM 3x10-7 M 10-7M 100 nMAscorbic acid 2-phosphate 5 μg/ml 50 μg/ml 25 μg/ml 50 nMsodium pyruvate 100 μg/ml 100 μg/ml 1 mM 110 mg/lnonessential amino acids 1 mMproline 40 μg/ml 40 μg/mlbovine insuline 6.25 μg/mlInsuline 6.25 μg/mlITS+tmPremix(bectondickinson, USA) - 50 μg/mlITS-PlusITS+1ITS-plus bovine insuline 6.25 μg/mltransferrin 6.25 μg/mlselenous acid 6.25 μg/mllinoleic acid 5.33 μg/mlbovine serum albumin 1.25 mg/mlITS+1 bovine insuline 10 μg/mltransferrin 5.5 μg/mlsodium selenite 5 ng/mllinoleic acid 4.7 μg/mlbovine serum albumin 0.5 mg/mlProtein free medium componentInorganic salt mg/L Sigma 용량 가격Calcium chloride anhydrous c4901 500g 185,000Magnesium sulfate anhydrous m7506 500g 84,000Potassium chloride p5405 500g 49,000Potassium nitrate p6030 500g 75,000Sodium chloride s5886 500g 41,000Sodium phosphate monobasic monohydrate s9638 500g 106,000Sodium selenite s5261 25g 47,900VitaminsBiotin47868 100mg 41,000D calcium pantothenate c8731 25g 114,000Choline chloride c7527 100g 38,000Cyanocobalamin c3607 500mg 109,000Folic acid f8758 25g 98,700I inositol i7508 100g 86,000Niacinamide n5535 100g 31,000Pyridoxal HCl p6155 5g 72,000Riboflavin r9504 25g 28,000Thiamine HCl t1270 100g 90,200Amino acidsleucine(Leu) L8912 100g 128,000lysine HCl(Lys) l7039 1kg 238,000methionine(Met) m5308 100g 118,000phenylalanine p5482 100g 127,000proline(Pro) p5607 100g 154,000serine(Ser) s4311 100g 159,000threonine(Thr) t8441 100g 253,000tryptophan(Trp) t8941 100g 160,000tyrosine 2Na(Tyr) t1145 100g 152,000valine(Val) v0513 100g 139,000alanine(Ala) a7469 100g 142,000arginine HCl(Arg) a8094 100g 78,000asparagine monohydrate(Asn) a7094 100g 120,000aspartic acid(Asp) a4534 100g 33,400cystine 2HCl(Cys) c6727 100g 356,000glutamic acid(Glu) g8415 100g 40,000glutamin(Gln)glycine(Gly) g5417 1kg 238,000histidine HCl monohydrate(His) h4036 1kg 599,000isoleucine(Ile) i5281 1kg 944,000Other componentsDextrose anhydrous(D-glucose): g8270 1kg 34,000HEPES h4034 1kg 676,000Sodium pyruvate p5280 100g 191,000Sodium bicarbonate s5761 1kg 55,00081112 50g 319,000h0888 10g 216,000a1895 5g 64,000s1647 1kg 145,000총합 7,174,200

자연과학| 2010.03.29| 5페이지| 무료| 조회(617)

줄기세포, Mesenchmal stem cell, osteogenic, adi..

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미생물의 형태와 염색법

미생물의 형태와 염색세균의 형태와 관찰세균은 곰팡이와 효모에 비하여 크기가 훨씬 작으므로 관찰을 쉽게 하기 위해서는 염색을 해야 한다.세균의 염색법은 Gram 염색이나 항산성 염색(Acid fast stain)과 같이 세균 세포가 특정한 화학처리에 의해 어떻게 반응하는가를 알아보는 조직 화학적 반응에 의한 염색법과 세포의 구조를 이해할 수 있도록 고안된 세포학적 염색법의 두 가지로 대별할 수 있다.생체 미생물의 현미경 관찰법원리살아있는 미생물을 광학 현미경으로 직접 관찰하는 방법이다. 이 방법은 미생물의 실제의 형태, 크기 및 운동성 여부를 관찰하는데 유용하며 관찰 방법은 현적표본(Hanging drop preparation) 방법으로 관찰한다.재료균주: 관찰대상 미생물현미경, 오목 슬라이드 글라스, cover glass, 백금이, 알코올램프방법:Cover glass 가장자리에 바세린을 얇게 바른다.바세린을 바른 cover glass 가운데에 한 방울의 균액을 떨어뜨린다.오목 슬라이드(hallow slide glass)의 오목한 부분을 향하여, 균액을 놓은 cover glass를 올려놓는다.살짝 눌러 바세린을 오목 slide glass에 밀착시킨다.유침 렌즈로 cover glass의 현적을 관찰한다.단순염색(Simple staining)원리세균을 슬라이드에 도말 고정한 후 한가지 염색액으로 염색하는 방법을 단순 염색이라 고 하고, methylene blue, carbol fuchsin, crystal violet 등의 염기성 염료(basic dye)를 주로 사용한다. 염기성 염료는 주로 ribosome이 많은 부분인 원형질을 염색한다. 단순 염색을 함으로서 기본적인 세균의 모양, 크기 배열 형태를 알 수 있다.재료염색약: methylene blue, crystal violet균주: 관찰대상 미생물현미경, 슬라이드글라스, cover glass, 백금이, 알코올 램프, 흡지, 세척병방법Slide glass를 깨끗이 닦아 불꽃에 두 세번 통과시킨다.슬라이드에 멸균 증류수 한 방울을 백금이로 취하여 놓는다.백금이를 소독한 후 균을 묻혀서, 슬라이드 위의 물방울과 잘 섞어 얇게 펴준다. 이 과정을 도말(smearing)이라고 한다.도말이 끝난 백금이는 다시 화염 멸균하여 둔다.도말한 슬라이드를 공기 중에서 말린다(drying)도말 부위가 위로 향하도록 하여, 불꽃으로 서너 차례 통과시켜 고정(fixing)한다.염색액을 가하고 1-2분 염색한다(Staining).과량의 염료를 세척병을 이용하여 세척하든지, 슬라이드를 뒤짚어 약하게 흐르는 수도물로 물을 흘려 보내면서 세척한다(washing).잔여 수분을 제거한 후 검경한다.참고사항액체 배양액에 있는 세균을 관찰하고자 할 때는 균체를 멸균된 희석수에 적당히 희석하든지 혹은 희석하지 않고 백금이로 균을 떠서 잘 도말(smear)한 후 염색 과정을 시작할수 있으나 고체 배양체의 경우에는 희석액을 슬라이드에 한 방울 떨어뜨린 후 균을 떠서 희석액과 함께 도말한다. 도말한 슬라이드는 상온에서 건조시킨 후, 열 처리에 의한 단순 고정법으로 슬라이드 표면에 부착시킨다. 즉 건조된 도말 부위가 위로 향하도록 하여 알코올 램프 불꽃의 2/3높이로 1초 정도 서너 차례 통과시켜 고정시킨다. 이 때 너무 강한 불꽃을 처리하면 세균이 수축되거나 변형될 우려가 있으므로 주의해야 한다.그람 염색(Gram staining)원리Gram 염색은 세균의 동정 또는 구분에 쓰이는 가장 중요한 염색방법의 하나이다. 세균분류의 중요한 특성 중의 하나는 Gram 염색성이며, 세균은 Gram 양성균과 Gram 음성균의 두 균으로 대별할 수 있다.이 방법은 1884년 Christian Gram이 최초로 개발한 이래, 시약의 조성 및 처리 시간을 다르게 하는 변법이 개발되었으나, 기본적으로 네 가지 시약이 사용되는 것은 동일하다. 흔히 염기성 염료(Crystal violet, 또는 methyl violet), 매염제(iodine), 탈색제(알코올, 아세톤 및 이 들의 혼합액), 대조 염색제(safranin 또는 carbolfuchsin)등이 사용된다.Gram 양성균은 crystal violet등의 염료로 염색한 후, 탈색제 처리로 탈색되지 않기 대문에 염색 후 남색이나 보라색을 나타낸다. 반면 Gram 음성균은 매염제의 처리 후에도 탤색제에 의해 탈색되기 때문에 나중에 염색하는 대조 염색액에 의해 염색되어 적색으로 관찰 된다.재료염색액: crystal violet, safranin균주: 관찰대상 그람 양성 또는 음성 세균현미경, 슬라이드글라스, cover glass, 백금이, 알코올램프, 흡지, 세척병, 95%에틸알코올, Lugol 액방법도말, 고정시킨 슬라이드에 crystal violet를 가하여 1분간 염색한다.수돗물로 서서히 염색액을 씻어낸다.매염제인 iodine용액을 가하여 1분간 처리한다.Iodine을 수돗물로 씻어낸다.30초 간 95% 알코올로 탈색시킨다.수돗물로 다시 알코올을 씻어낸다.safranin으로 45초 동안 대조 염색한다.수돗물로 safranin을 씻어낸다.여분의 수분을 말린 후 검경한다.참고사항Gram 음성균이라도 도말한 시료층이 너무 뚜겁거나 탈색이 불완전하게 이루어진 경우에는 양성균으로 판별될 수 있으며, 양성균의 경우에는 탈색을 심하게 하였을 때, 음성균으로 잘못 판정할 수 있는데, 특히 정지기(stationary phase) 이후의 늙은 세포는 Gram 음성균으로 오인되기 수우므로 대수기(log phase) 초반의 세균을 얇게 도말하여 염색하고, 대조균으로서 양성 음성 판별이 확실한 균을 사용하여 비교하는 것이 좋다(예: 양성균- Staphylococcus aureus, 음성균- Escherichia coli).항상성 염색(Acid fast staining, Ziehl-Neelsen method)원리결핵균, 나균과 같은 항산성균은 보통 염색법으로는 염색되지 않고 가온 염색 또는 장시간 염색에 의해서 탈색되지 않는 성질을 가지고 있다. 이와 같은 성질을 갖는 균을 항상성 세균(Acid fast bacteria) 이라고 한다. 항산성을 나타내는 이유는 이들 세균이 mycolic acid라는 지질을 다량 함유하기 때문이며, Mycobacteria나 Actinomycetes 등이 항산성 세균이며, 이러한 균은 일반적인 염색법으로는 잘 염색되지 않는다. 대표적인 것으로 Mycobacterium속 세균들은 열을 가하여야만 염색이 가능하고, 일단 염색된 후에는 산성알콜 등의 탈색제로도 탈색이 되지 않기 때문에 붉은 색으로 관찰된다. 이 때 항산성이 없는 세균은 탈색후 methylene blue나 1% malachite green등으로 대조 염색한다.재료염색약: carbofuchsin 염색액, Loeffler’s alkaline methyene blue균주: Mycobacterium속 세균현미경, 슬라이드글라스, cover glass, 백금이, 알코올램프, 흡지, 세척병, 3% HCl-alcohol방법균주를 슬라이드 위에 도말하고 열 고정한다.Carbolfuchsin 염색액으로 3-5분 간 가온 염색한다. 김이 날 정도로 가온하여, 증발하여 마르지 않도록 염색액을 가끔 보충시켜 준다. 너무 가열하여 슬라이드가 꺼지지 않도록 주의한다.실온 종도로 슬라이드를 식힌 후, 흐르는 물로 가볍게 세척한다.3% HCL-alcohol로 10-30초 간 탈색한 후, 흐르는 물로 씻는다.Loeffler’s alkaline methyene blue로 20-30ch 간 대비 염색한다.수돗물로 세척한 후 물기를 말리고 검경한다.참고사항항산성균은 붉은 색, 비항산성균은 청색으로 염색된다.Mycobacterium smegmatis와 같은 병원성이 낮은 균을 사용하여 염색하는 것이 좋으나, 결핵균을 사용할 때에는 실험대에 3% cresol, 또는 5% phenol을 뿌리고 그위에 신문지나 종이를 깔아 놓고 염색을 시작한다.생균이나 객담 등의 가검물로부터 감염될 우려가 있으므로, 오염되지 않도록 세심한 주의를 해야 한다.협막염색(Capsule stainig)원리음염색 또는 음성 염색(Negative staining)이라고도 하는 이 염색 방법은 협막의 존재 여부를 확인하는데 이용된다. 많은 종류의 세균은 세포벽 외부에 협막(capsule)이 존재한다. 이 구조의 크기는 세균의 종류나 배양 배지의 종류에 따라서 달라질 수 있으며 협막의 성분은 다당류, 폴리 펩타이드, 또는 당단백질로 되어 있다. 일반적으로 병원성 세균인 경우, 협막이 발달되어 있으면 병원성이 강하다. 음염색법으로 협막이 있는 세균을 염색하면 배경색만이 염색이 되고 균체는 염색이 안된 상태여서 협막이 투명하게 보인다.재료염색약: Nigrosin 액균주: K. Pneumonia, E. aerogenes현미경, 슬라이드글라스, cover glass, 백금이, 알코올램프, 흡지, 세척병방법슬라이드 한 끝에 먹물이나 Nigrosin액을 한 방울 떨어뜨린다.백금이로 균액을 한 방울 취하여, 염색액과 섞는다.한 손으로 염색액과 균액을 놓은 슬라이드를 잡고, 다른 손으로는 깨끗한 슬라이드의 끝을 염색액과 균액이 있는 부분에 댄 후 염색액과 균액을 슬라이드 전면에 도말 시키기 위해 민다.도말 표본을 공기 중에서 건조시킨후 유침 검경한다.

자연과학| 2008.05.22| 4페이지| 1,000원| 조회(1,496)

미생물, 단순염색(simple stai, 그람염색(Gram staini, 항산..

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Multipotent stem cells in dental pulp

1.3.4. Primary Culture of DPSCs/SHEDThis isolation protocol is based on the ability of stem cells to adhere to culture dishes and form discrete colony clusters [Friedenstein, 1976; Friedenstein et al., 1970]. To obtain colonies each derived from a single cell (i.e., clones), it is very important to release DPSCs and SHED from their perivascular niche in the pulp tissue [Shi and Gronthos, 2003]. Use sterile scalpel blasé and chop up the pulp into small segments. Enzyme digestion is then required for harvesting putative stem cells from pulp tissue. However, it may be harmful for the stem cells of enzyme digestion lasts for more than 1h. Each researcher should find optimal conditions for the digestion. Usually, it takes 30~60min to fully digest well-minced pulp tissue.It is recommended that the medium be changed 1day after cell isolation; this minimizes the incidence of contamination. However, when the risk of contamination is high, the medium can be changed 5h after the isolation.Cells isolated from dental pulp are usually seeded at 1-10 x 103 cells/cm2 for culture. To evaluate their colony formation rate (CFU-F assay), a lower cell density (0.1-1.0 X 103cells/cm2) is recommended in order to distinguish each single colony cluster.

자연과학| 2008.05.05| 4페이지| 1,000원| 조회(462)

줄기세포, DPSCs, dental pulp, stem cells, Mulrip..

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Dental pulp mesenchymal stem cells

MULTIPOTENT STEM CELLS IN DENTAL PULP1.1. INTRODUCTIONThe crowns of human teeth consist of enamel, dentin, and dental pulp tissue. During tooth growth and development, ameloblasts form enamel and odontoblasts generate primary dentin. After tooth eruption, ameloblasts disappear from the surface of the enamel; consequently, enamel formation ceases to occur naturally in vivo. In contrast, odontoblast, along the inner surface of the dentin inside the pulp chamber, continue to deposit dentin matrix to form secondary dentin throughout life. In addition to secondary dentin, odontoblasts can form tertiary (reactionary/reparative) dentin in response to several stimuli, such as mechanical, chemical, and/or bacterial stimulation.

자연과학| 2008.03.02| 4페이지| 1,000원| 조회(424)

MSC, Pulp, isolation, dental, Mesenchymal st..

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