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효소의 역가 측정-Lysozyme

? 서론? Lysozyme염기성 단백질로 129개 아미노산으로 되어 있으며, 산성에서는 내열성이 강하고 염기성에서는 비교적 내열성이 약하다. 당, 단백질, 유기산, 아미노산 등에 의해 작용이 높아지나, 전분 등 다당류 존재하에서 작용이 저하된다.계란흰자에 0.3% 함유되어 있고, 사람의 눈물, 타액에 존재하는 용균활성을 가진 물질로 식품의 변질방지에 사용된다. 라이소자임은 그람양성균, 대장균, 살모넬라 등 그람음성균의 세표벽을 분해하는 기능을 가졌으며, 세포벽을 구성하고 있는 다당 N-아세틸글루코사민(NAG)과 N-아세틸뮤라믹산(N-Acetylmuramic acid: NAM)의 축합물인 β-1.4 -글루코시드 결합을 절단하는 역할을 한다.기능면으로 ①전염병의 예방 ②항생물질의 부활 ③포도상구균의 항생물질 감수성의 증대④인플루엔자 예방에 효과가 있다.역가조정, 품질보존 등을 위하여 희석제, 안정제 등을 첨가할 수 있으며, 흡습성이 강하므로 냉암소에 밀봉 보존하여야 한다.? 완충용액일반적으로 약한 산과 그 염의 혼합용액 또는 약한 염기와 그 염의 혼합용액이 완충작용을 한다. 예를 들어 약한 산인 아세트산과 그 염인 아세트산나트륨의 혼합액이 있다. 아세트산에 대해서는CH3COOH ↔ CH3COO-＋H+ … ①과 같은 해리평형이 성립하며, 아세트산 이온의 농도는 매우 작다.한편, 아세트산나트륨은CH3COONa → CH3COO-＋Na+ … ②와 같이 대부분 해리한다. 따라서 혼합액 속에는 많은 양의 아세트산 분자와 아세트산 이온, 나트륨 이온, 그리고 적은 양의 수소 이온이 존재한다. 따라서 용액은 약한 산성을 띠며, 용액 속의 아세트산 이온의 농도는 아세트산나트륨의 농도에 따라 결정된다.이 용액에 외부에서 산이 가해져 수소 이온(H+)이 증가하면, ②식에서 생긴 대량의 CH3COO-과 반응하여 ①식의 평형에 의해서 오른쪽에서 왼쪽으로 반응이 진행된다. 즉, 증가한 수소 이온(H+)은 아세트산 이온(CH3COO-)과 결합하여 아세트산 분자(CH3COOH)가 되면서 용액의 수소 이온농도는 거의 변하지 않는다. 반대로 염기를 가해 수산화 이온(OH-)이 증가하면 용액 속의 수소 이온(H+)이 중화되어 줄어든다. 하지만 ①식의 평형에 따라 왼쪽에서 오른쪽으로 반응이 진행되어 다시 수소 이온(H+)을 생성하면서 용액의 수소이온농도는 거의 일정하게 유지된다. 이와 같은 작용을 완충작용이라 하며, 화학반응은 물론 생체 내에서도 중요한 구실을 한다. 이 아세트산-아세트산나트륨 혼합용액을 와르포르의 완충용액이라고 한다. 이밖에 필요로 하는 pH와 사용하는 시약에 따라 세렌센·코르토프·매킬베인·미하에리스·브리튼-로빈슨 등의 완충용액이 있다.? 효소 역가 측정하는 다른 실험① 아밀라아제 역가 측정- 기질 : 가용성전분- 산물 : 덱스트린- 효소 : 아밀라아제- 측정원리본 시험방법은 Aspergillus niger 및 그 변종, Aspergillus oryzae 및 그 변종, Rhizopus oryzae 및 그 변종, 맥아에서 얻어진 효소제의 α-아밀라아제 역가를 측정하는 방법이다. 역가시험은 온도 30±0.1°에서 일정 농도의 전분용액의 표준가수분해 정도를 얻는데 요하는 시간에 근거를 두고 있다. 가수분해의 정도는 가수분해물의 요오드색을 표준색과 비교하여 측정한다.② 프로테아제 역가 측정- 기질 : 카제인- 산물 : L-티로신- 효소 : 프로테아제- 측정원리본 시험방법은 Bacillus subtilis 및 그 변종, Bacillus licheniformis 및 그 변종, Bacillus stearothermophilus 및 그 변종의 배양물에서 얻어진 효소제의 PC단위로 표시된 프로테아제 역가를 측정하는 방법이다. 역가시험은 pH 7.0, 온도 37°에서 카제인기질의 30분간 단백질가수분해에 근거를 두고 있다. 가수분해되지 않은 카제인은 여과에 의해 제거되고 용해된 카제인을 흡광도측정법으로 측정한다.③ 아스파라기나아제- 기질 : L-아스파라긴- 산물 : 암모니아- 효소 : 아스파라기나아제- 측정원리본 시험방법은 pH 7.0, 온도 37°에서 L-아스파라긴(L-asparagi ne)의 가수분해로 생성된 암모니아를 측정하는 방법으로 이 때 생성된 암모니아는 α-ketoglutarate와 결합하여 L-글루탐산을 생성하며, 이 과정에서 소비되는 NADH( Nicotineamide adenine dinucleotide, reduced)의 소비량으로 측정한다.? 본론? 실험과정 (모두 새 용기 사용)① 완충용액 제조- 50mM 인산완충용액(pH7)을 미리 준비했다.② 기질용액 제조- 완충용액에 동결 건조된 Micrococcus lysodeikticus 가루를 섞는다.- 0.25g/L로 40mL을 제조해야 하므로 완충용액 40mL에 Micrococcus lysodeikticus 0.01g을 섞는다.③ 표준 Lysozyme 효소 용액 제조- 효소원액을 완충용액에 녹여 0.1g/L 농도로 50mL 제조한다.(1g/L 용액을 1/10희석해서 만들었음)표준 Lysozyme 효소용액 번호①②③Lysozyme 농도 (g/L)0.010.0250.050.1g/L 효소 원액 첨가량 (mL)0.10.250.5완충용액 첨가량 (mL)0.90.750.5효소 용액 총량 (mL)111- 표준 효소 용액 3가지 제조④ 효소 역가를 분석할 비지의 시료 용액 제조- 타액이나 눈물 0.3mL 정도 마련, 완충용액 사용한 1/10 희석액도 제조한다.- 완충용액 900uL와 타액 100uL섞어 희석한다.⑤ 분광광도계 측정? 4mL의 큐벳에 파장은 450nm에서, 영점은 완충용액이나 증류수로 잡는다.? Blank 효소 반응 실험 (Negative control)- 효소를 첨가하지 않고 기질의 변화를 관찰한다.- 3mL의 기질용액과 100uL의 완충용액(효소대신)을 첨가한다.- 바로 큐벳을 파라필름으로 막고 흔들어주고 3초 이내에 혼탁도 측정한다.5초간격으로 1분간 측정하고, 15초 간격으로 5분까지 측정한다.? Authentic 효소 반응 실험 (Positive control)- Lysozyme 시약을 마련하여 효소 반응이 잘 일어나는지 확인한다.- 기질 3mL과 표준 Lysozyme 효소용액을 100uL 섞어 ?과 같이 측정한다.- 표준 Lysozyme2,3도 같은 방법으로 측정한다.? sample 효소 반응 실험- 기질 3mL과 눈물 100uL를 섞어 ?과 같이 측정한다.- 1/10 희석액도 마찬가지로 측정한다.⑥ 흡광도로 그래프를 그려 처음 직선구간의 추세선을 그린다.추세선 방정식의 기울기 값을 다음에 대입한다.Lysozyme의 효소 역가 = (추세선 기울기 값) * (-1) * 1000 * 60 * 10? 결론Abs.450nm반응시간(sec)Blank효소반응Authentic 효소반응미지의 시료에 대한 효소반응Lysozyme효소액①Lysozyme효소액②Lysozyme효소액③종미타액혜진타액원액1/10희석액원액1/10희석액51.0501.0260.7570.8111.0110.9600.9380.955101.0511.0210.7530.7950.9980.9570.9200.950151.0501.0190.7500.7830.9890.9530.9030.947201.0501.0140.7480.7700.9770.9490.8720.923251.0511.0120.7440.7620.9640.9450.8460.897301.0511.0090.7380.7550.9610.9410.8410.896351.0501.0060.7340.7420.9590.9370.8300.893401.0511.0030.7270.7350.9540.9350.8270.891451.0511.0000.7230.7280.9480.9320.8220.888501.0510.9920.7190.7160.9430.9300.8150.883551.0510.9880.7120.7030.9410.9260.8090.879601.0520.9830.6990.6920.9310.9180.8040.874751.0520.9790.6870.6780.9220.9100.7820.859901.0510.9740.6760.6630.9150.9020.7630.8411051.0520.9700.6680.6320.9100.8910.7490.8211201.0520.9650.6600.6060.9020.8830.7390.8001351.0520.9570.6510.5800.8920.8760.7290.7881501.0510.9470.6430.5570.8840.8690.7160.7751651.0510.9390.6340.5410.8770.8650.7120.7681801.0510.9290.6260.5200.872

자연과학| 2014.03.05| 7페이지| 1,000원| 조회(302)

효소, lysozyme, 리소자임

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항체의발현과 정제

항체의 발현과 정제 (Expression Purification of antibody)목 차 1. 실험목표 2. 동물세포배양 (Animal Cell Culture) 이란 ? 3. 동물세포배양의 역사 4. 배지의 종류 5. 시약의 종류 6. 세포주의 종류 7. 세포배양에 필요한 기기와 재료 8. Subculture 9. 동결 보존 10. 고 찰1. 실 험 목 표 동물세포의 현탁 배양 공정에 필요한 배지 제조 , 오염방지 조작 , 계대 배양 , 배양 규모확장 , 세포 생장 곡선 잡기 , 세포 동결 저장 , 관련 방비 활용 등 기술을 익힌다 . 항체의 정제 원리를 이해하고 , Protein A- 친화 크로마토 그래피를 수행한 후 항체 분자의 정제 기술을 익힌다 .2. 동물세포배양 (Animal Cell Culture) 특정 동물의 생체세포나 조직을 분리하여 생체 밖의 환경에서 어느 일정기간 생육시키는 기술 동물세포배양은 동물의 세포를 배양용기보통 dish 나 flask 에서 키움 . 세포주 - 동물세포 중에는 암세포와 같이 끝임 없이 분열하는 능력을 지니거나 특이적인 기능을 발현하도록 개발된 세포들 동물세포배양의 목적은 생명현상의 해명을 위하여 세포 , 조직을 독립된 생명체로 인식하고 이들을 분자생물학 등의 연구재료로 이용하는 것 입니다 .3. 동물세포배양의 역사 (History of Animal Cell Culture) 최초의 동물세포배양 - 1907 년 Harrison 의 올챙이 척색에서 채취한 신경섬유세포를 개구리의 응고 림프액에 배양 그 후 배양액의 개선을 통해 ( 혈청과 조직 추출액에 무기염류 , 아미노산 , 비타민 등을 첨가 ) 동물 세포를 배양기 안에서 재현성이 좋게 배양하게 됨 . 20 세기 중엽 전까지 세포배양법은 연구자가 일반적으로 이용할 수 있는 방법이 되지 못함 . - 혈청 (serum), 특이적인 기능을 발현하는 세포주 (Cell line) 수립의 어려움 . 세포주와 무혈청 (serum-free) 배지가 개발 , 세포배양법을 널리 이용하게 됨것 을 골라서 사용 . 부착성 동물세포 - BME 배지를 기초로 만든 DMEM 과 MEM 을 가장 널리 사용 . 부유성 동물세포 - RPMI1640 을 널리 사용 .5. 시약의 종류 FBS Fetal bovine serum 은 소 태아 혈청 . 혈청이란 혈액 중에서 혈구와 피브리노겐을 제거한 액체성분으로 소 태아의 혈액에서 추출 . FBS 는 사용 전 열불활성화를 하고 -20℃ deep freezer 에 한 번 사용할 만큼 씩 나누어서 보관 . FBS 를 사용 시 , -20℃ 에서 꺼낸 뒤 37 ℃ water bath 에서 녹여 사용 . Antibiotics 미생물의 오염을 방지하기 위해 배지에 첨가하며 주로 penicillin streptomycin solution (100×) 을 희석하여 사용 . Trypsin -EDTA 배양용기에서 동물세포를 떼어낼 때 사용하는 단백질 분해 효소 .5. 시약의 종류 PBS Phosphate Buffered Saline(PBS) 는 동물세포에 남아있는 배지를 세척에 사용 . 사용 전 37℃ water bath 에서 충분히 데워준다 . DMSO Dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 highly polar organic reagent 로 동물세포의 동결보존 시 동결보존제로 사용 . Trypan blue 세포의 수를 계산할 때 사용하는 염색시약으로 사세포만 푸른색으로 염색되어 생세포와 구분되게 해준다 .6. 세포주의 종류 적절한 배지와 공간에서 무한하게 증식하는 세포 한국세포주은행에서 보관하고 있으며 필요에 따라 분양가능하다 .7. 기기와 재료 (Equipments Meterials ) Clean bench 무균조작을 할 수 있는 공간을 제공하는 실험기구 . Clean bench 안에는 형광등 , UV 등 , hood(0.3μm 의 입자를 99.99% 까지 제거해 주는 filter 가 설치 되어 있음 ) 가 설치 . 동물세포 실험 전에는 clean bench 를 70% 에탄올로 깨끗이 닦고 UV 등과 hood 를 잠거나 세포해동 시 이용 . Water bath 사용 시 수돗물이 아닌 증류수를 넣으며 , 항박테리아 시약인 sodium azide 를 소량 첨가해주고 증류수를 정기적으로 갈아주어 미생물에 의한 오염을 예방한다 .7. 기기와 재료 (Equipments Meterials ) Suction 기구 Dish 나 tube 에서 배지 , PBS 등을 제거할 때 사용 . Clean bench 아래 vacuum pump 를 설치 , Aspirator 에 연결해서 멸균한 파스퇴르 피펫을 이용해 suction.7. 기기와 재료 (Equipments Meterials ) Culture dish 동물세포를 배양하기 위해 특별히 고안된 dish. 부착성 동물세포의 경우 dish 에 부착할 수 있도록 collagen, poly-D-lysine, fibronectin 등으로 표면이 코팅 . Dish 의 지름에 따라 100Φ, 60Φ, 35Φ. Culture dish 외에 배양용기로 flask(T-flask), microwell plate(6, 12, 24, 96 well) 등도 사용 .7. 기기와 재료 (Equipments Meterials ) 현미경 도립형 현미경으로 대물렌즈가 아래쪽에 달려 있으며 세포를 키워서 관찰할 때 사용 . 현미경 사용 전 휴지에 70% 에탄올을 뿌려 dish 가 놓이는 자리를 닦아준 뒤 사용하면 오염방지 . 시료를 100 배 , 200 배 , 400 배로 확대하면 동물세포 관찰에 적당 .7. 기기와 재료 (Equipments Meterials ) CO2 배양기 동물세포 배양을 위해 배양기 . CO2 가 5% 의 농도로 유지 . CO2 는 pH 를 유지 . 증류수를 넣어 배양기내부습도를 조절 . 증류수에는 소량의 항박테리아 시약인 sodium azide 를 넣어 미생물의 번식을 예방 . CO2 배양기 내의 물은 증발하기 때문에 늘 일정한 수위를 유지하도록 채워주어야 하며 , CO2 배양기 내부 청소도 정기적으로 해 주어야만 오염을 예방 .7. 기기와 재료 (Eq시약 보관을 위해서 필요 . deep freezer (-80℃) 는 FBS 를 보관하거나 동결보존과정에서 필요 . 액체질소 (Liquid N2) 탱크 액체 질소는 -196℃ 의 초저온으로 동물세포를 동결보존에 의해 장기간 안정하게 보관 . 액체질소탱크를 이용할 때는 반드시 전용장갑을 착용한 후 이용해야 동상을 예방한다 .8. Subculture 1. 동물세포 현탁액 중 20μl 을 epp tube 에 넣은 후 trypan blue 20μl 를 넣고 섞는다 . 20μl 를 hemacytometer 의 양쪽에 10μl 정도씩 넣는다 . hemacytometer 의 cover glass 를 덮은 상태에서 그 틈에 tip 끝을 대고 혼합액을 넣는다 . 너무 천천히 넣으면 동물세포가 골고루 들어가지 않기 때문에 약간 빨리 넣는다 . 3. 현미경의 조리개를 가장 밝게 맞추고 현미경의 배율을 100 배로 맞춘 다음 동물세포의 숫자를 센다 .8. Subculture 9 개의 영역 중 그림과 같은 5 곳을 택하여 세포의 수를 counter 한다 . 푸른색은 trypan blue 에 염색된 사세포니 화살표의 염색안된 살아있는 세포수를 센다 . 계산법 총 cell 수 X 희석배수 X 10^4 X 구역수 X 총 배지량 ml 10^4 : 모눈에서 한 칸의 부피는 0.1mmX0.1mmX0.1mm = 0.001mm3 = 0.1μl μl 를 ml 단위로 변환하려면 0.1μl 에 10000 을 곱해야 하므로 10^4 을 곱함 . 6. 새로 배양할 배지 부피에서 위 계산량을 빼고 새 배지를 넣어주면 Subculture9. 동 결 보 존 (Cryopreservation) 동물세포가 충분히 자란 dish 의 배지를 suction 으로 완전히 제거한다 . 동물세포가 dish 의 90~100% 정도를 채우도록 배양한 뒤 동결보존을 시작한다 . 배지가 제거된 dish 에 PBS 10ml 을 넣어 세척한다 . 그 다음 바로 suction 으로 PBS 를 제거한다 . FBS 의 성분 중에 trypsin h 를 배양기에서 꺼낸 후 DMEM 배지 9ml 을 넣어 trypsin -EDTA 를 불활성화 시킨다 . Dish 를 조심스럽게 흔들어 배지를 골고루 섞고 15ml conical tube 에 옮겨 담는다 .9. 동 결 보 존 (Cryopreservation) 15ml conical tube 를 원심분리기에 넣고 1000rpm 에서 5 분간 원심분리한다 . 원심분리 후 suction 으로 배지를 제거한다 . 이때 pellet 를 건드리지 않도록 주의한다 . 새 DMEM 배지 2ml 을 넣고 suspension 을 하여 pellet 을 풀어준다 . 동결보존세포의 경우 이상적인 동물세포의 농도는 5 X 10^6 (500 만 ) 마리이므로 이 경우 1.8~2.2ml 의 배지로 풀어준다 .9. 동 결 보 존 (Cryopreservation) DMSO 0.22ml (10%) 을 잘 섞어준다 . DMSO 는 동물세포에 독성을 나타내므로 천천히 섞어준다 . DMSO 는 동결 시 세포에 내동성을 부여하기 위해 사용하는 동결보존제로배지에 10% 정도 첨가는 것이 일반적이다 . glycerol 을 첨가하기도하나 DMSO 가 더 효과적이다 . 8. stock vial 에 1ml 씩 나누어 담고 -20℃ 에서 2~3 시간 , -80℃ 의 deep freezer 로 옮겨서 7~8 시간 (O/N), 196℃ 액체질소에 넣어 장기 보관한다 .10. 고 찰 sample 부피 ( ml) A280 농도 ( ug /ml) 항체질량 ( ug ) LO 25 5.56 2883 72075 FT 27 5.22 2723 73521 W 10 1.36 693 6930 E4 0.625 0.011 -39 -24.375 E5 0.625 0.058 -39 -24.375 E6 0.625 0.068 -27 -16.875 E7 0.625 22.87 818 511.25 E8 0.625 0.257 56 35 E9 0.625 0.17 -9 -5.625 SM LO FT W E4 E5 E6 E7 E8 E9 결합효율 = [ LO-(how}

자연과학| 2014.03.05| 25페이지| 1,000원| 조회(195)

항체, 정제, 항체의발현과 정제

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크로마토그램의 해석

【HPLC 결과 크로마토그램의 해석】◆ 여러 가지 표준 시료 정리Vitamine B1 Vitamine B3 (Nicotinic acid)표준 시료RT (min)피크 면적 (mV·sec)Vitamine B12.36677277.0825Vitamine B3 (Nicotinic acid)3.46674600.9956Vitamine B3 (Nicotineamide)3.33332608.3936Vitamine C3.01673119.4436Vitamine B3 (Nicotineamide) Vitamine C◆ 농도별 표준 시료 정리Vitamine C 0.025g/LVitamine C 0.05g/LVitamine C 0.1g/LVitamine C 농도 (g/L)RT (min)피크 면적 (mV·sec)0.0252.9667820.35150.052.98331517.45500.13.01673119.4463◆ 미지시료에 대한 결과 크로마토그램의 해석☆ 미지시료 #1RT (min)피크 면적 (mV·sec)성분 추정12.38333071.1233Vitamine B122.98332790.8430Vitamine C① 성분들은 무엇인가?- Vitamine B1, Vitamine C② Vitamine C의 농도은 얼마인가?→ 피크 면적 2790.8430을 검량선에 대입한다.y=30852x+19.356, y에 2790.8430을 대입2790.8430=30852x+19.356(2790.8430-19.356)/30852=0.089832→ 미지시료의 Vitamine C 농도는 0.089832g/L가 나온다.☆ 미지시료 #2RT (min)피크 면적 (mV·sec)성분 추정12.9833974.0111Vitamine C23.36671686.7737Vitamine B3 (Nicotineamide)① 성분들은 무엇인가?- Vitamine C, Vitamine B3 (Nicotineamide)② Vitamine C의 농도은 얼마인가?→ 피크 면적 974.0111을 검량선에 대입한다.y=30852x+19.356, y에 974.0111을 대입974.0111=30852x+19.356(974.0111-19.356)/30852=0.030943→ 미지시료의 Vitamine C 농도는 0.030943g/L가 나온다.◆ 이동상 용액 제조법0.02% Triethylamine5μM Sodium Hexanesulfonic acid17.5% MeOH in distilled water adjusted pH 3.5 with acetic acid☆ 이동상 용액 2L 제조① 1.8L 정도의 증류수에 Triethylamine 0.4mL, MeOH 350mL를 섞는다.② 5μM Sodium Hexanesulfonic acid는 저울로 측정하기 힘들기 때문에 2000x 농축액 100mL(0.18822g) 제조 후에 100μL 섞는다.③ acetic acid를 넣으면서 pH를 3.5에 맞춘다.④ 2L까지 증류수로 채운다.⑤ Aspirator로 여과하여 깨끗한 용기에 담는다.⑥ 초음파 세척기에서 탈기한다.

자연과학| 2014.03.05| 4페이지| 1,000원| 조회(450)

크로마토그래피, 크로마토그램, 크로마토그램의 해석

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비색정량법 - Bradford 단백질 분석법

? 서론? 정량(Quantitative)과 정성(Qualitative)- 정량 : 시료를 구성하고 있는 각 성분의 양을 구하는 분석법- 정성 : 시료의 성분이 무엇인지 검출하여 알아내는 분석법? 비색법 : 미지시료 용액의 색을 표준 용액의 색과 견주어 농도를 결정하는 분석법? Bradford 분석법의 원리Bradford는 Coomassie Brilliant Blue G-250 dye, Phosphoric acid, Methanol의 혼합물로 불그스름한 갈색을 띈다. Coomassie Brilliant Blue G-250 dye는 산성용액 상에서 단백질과 결합하여 최대 흡광도를 465nm에서 595nm로 이동시킨다. (따라서, 595nm에서 흡광도는 단백질의 농도와 비례하게 된다.) Coomassie Brilliant Blue G-250 dye의 음이온이 단백질의 양이온 부분과 정전기적 인력에 의한 결합을 한다. 각각의 단백질 분자에 결합된 Coomassie Brilliant Blue G-250 dye의 수는 대략 단백질에 있는 양이온 수와 비례한다. 단백질에 결합한 Coomassie는 갈색에서 푸른색으로 색깔변화를 야기한다. 이때 이 dye가 단백질과 결합해 생기는 파장의 변화를 측정하는 것이다.? 회귀직선 (=추세선, 검량선)? 세 점에 가장 가깝게 지나는 선용액번호①②③④⑤⑥BSA 단백질 농도(g/L)00.20.40.60.81.02g/L BSA 표준액의 첨가량 (uL)0*************00증류수의 첨가량 (uL)1*************00500총량 (uL)10*************010001000? 실습? 실험방법1) 2g/L BSA 표준용액을 만든다.총 1500uL(=1.5mL) 필요하므로 넉넉히 2mL을 만들었다.2g : 1L = Xg : 2mL2g : 1000mL = Xg : 2mLXg = 0.004g증류수 2mL와 BSA 단백질 0.004g을 섞는다.2) BSA 용액과 증류수를 섞어 농도별로 단백질 용액을 만든다.3) Bradford 발색시약을 1/5로 희석하여 30mL이상 만든다.30mL이상이므로 넉넉히 35mL를 만들었다.증류수 28mL와 Bradford 7mL을 섞으면 된다.7/(28+7)=1/54) 3mL의 Bradford 발색시약과 각 시료 60uL를 각각 섞는다.5) 상온에서 2분간 발색시킨다. 10분정도가 가장 좋고 30분을 넘기지 않도록 한다.6) 흡광도를 측정한다. ( 1번 용액으로 Blank를 잡고 농도대로 측정한다)7) 미지의 시료도 같은 방법으로 Bradford 3mL과 샘플 60uL를 섞어 발색시킨다.? 결과용액 번호①②③④⑤⑥BSA 단백질 농도 (g/L)

자연과학| 2014.03.05| 3페이지| 1,000원| 조회(733)

단백질, Bradford, 비색정량법

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비색 정량법-BCA 시약을 이용한 단백질의 함량 분석 평가A좋아요

? 서론? BCA : bicinchoninic acid단백질이 구리 이온을 환원시킬 수 있는 성질을 이용한다. 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서, 보라빛의 화합물을 생성하게 된다. 이 화합물은 빛의 특정 영역(562nm)에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기에, 분광광도계를 사용해서 측정하면 흡수율 차이를 측정할 수 있다. 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보라빛 화합물이 생성되고, 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수하여 흡수율이 증가하고, 그것에 비례해서 샘플 안에 있는 단백질 양을 가늠한다. Lowry assay의 변형된 최근의 새로운 방법으로써 간단한 실험을 통하여 단백질을 정량할 수 있는 장점이 있다.? 실험과정?검량선 실험① 표준 단백질 시료 제조한다.만들려고 하는 단백질 농도 (mg/mL)00.250.50.751.01.251.501.752.02g/L BSA 표준액첨가량 (uL)*************150175200증류수 첨가량 (uL)2001*************50250총량 (uL)*************00200200200200? 2g/L BSA용액을 50mL정량 플라스크에 제조한다.2g : 1L = xg : 50mLxg = 0.1증류수 50mL에 BSA 0.1g을 넣어 잘 섞어준다.② BCA 시약 C 50mL 제조한다.? BCA 시약 A와 BCA 시약 B를 50:1로 섞어 시약 C를 만든다.대략 50mL이므로 A시약 50mL과 B시약 1mL을 섞는다.③ 단백질 용액과 시약 C를 섞어준다.? 증류수 150uL와 시약 C를 3mL 넣어 섞어준다 : Blank 발색액시료액 150uL와 시약 C를 3mL 넣어 섞어준다 : Sample 발색액④ 37도 water bath나 heat block에서 30분간 처리한다.⑤ 흐르는 수돗물에서 빨리 식힌다.⑥ 바로 분광광도계 562nm에서 농도 0g/L 시료의 발색액으로 Blank를 잡고,Sample 용액들의 흡광도를 측정한다.? 미지의 시료들에 대한 분석 실험① 미지의 시료, 타액, 증류수를 200uL정도씩 준비한다.② 증류수 180uL에 미지의 시료와 타액을 각각 20uL씩 섞어 희석액을 마련한다.? 희석배수 = 20 / (180+20) = 1 / 10③ BCA 시약 C 3mL과 증류수와 시료액 150uL를 각각 섞는다.④ 37도 water bath나 heat block에서 30분간 처리한다.⑤ 흐르는 수독물에서 빨리 식힌다.⑥ 바로 분광광도계 562nm에서 증류수가 들은 발색액으로 Blank를 잡고,Sample 용액들의 흡광도를 측정한다.? 결과? 표준 검량선 결과단백질 농도 (mg/mL)00.250.50.751.01.251.501.752.0흡광도.562nm00.3210.6050.8611.1191.3611.6031.7672.001? 미지의 시료, 타액 결과종류미지의 시료미지의 시료 1/10 희석액타액①타액① 1/10 희석액타액②타액② 1/10 희석액흡광도. 562nm1.9160.3890.9420.1471.7310.258? 단백지 함량 계산① 미지의 시료 : 1.0054 * 1.916 - 0.0767 = 1.8496464② 미지의 시료 1/10 희석액 : 1.0054 * 0.389 - 0.0767 = 0.3144006

자연과학| 2014.03.05| 3페이지| 1,000원| 조회(885)

단백질, BCA, 비색정량법

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