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최적확수법

. 39항 총대장균군(Total Coliforms)1. 일반사항일반적으로 미생물 시험에 있어서 유의할 점은 시료 중에 함유된 미생물의 상황이 시시각각으로 변할 수가 있으며, 처음 시료 중에 함유되어 있던 미생물 외의 다른 미생물오염이 조작 중에 일어날 수 있다는 점이다. 이러한 실험상의 오염을 방지하기 위하여 모든 조작은 무균조작을 하여야 하며, 동시에 실험실내의 청결을 유지하여야 한다.1.1 시료의 채취 및 조제시료는 멸균된 용기를 이용하여 무균적으로 채취하고 한번 채취된 시료는 어떠한 경우에도 저온(10℃이하)의 상태로 운반하여야 한다. 또한, 환경기준 적용을 위한 시료는 시료채취부터 시험분석까지 24시간을 초과하여서는 안 되며, 배출허용기준 및 방류수수질기준 적용을 위한 시료는 시료채취 후 6시간이내에 실험실로 운반하여 2시간이내에 분석을 완료하여야 한다. 만약 규정된 시간 내에 분석이 불가능할 경우에는 현장에서 분석이 가능하도록 하여야 한다.시료 중 잔류염소가 함유되었을 때는 멸균된 10% 티오황산나트륨용액으로 잔류염소를 제거하여야 한다. 예를 들어 120mL당 10% 티오황산나트륨용액 0.1mL를 넣은 경우 잔류염소 15mg/L 중화된다.시료의 균일화를 기하기 위하여 액상시료는 강하게 진탕하고 고형물이 포함된 시료는 멸균된 믹서를 이용하여 적당량의 희석액과 혼합하여 사용한다.1.2 정의총대장균군이라 함은 그람음성?무아포성의 간균으로서 유당을 분해하여 가스 또는 산을 발생하는 모든 호기성 또는 통성 혐기성균을 말한다.2. 최적확수 시험법2.1 적용범위본 시험방법은 환경정책기본법 제10조의 환경기준에 규정된 총대장균군수 시험에 적용한다.2.2 측정원리유당이 포함된 액체 배지에서 총대장균군을 배양하면 유당이 분해되어 가스가 생성되어지는 원리를 이용한 방법으로, 시료를 최소 3단계 이상의 희석단계별로 5개씩 접종하고 그 중 가스를 생성한 양성 시험관이 포함되는 적정범위의 연속적인 3단계를 선택하여 확률적인 수치인 최적확수로 표시하며, 그 결과는 총대장균군수/ 유지할 수 있는 것을 사용한다.2.4 시험방법본 시험법은 최적확수 산정을 위해 여러 희석단계의 다중시험관을 사용하며, 총대장균군 판정을 위해 추정시험ㆍ확정시험 및 완전시험의 단계로 구분된다. 총대장균군수는 확정시험까지 분석하여 도출하는 것을 원칙으로 하며, 완전시험은 계절적 간격으로 총대장균군 양성시료의 10%에 대하여 정도관리를 위해 수행한다.본 시험법은 총대장균군을 정량하기 위하여 먼저 시료를 10, 1, 0.1, 0.01 ……… mL로 희석단계를 정하고 희석단계마다 시험관을 각각 5개씩 배양하고 그 중 가스를 발생하는 양성인 시험관수를 계수하여 최적확수표에 의거 정량한다. 최적확수란 확률적으로 가장 가능한 수치를 말한다.시료는 여러 희석단계 중 3단계에서 그 최대량을 이식한 5개의 시험관에서 전부 또는 대다수가 양성이고, 최소량을 이식한 5개의 시험관에서 전부 또는 대다수가 음성이 되도록 적당히 희석하여 사용한다. 이와 같이 하면 총대장균군수는 적정한 양성시험관을 나타내는 최소 희석과 최대 희석단계의 희석도와 그 사이에 나타나는 각 단계별 양성 시험관수에 의해 결정된다.따라서 시험을 계획할 때는 희석단계 사이에서 충분한 수적근거가 얻어질 수 있는 양성 시험관수가 나오도록 계획하여야 한다.2.4.1 추정시험라우릴 트립토스 액체배지 또는 유당 액체배지와 다람관을 넣은 시험관을 35±0.5℃에서 24±2시간 배양하면서 가스발생 여부를 관찰한다.시료는 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001………mL씩 되게 10배 희석법에 따라 희석하여 사용하며, 최대희석 단계는 시료의 오염정도에 따라 다르게 할 수 있다. 각 희석단계마다 5개의 시험관을 사용한다.시료를 10mL로 하는 경우는 배지가 원래 농도보다 2배 희석되어지므로 2배 농축된 배지를 사용하여야 한다.시료를 접종하고 35±0.5℃에서 배양하여 24±2시간내에 가스가 발생하지 아니하였을 때에는 48±3시간까지 계속하여 배양한다. 이 때 가스가 발생하지 않을 때는 추정시험 음성으로 판정하고, 가스발생이 있을 Methylene Blue)평판배지에 이식하여 다음과 같은 조작을 한다.평판배지에서 24±2시간 배양한 후 전형적인 총대장균군 집락 또는 전형적인 집락이 없는 경우 2개 이상의 비전형적인 집락을 따서 다람관이 들어있는 라우릴 트립토스 액체배지 또는 유당액체배지 시험관과 보통 한천배지 사면에 이식한다.액체배지 시험관은 48±3시간 배양하여 가스 발생여부를 관찰하고, 보통 한천사면 배지는 20±2시간 배양한 후 그 집락에 대하여 그람염색하여 검경한다. 이때의 모든 배양온도는 35±0.5℃로 한다.라우릴 트립토스 액체배지 또는 유당액체배지에서 가스가 발생하고 보통 한천사면 배지에서 그람음성 무아포성 간균이 증명되면 완전시험 양성으로 판정한다.2.5 최적확수 계산법시험결과에 의한 총대장균군수는 최적확수표에 의하여 결정하며, 여러 단계로 희석이 되었더라도 그 중 연속적으로 희석한 3단계의 희석단계를 선택하여 계산한다.최적확수표에는 시료량이 10, 1, 0.1mL의 희석단계에 대한 최적확수만이 최적확수/100mL로 표시되어 있으므로 그 이상 희석을 한 시료는 희석도를 곱하여 기록한다.예를 들면, 시료량을 1, 0.1, 0.01mL로 희석한 경우에는 표 중의 10, 1, 0.1mL와 동일하게 최적확수를 구하고 그 결과에 희석도 10을 곱하여 기록하며, 시료량을 0.1, 0.01, 0.001mL로 한 경우에는 희석도 100을 곱하여 기록한다. 이하 각 희석도에 따라 이에 준하면 된다.다음 표 중의 예(1)에 표시한 것과 같이 1mL를 이식한 시험관 5개가 모두 양성, 0.1mL를 이식한 시험관에서도 똑같이 5개가 모두 양성, 0.01mL를 이식한 시험관에서는 5개 중에 2개 양성, 0.001mL를 이식한 시험관에서는 전부 음성의 결과가 얻어졌다면 5개의 시험관에서 모두 양성이 나온 최대 희석단계의 것을 선택하고 연속하여 다음 희석도를 선택하여 양성 시험관수는 5, 2, 0이 된다.이것으로부터 100mL중의 최적확수를 구하려면 5, 2, 0의 경우를 취하여 표의 해당하는 난0.001⑴⑵⑶⑷⑸5/5[5/5][0/5][5/5][5/5][5/5][4/5][1/5]3/5[3/5][2/5][2/5][0/5]1/5[2/5][0/5]0/50/51/50/5총대장균수 시험의 최적확수표양 성시험관수MPN/100 mL95 % 신뢰구간양 성시험관수MPN/100 mL95 % 신뢰구간하 한상 한하 한상 한0-0-00-0-10-1-00-2-01-0-01-0-11-1-01-1-11-2-02-0-02-0-12-1-02-1-12-2-02-3-03-0-03-0-13-1-03-1-13-2-03-2-14-0-04-0-14-1-04-1-14-1-2〈**************************71317172126-1.01.01.01.01.01.02.02.01.02.02.03.03.05.03.04.04.06.06.07.05.07.07.09.012-*************8*************9*************8454655634-2-04-2-14-3-04-3-14-4-05-0-05-0-15-0-25-1-05-1-15-1-25-2-05-2-15-2-25-3-05-3-15-3-25-3-35-4-05-4-15-4-25-4-35-4-45-5-05-5-15-5-25-5-35-5-45-5-5*************040305060507*************01*************0*************600≥16009.0121215169.0*************040304060805*************00100200*************78**************************0**************************09*************05300-3. 막여과 시험방법3.1 적용범위본 시험방법은 환경정책 기본법 제10조의 환경기준에 규정된 총대장균군수 시험에 적용한다.3.2 측정원리시료의 종류 및 특성에 따라 적당량의 시료를 취하고, 여과시료가 1mL이하인 경우에는 멸균된 희석수를 사용하여 적당히 희석한 후 여과하여, 그 여과막을 e)나 셀룰로즈 에스테르(Cellulose ester) 재질의 미생물 분석용 여과막, 직경 47mm, 공경 0.45μm㈒ 멸균된 피펫 및 핀셋3.4 시험방법멸균된 핀셋으로 여과막의 눈금을 위로하여 여과장치의 여과재 지지대 위에 올려 놓는다. 주의하여 막여과 장치를 부착시킨 후 일정량의 시료(표 참조)를 여과관 상부에 주입하면서 흡입여과하고 멸균수 20～30mL로 씻어준다.반고체 배지인 엠-엔도 아가 레스(m-Endo agar LES)를 사용할 경우에는 여과한 여과막의 눈금을 위로하여 페트리접시 내의 배지위에 올려놓은 다음 페트리 접시를 거꾸로 놓고 35±0.5℃에서 22～24시간 배양한다.액체 배지인 엠-엔도(m-Endo)배지를 사용할 경우에는 1.8～2.0mL의 엠-엔도(m-Endo) 배지가 들어있는 페트리접시의 흡수패드 위에 여과막을 올려 놓은 다음 페트리접시를 거꾸로 놓고 35±0.5℃에서 22～24시간 동안 배양한다.막여과 시험방법의 예상 시료량시료의 종류여과해야할 예상 시료량( × mL )100501010.10.010.0010.0001호소, 저수지수상수원수위락용수하천수염소소독한 하수하수 원수○○○○○○○○○○○○○○○○○○○○3.5 계수법총대장균군은 배양후 금속성 광택을 띠는 분홍이나 진홍계통의 붉은색 집락을 형성한다. 계수는 페트리접시를 저배율(10 또는 15배)의 해부 현미경이나 실체 현미경 위에 올려놓고 관찰된 집락수를 계수한다. 총대장균군은 시료 100mL중에 들어있는 총대장균군 집락수로 나타내며, 여과막당 그 집락수가 20～80의 범위에 드는 것을 선정하여 다음의 식에 의해 계산한다.총대장균군수/100 mL={생성된집락수×100} over {여과한시료량(mL)} 집락들이 서로 융합되어 있을 경우에는 “CG(융합성 성장)”로 표시하고 멸균수로 희석하여 다시 실험하거나 시료를 적게 취하여 다시 실험한다. 그리고 여과막당 집락수가 200이상으로, 계수가 불가능한 경우에는 “TNTC(너무 많아 계수가 불가능)”로 표시한다.수질이 양호한 경우, 검출되

생활/환경| 2008.04.05| 11페이지| 1,000원| 조회(1,567)

대장균군, 총대, 적확, 하천수, 장균, 수법

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총대장균군 최적확수 실험 예비 리포트

제목: 총 대장균군-최적확수법목적: 최적확수법을 이용하여 하천수, 하수, 수돗물 등의 총대장균군수를 측정한다.정의: 총대장균군이라 함은 그람음성?무아포성의 간균으로서 유당을 분해하여 가스 또 는 산을 발생하는 모든 호기성 또는 통성 혐기성균을 말한다.원리: 유당이 포함된 액체 배지에서 총대장균군을 배양하면 유당이 분해되어 가스가 생 성되어지는 원리를 이용한 방법으로, 시료를 최소 3단계 이상의 희석단계별로 5 개씩 접종하고 그 중 가스를 생성한 양성 시험관이 포함되는 적정범위의 연속적 인 3단계를 선택하여 확률적인 수치인 최적확수로 표시하며, 그 결과는 총대장균 군수/100mL의 단위로 표시한다.준비: ㈎ 피z펫:용량 1～10mL의 메스피펫이나 자동피펫(플라스틱피펫팁 포함)으로서 멸 균된 것을 사용한다.㈏ 시험관 : 안지름 16mm, 높이 150mm 정도의 시험관으로 마개(솜, 실리콘, 플라스 틱 등)를 할 수 있고 고압증기 멸균을 할 수 있어야 한다.㈐ 다람관: 안지름 6mm, 높이 30mm 정도의 시험관으로 고압증기 멸균을 할 수 있어 야 하며 가스포집을 위해 거꾸로 집어 넣는다.㈑ 백금이 : 고리의 안 지름이 약 3mm인 백금이를 사용한다.㈒ 페트리접시: 지름 약 9cm, 높이 약 1.5cm의 유리제품이나 1회용 플라스틱 제품으 로 멸균된 것을 사용한다.㈓ 배양기: 배양 온도를 35±0.5℃로 유지할 수 있는 것을 사용한다.㈒ 집락계수기: 확대경과 조명장치가 부착되어 있고 집락을 계수하기 좋도록 페트리 접시를 놓는 판에 1cm2로 구획이 그려진 것을 사용한다.시료준비: 시료를 10, 1, 0.1, 0.01 ......mL로 희석단계를 정하고 단계마다 각각 5개씩 배 양하여 그 중 가스를 발생하는 양성 시험환수를 계수하여 최적확수표에 의거 정량한다. 시료는 희석단계 중 3단계에서 그 최대량을 이식한 5개 시험관이 전부 또는 대다수 음성이 되도록 적당히 희석한다.실험순서: 실험은 추정실험 → 확정실험 →완전실험 순서로 진행된다.추정실험: 배지와 다람관을 넣은 시험관을 35±0.5℃에서 24±2시간 배양하여 가스발생 여부를 관찰한다.확정실험: 추정실험에서 양서으로 의심되는 시험관으로부터 백금이를 사용하여 BGLB 배지가 든 시험관에 무균적으로 이식하여 35±0.5℃에서, 48±3시간동안 배양 하면서 가스발생 여부를 관찰한다.완전실험: 확정실험 양성 시험관을 엔도 또는 EMB평판배지에 이식하여 24±2시간 배양 후 전형적총대장균군 집락 또는 비전형적집락 2개이상을 따서 다람관이 들어 있는 라우릴트립토스 액체배지 또는 유당액체배지 시험관과 보통 한천배지 사 면에 이식한다. 액체배지 시험관은 48±3시간 배양하여 가스 발생여부를 관찰 하고, 보통 한천사면배지는 20±2시간 배양 후 그 집락에 대하여 그람염색하여 검경한다. 이 때의 모든 배양온도는 35±0.5℃로 한다.액체배지에서 가스가 발생하고 보통한천사면 배지에서 그람음성 무아포성 간균이 증명되면 완전실험 양성으로 판정한다.계산: 실험결과에 의한 총대장균군수는 최적확수표에 의하여 결정하며, 연속적으로 희 석한 3단계를 선택하여 계산한다. 최적확수표의 단위가 100mL이므로 시료를 희 석한 경우 희석도를 곱한다.총대장균수 시험의 최적확수표양 성시험관수MPN/100 mL95 % 신뢰구간양 성시험관수MPN/100 mL95 % 신뢰구간하 한상 한하 한상 한0-0-00-0-10-1-00-2-01-0-01-0-11-1-01-1-11-2-02-0-02-0-12-1-02-1-12-2-02-3-03-0-03-0-13-1-03-1-13-2-03-2-14-0-04-0-14-1-04-1-14-1-2〈**************************71317172126-1.01.01.01.01.01.02.02.01.02.02.03.03.05.03.04.04.06.0

생활/환경| 2008.04.05| 2페이지| 1,000원| 조회(1,166)

대장균군, 총대, 적확, 하천수, 장균, 수법

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