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줄기세포에서 HIF

약어정의HIFHypoxia inducible factorHSCHematopoietic stem cellARNTAryl hydrocarbon receptor nuclear translocatorPHDProlyl hydroxylase domain containing enzymeVHLVon Hippel- Lindau proteinCSCCancer stem cellGSCgiloma stem cellAMLacute myeloid leukemiaCFUColony Forming Unit줄기세포에서 HIF 연구HIF in stem cell저산소증(Hypoxia) 산소가 불충분한 상태에서 정상발달과정 동안에 일어난다.저산소증 세포의 반응은 최초로 HIF(Hypoxia inducible factor)에 의해 영향을 미친다. HIF 는 세포가 저산소증 상태에서 산소의 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 많은 생물학적 과정을 유도하는 전사인자이다.HSC는 골수의 가장 저산소 환경 부위에 존재한다. 저산소증은 HIF-1α를 통해 생체내에서 HSC(Hematopoietic stem cell)기능을 조절한다. 또한 HIF-1α는 HSC 항상성에 중요한 인자이다. 줄기세포능을 유지하는데 HIF의 기능적인 중요성을 혈액 상 악성 암 줄기세포에도 적용된다. 이러한 발견은 줄기세포에서 HIF의 기능이나 근본적인 메카니즘 이해가 조직재생과 암을 위한 새로운 치료법 발달에 도움이 될수 있을 것이라는 것을 보여준다.Introduction유기체 생존에 O2의 항성성 유지는 필수 적이다. 유기체가 저산소압 환경에 놓여 지면 HIF를 통해 산소의 항상성을 유지 하려한다. HIF는 줄기세포유지, 혈관생성, 종양형성, 염증 등 많은 생물학적 과정을 유도하는 전사인자이다.HIF는 2가지 소 단위체로 구성되어있다. O2에 화학적 변 화를 일이키기 쉬운 α-소단위체와 항시 적으로 발현되는 β-소단위체로 구성 되 어있다.HIF-α 소단위체는 3가지 동형단 백질이 존재하는 것으로 알려 지고 있다.HIF-2α, HIF-징이 뚜렷하고 잘 알려져 있다. HIF-1β는 aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT)로 알려져 있고 HIF-1α과 결합하여 전사를 촉진시킨다.(Figure 1)HIF(Hypoxia inducible factor)-1α(Figure 2) 저산소환경과 산소가 존재하는 환경에서 HIF-1α의 변화NormoxiaPHD가 HIF-1α Hydroxylation→VHL에 의해 Ubiquitination→proteasome에 의해 분해HypoxiaHIF-1α stabilization→핵 안에서 HIF-1β와 heterodimer 형성→gene transcription산소가 잘 공급되는 환경에서는, HIF-1α가 PHD (Prolyl hydroxylase domain containing enzyme)에 의해 수산화된다.수산화된 HIF-1α은 VHL(Von Hippel- Lindau protein)에 의해 인식되고 E3 유비퀴틴 연결효소 복합체에 의해 유비퀴틴화 된다. 유비퀴틴화된 HIF-1α은 단백질 분해효소에 의해 분해된다. 저산소증 상태에서 HIF-1α은 PHD에 의해 수산화 되지 않고 수산화 되지 않은 HIF-1α는 VHL에 의해 인식되지 않고 단 백질 분해효소에 의해 분해되지 않는다. 이렇게 안정화된 HIF-1α은 HIF-1β와 이종 이량체를 형성하고 다양한 유전자를 전사한다. 저산소증은 몇몇 줄기세포(배아줄기세포, 조혈모세포, 신경줄기세포 등)의 다른 상태에 영향을 준다. 줄기세포는 stem cell niche라 불리우는 특별한 환경에 산다. 가장 잘 정형화된 stem cell niche는 HSC이다. stem cell niche의 상호작용은 HSC의 자가재생과 분화조절의 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. HSC는 골수에 위치하고 골수는 다른 조직들과 비교적 저산소 환경이라고 예상된다. 골수에서 가장 산소가 없는 장소인 osteoblast nich에서 휴면 HSC는 강화되어 진다고 생각된다. 여기서 우리보호하기 위해 예상치 못한 HSC의 증식을 막고 줄기세포 고갈을 막는 등의 특별한 메카니즘이 있을 것이다. 이러한 메카니즘으로 줄기세포를 다양한 스트레스로부터 보호한다. HSC의 저산소 주변환경이 이런 가능성을 야기시키는 것으로 예상되는데 이러한 가능성은 HSC의 가변적이 O2 level 로 조절되어 질것이다. 이 저산소증 상태에서 HIF가 중요한 조절자로서의 역할을 한다. 여기서 우리는 HIF의 경로와 줄기세포에 집중할 필요가 있다.HIF in HSCHIF-1α의 기능을 폐지하는 ARNT의 유전적 제거는 초기의 조혈작용의 결함을 결과로 가진다. 인간 Lin CD34 CD38세포는 면역결핍 NOD/SCID 생쥐에 적용되었을 때 낮은 산소압에서 골수 재생 활성을 증가시킨다. 유사하게 저산소 상태에서 길러지는 쥐의 HSC는 치명적으로 조사된 쥐에서 편파적으로 정지 HSC 재구성 능력을 강화시켰다.저산소증은 HIF-1α를 통하여 생체내에서 HSC 기능을 조절한다. HIF-1α는 HSC에서 mRNA 와 protein 둘다 높게 발현된다. HSC 내에서 조건적 HIF-1α의 제거는 HSC휴면의 감소로 이어진다. HSC 고갈 이후에 연속적인 골수 이식 동안 재구성 능력은 돌아오지 않았다. 이것은 HIF-1α-null-HSC는 여전히 물리적 상태에서 조혈작용 지원이 가능한 것처럼 보인다. 그러나 HIF-1α는 스트레스 상황에서 HSC 유지에 필수 적이다. 골수의 hypoxic niche 는 HSC의 유지와 스트레스 저항에 중심 역할을 하는 HIF-1α 안정화를 가능하게 한다. 게다가 방사선으로 조사된 HIF-1α-/- mice로의 야생형 단핵세포 골수의 이식에서 장기간 재구성의 결함이 없는 것은 스트레스 상황에서 HSC-HIF-1α-/-의 유지기능의 손상은 주로 세포 자율적인 경우이다.HIF-1α 발현정도의 미세조정은 HSC 기능에 중요하다. VHL 제거에 의한 HIF-1α의 정체는 HSC 휴면을 증가시키게 된다. 그러나 VHL-null-HSC 이식에서 재구성 능력의 상실한 한가지 기능은 산화에서부터 당분해까지의 스위치를 중재하는 것이다. 이것은 조혈 산화 환원작용의 유지와 저산소 환경에서 세포의 생존을 가능하게 한다. HIF-1α는 당분해 효소와 포도당 운반체를 암호화하고 있는 유전자를 자극함으로써 세포대사를 repro -graming 한다. 저산소환경인 HSC niche와 HSC에서 증가된 HIF-1α의 발현이 일치한다면 HSC는 에너지생산을 위한 미토콘드리아의 인산화를 대신해서 당분해를 이용한다. 그러나 HIF-1α가 HSC에서 휴면을 증진시키는 메카니즘과 당분해에 편향된 대사활동은 여전히 불명확하다.HIF-1α는 Cripto/GRP78 신호전달을 증진시킨다. 일부 HSC는 열충격단백질인 GRP78을 발현한다. 이것은 주로 hypoxic endosteal 부위에 위치하고 세포에 높은 비율로 포함되어져있다. GRP78 HSC는 휴면세포에서 많은 부분을 차지하면 골수 이식 후 느린 재구성을 억제한다. 반면 GRP78 HSC는 GRP78 HSC보다 적은 미토콘드리아 포텐셜을(Figure 3)HSC와 Cripto/GRP78 신호전달에서 HIF-1α의 기능(a) HSC와 hematological CSC에서 줄기세포능에 기여하는 HIF-1α. Hypxic niche 속의 HSC는 HIF-1α에 의한 Cripto/GRP78 신호전달을 통해 유지된다. hematological CSC에서는 HIF-1α이 Notch/Hes-1 신호전달을 통해 산소가 존재하는 환경에서 줄기세포능을 조절한다. (b) HSC와 hematological CSC 의 줄기세포능을 조절하는데 HIF-1α의 발현정도가 다르게 요구되는 것을 보여주는 hypothetical model. HSC와 hematological CSC는 그들을 유지하는데 HIF-1α의 다른 발현정도가 필요하다는 것을 보여준다.가진다. mice에 antibody GRP78을 주입해서 GRP78의 활성을 막으면 endosteal 영역에 GRP78 HSC의 빈도가 감소한다. 이것으로 GRP78은 end78이 HSC에서 발현되는 것은 가역적이다. GRP78의 리간드인 Cripto는 endosteal niche의 구성요소에서 발현되어진다. Cripto/GRP78 신호전달은 저산소환경인 HSC niche에서 HSC휴면을 조절한다. HSC 안에서 높은 당분해 활성을 유도 함으로써 저산소 환경에서 HSC를 유지한다. Cripto와GRP78은 둘다 저산소환경에서 수용체의 수를 늘리거나 리간드의 수를 늘리는 작용을 한다. Cripto의 프로모터 부위는 저산소환경에 반응하는 요소를 가진다. 이 반응요소는 안정화된 HIF-1 복합체에 의해 안정화되고 HIF-1복합체에 결합한다. 게다가 HIF-1α의 제거는 GRP78 HSC의 수를 감소시키는 작용을 하고 endosteal niche 에서 Cripto의 수를 줄인다. 그러나 Cripto의 발현은 다양한 줄기세포능 관련 유전자에 의해 자극되어 질 수 있다. 그리고 HIF-1α는 HSC에서 Cripto의 유일한 조절자가 아니다. 또한 HIF-1α는 다양한 타켓에 영향을 미친다. 그러므로 HIF-1α, Cripto/GRP78 신호전달의 기능적 중요성을 더 알아볼 필요가 있다.HIF in hematologicalcancer stem cell(Figure 4) HIF-1α관련 Notch pathwayCSC(Cancer stem cell)와 Normal stem cell은 다양한 특징들을 공유한다. 여기서 HIF-1α가 hematological CSC의 유지에 어떤 역할을 하는지 하지 않는지 알아볼 필요가 있다. 종양을 일으키는 세포라고 알려진 CSC는 주로 휴면기 이거나 느린 cell cycle을 가지고 종양개시와 유지를 책임진다. 또한 종양재발과 치료저항에도관여한다. 때문에 흔히 사용되는 치료는 급격히 확산되는 종양세포를 목표로 한다. 휴면의 CSC는 생존하고 병의 재발을 일으킨다. 그래서 CSC를 유지시키는 분자 메커니즘을 알아내는 것이 암치료 발전에 중요하다.저산소증은 보편적으로 많은 인간 암에서 관찰되고 저산소증 신호전달은 C)

자연과학| 2013.12.24| 7페이지| 1,000원| 조회(116)

저산소증, hypoxia, HIF, Hypoxia inducible fa

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자가포식과 자가포식체

자가포식과 자가포식소체에 대한 연구Membrane biogenesis in the autophagosome formation[1]Key words : autophagy(자가포식), autophagosome(자가포식소체), Atg protein,mitochondria-associated ER membrane(MAM), SNARE proteinAbstract자가포식(autophagy) 작용은 영양부족 세포상태, 또는 세포내에 침입한 외부물질이나 손상된 세포소기관을 분해하는 과정이다.이때 이중막의 자가포식소체(autophagosome)가 형성되는데 그 과정이 복잡하며 그 기능이 밝혀지지 않은 많은 인자들이 있다.소체의 막(membrane) 구조 형성의 메커니즘과 최근 밝혀진 인자들의 기능과 관계에 대해 주목한다.Introduction세포내부에서 리소솜을 형성하여 분해되기까지 3가지의 경로가 존재한다.세포가 고형물질을 세포 안으로 들여오는 작용을 식세포작용이라 하고 액체를 들여오는 경우는 음세포작용이라 한다. 이 2가지 작용의 메커니즘은 본질적으로 같기 때문에, 이 둘을 합쳐 엔도시토시스(endocytosis)라고 한다.반면 자가포식(autophagy)은 세포 내부의 노폐물이나 퇴행성 단백질, 또는 손상된 세포소기관을 제거하는 현상으로 세포의 자가 재활용 시스템이다.이 과정에서 형성되는 자가포식소체(autophagosome)는 세포질의 함입으로 이루어지는 엔도시토시스 과정과는 달리 isolation membrane의 연장으로 이중막을 형성하는 특징을 가진다.자가포식작용이 단순히 세포내부의 재활용 시스템이라는 점 외에도 최근 여러 질병, 면역체계가 이와 관련되어 있음이 증명되고 있다.그럼에도 불구하고 아직까지 자가포식소체의 막 생합성에 관련된 인자들과 메커니즘이 명확하게 밝혀지지 않고 있다.이번 연구에서는 최근 발표된 논문과 자료들 중 자가포식소체의 구조와 막 형성에 관해 주목한다.(Figure 1)Autophagosome membrane다른 엔도시토시스과정과 달리 세증이 지속되어 왔지만 명확하게 밝혀지지 않았다. 1990년대 이르러 실험도구와 과학의 발전으로 yeast 유전자를 통해 autophagy-related genes (Atg)의 존재가 발견되었으며 그 기능들에 대한 연구가 지속되고 있다.(Figure 2)[2]Atg protein자가포식작용에 관여하는 단백질들을 Atg 라 명명하는데 현재 30개 이상의 Atg 단백질들이 알려져 있고 이 중 약 18개 Atg단백질들이 자가포식소체 형성에 중추 역할을 한다. (core 18 Atg)yeast에서 Atg단백질은 형광현미경으로 관찰가능하며 vacuole 옆에 오목한 구조로 쌓여서 위치한다. 이 구조가 PAS(pre-autophagosome structure) 이며 이에 상응하는 것이 진핵세포 내 소포체(ER)의 주변에 위치하고 있다.이러한 Atg 단백질의 축적체(PAS)가 자가포식소체의 전달계로 알려져 있다.Atg9 vesiclesAtg9 단백질은 핵심 Atg 단백질 중에서 유일하게 membrane을 통해서 생성되는 인자이다. 이 단백질은 다른 Atg 단백질의 축적에 필수요소 이며 Atg9 vesicles 의 융합과정을 통해 isolation membrane이 생성되는 것으로 추측된다.정량분석을 통해서 알아낸 바로는 Atg9 vesicles는 대부분 세포질 내에서 아주 유동적이었으며 각각 24내지 32개의 Atg9 분자를 포함하고 있다.최근 Atg9 vesicles 융합 메커니즘에 관한 많은 보고들이 있다.Ragusa et al. 에 의한 Atg17 크리스탈 구조 분석에 따르면 Atg17 은 10nm 반경의 곡선을 가진 초승달 모양을 띈다.이는 기존에 보고된 Atg9 vesicles 의 반경과 대략 일치하는 정도이다.(Figure 3)[3]또한 Atg17 은 C-terminus 와 복합체를 이루는 Atg1, 13, 29, 31 이 존재하는 N-terminus 로 homodimer 를 형성한다.흥미롭게도 Atg1 에는 작은 vesicles 들을 묶을 수 있는 membrangosome maker LC3 이 일시적으로 colocalization 된다.그러나 immunoelectron 현미경에 의하면 Atg9은 작은 vesicles들과 관모양의 구조에서 발견된다.즉, Atg9 은 일시적으로 isolation membrane, 자가포식소체와 상호작용을 하지만 auto-phagosomal membrane 과 지속적으로 결합해 존재 하지는 않는 것이다.Atg9은 관련된 여러 연구들이 여전히 밝혀지지 않은 부분에 대해 계속 진행되고 있다.Autophagosome formation site versus pre-existing organelles(1) ERRubinsztein group은 plasma membrane 이 autophagosome membrane 의 여러 유래중 하나 임을 제시했다.Atg16L1(isolation membrane 관련 특유의 Atg)이 클라스린 중쇄(clathrin heavy chain)와 상호작용하며 클라스린 막 구조물에 위치 함을 밝혀냈다. 연구진은 Atg16L1 에 의해 isolation membrane이 클라스린 매개의 endocytosis와 SNARE protein VAMP7 대응체의 homotypic 융합을 거친 세포막에서 발생됨을 제시한다.이를 뒷받침하듯 ER과 자가포식소체의 구조적 배치간에 강한 연관성이 있음을 보여주는 몇 가지 근거가 있다.첫 번째, ULK1과 같은 초기 Atg protein 과 Atg14L은 ER에 근접해서 puncta형태로 관찰된다.두 번째, Atg14L이 자가포식소체 구조에 그 기능을 위해 Atg14L N-terminus의 시스테인이 풍부한 ER localization signal이 필요하다.세 번째, PI3P-결합단백질인 DFCP1은 ER 위쪽에 오메가 모양의 구조물로 위치한다.이것을 omegasome이라 하는데 이 부분에서 isolation membrane 이 나타난다.마지막으로 3D 전자단층촬영을 통해 발생초기의 isolation membrane이 ER과 연결되어 있음을n 동안 자가포식소체로 옮겨지는 것을 관찰되었다.이는 autophagosome membrane 은 주로 ER stress에 의해 유도되지만, 특별한 케이스로 미토콘드리아 외부막으로 부터 유래할 수 있음을 의미한다.현재 관찰결과들을 통해 2가지 모델 모두가 인정되는 상황이다.(3) MAM(mitochondria associated ER membrane)몇몇 연구를 통해 ER과 미토콘드리아는 작은 부위에서 서로 접촉함을 알 수 있다.이러한 접촉부는 Percoll 원심분리기를 통해 생화학적으로 입증되었으며 MAM으로 명명되었다.이 접합부가 미토콘드리아의 분열, 지질의 이동, 칼슘 signaling 등에 아주 중요한 역할을 함은 물론이며 자가포식소체 형성에도 필수적인 부분이다.autophagy-specific phosphatidylinositol 3-kinase complex의 구성성분인 Atg14L이 ER에 위치하며 자가포식소체 구조의 초기단계 역할을 수행한다.Atg14L은 안정된 상태에서는 ER 전체에 퍼져있지만 starvation stress를 통해 자가포식이 유도되어 puncta 구조로 변하여 자가포식소체를 형성하기 시작한다.또한, Atg14L은 MAM에 결집되어 있다.(Figure 5) Mitochondria-associated ER membrane complex (MAMs)electron micrograph (by Mariusz R Wieckowski)[4]Atg5는 isolation membrane을 합성하고 이동시키는 역할을 한다. Atg5 puncta는 다른 Atg와 마찬가지로 starvation 상태의ER-mitochondria 접합부에서 관찰가능하다.VDAC1(MAM maker)과 Atg5 puncta의 관찰을 통해 자가포식소체는 세포내 무작위적인 위치에서 형성되는 것이 아니라 MAM에서 형성됨을 확신할 수 있다.또다른 연구에서도 ER-mitochondria 접합부와 자가포식소체의 관련성을 확인 할 수 있었다.Atg14L과 DFCP1은 starva요한 반면 C-terminus는 BATS(Barkor autophagosome targeting sequence)를 통해 자가포식소체와의 결합에서 중요한 역할을 한다.최근 연구에서 새로운 SNARE 단백질이 자가포식소체 구조와 관련이 있음을 발견했다. Syntaxin17(Stx17)은 ER에 위치한 Qa-SNARE로 보고되었지만 그 기능은 알려지지 않았었다.Atg14L과 마찬가지로 Stx17은 fed condition 에서는 ER에 위치하지만 starvation stress 하에 puncta 구조로 변하며 이것은 ER-mitochondria 접합부에서 발견된다.ER-mitochondria 접합부가 파괴되면 더 이상 어떠한 위치적 변화도 나타나지 않는다.게다가 Atg14L과 Stx17은 starvation 상태에서 강하게 상호작용을 한다.Stx17이 사라지면 Atg14L은 ER-mitochondria 접합부에서 puncta 형태로 변하지 않는다.Stx17이 결여된 상태로 세포내 다른 위치에서 puncta 로 변형될 수 있지만 autophagy flux는 관찰되지 않으며 자가포식소체와 분리된 상태로 남아있게 된다.또한 autolysosome 이 발견되지 않는 것으로 보아 Stx17이 완전한 자가포식소체의 구조 형성에 필수적인 요소임을 알 수 있다.결과적으로 자가포식소체 구조의 형성에는ER-mitochondria 접합부가 필수적인 요소 이며 Stx17과 Atg14L의 결합이 Atg14L을 접합부로 유도하는 역할을 한다.다른 연구에서도 Stx17과 자가포식소체 구조의 연관성에 대한 보고가 있다.(Figure 6)[5]Stx17은 starvation 상태에서 자가포식소체로 이동하며 lysosome SNARE, VAMP8과 또 다른 SNARE(snap-29)와 상호작용하며 autolysosome 융합을 촉진한다.(Figure 5)Stx17이 결여된 세포에서는 자가포식소체가 autolysosome이 아닌 상태로 축적되며 이것은 세포내 분해과정이 불완전함을 의미한다.Stx1신한다.

자연과학| 2013.12.24| 7페이지| 1,000원| 조회(350)

autophagy, Autophagosome, 자가포식, 자가포식소체

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단백질 발색반응 및 정량

▷▶▷Protein의 발색 침전반응 및 정량◁◀◁◎ Material1% albumin (0.1g albumin + 10㎖ DW)1% casein (0.1g casein + 10㎖ ethanol)1% gelatin (0.1g gelatin + 10㎖ DW)1% peptone (0.1g peptone + 10㎖ DW)1% glycine (0.1g glycine + 10㎖ DW)D.W, 0.1% Ninhydrine solution0.1M Sodium carbonate, 0.1M Acetic acidsodium sulfatebeaker, test tube, hot plate, pH meterELISA, bradford solution, centrifugal separator, water bath◎ Principle√ Ninhydrine reaction의 원리Ninhydrine을 Amino acid의 solution에 가하면 보라색으로 변하는 발색반응이다. 즉, Ninhydrine을 Amino acid의 중성용액에 가하면 아미노기의 작용에 의해서 Ninhydrine 2분자가 축합하여 Amino acid의 종류에 따른 특유한 색을 나타낸다. 예를 들면, Histidine은 청색, Hydroxyproline은 오렌지색으로 변한다. 이 발색은 예민하여 50~100만분의 1정도의 감도를 나타내므로 Amino acid의 검출에 이용된다. Amino acid을 paper chromatography등으로 전개하고 0.3% Ninhydrine의 buthylalcohol solution을 분무하여 전 Amino acid을 검출 확인하는 방법이 흔히 쓰인다. 또, 비색정량에도 이용된다.Ninhydrine reaction은 α-아미노기를 가진 화합물이 나타내는 정색반응(β-, γ-는 정색반응이 불가능)이며 protein뿐만 아니라 유리아미노산, Amino acid로 구성된 펩타이드류, 그 이외에 아민의 Ninhydrine solution을 가한 후 중성에서 가열할 때 나타나는 보라색의 정에 따라 물질을 분리할 수 있다. 상등액은 크기와 밀도가 비교적 작은 물질로 구성되어 있고, 크기와 밀도가 비교적 큰 물질은 침전되어 있다.-회전 속도에 따라① 저속원심분리기(탁상용 원심분리기) : 6,000rpm(6,000g) 이하의 속도를 낼 수 있고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심분리에 이용된다.② 고속 원심분리기 : 최고속도가 20,000~25,000rpm(60,000g)으로 냉각장치를 갖추고 있다. 주로 세포, 핵, 세포내 소기관 등의 분리에 이용된다.③ 초원심 분리기 : 최대속도가 40,000~80,000rpm(600,000g)으로 냉각기와 진공장치를 갖추고 있으며, 세포내 소기관, 세포막 구성성분, 거대분자 등을 분리할 수 있다.- 비중이 다른 액체 상태를 분리할 때① 분리용 ： 원심침강기라고도 하며, 비중의 차를 이용하여 미립자 ·콜로이드 등의 분리에 사용한다. 이 기계는 매분 5,000∼1만 회전의 고속회전을 하며 우유의 탈지, 혈장의 분리 등에 응용된다.② 여과용 ： 원심여과기라고도 하며, 예로는 세탁기의 탈수기가 있다. 많은 작은 구멍이 있는 드럼 속에 젖은 의류를 넣어 고속 회전시키면 원심력에 의하여 수분이 작은 구멍을 통해 바깥으로 튕겨져 나온다. 설탕 결정의 분리, 쥬스 등의 액체를 맑고 깨끗하게 하는 데 이용된다.- 원심분리기 사용 시 주의할 점원심분리기는 매우 큰 원심력을 갖고 있기 때문에 잘못된 조작이 허용되지 않는다.① 기종마다 설정되어 있는 최고 회전수를 절대로 넘어서는 안 된다.② speed control용 손잡이는 서서히 조작해야 되며, 설정회전수에 도달하면 정지하고, 약 1분정도(고속인 경우는 5분 이상) 방치하여 그 회전수가 기계의 정격회전수를 넘지 않는 것을 확인해야 한다.③ 침전관은 rotor의 중심에 대하여 좌우 대칭의 위치에 정확히 고정해야한다.④ 금속관 속에는 규정의 유리관, 플라스틱관, stainless steel tube 이외는 사용 안한다.⑤ Floor cabinet type용 buc이상의 펩티드 결합을 화합물도 마찬가지로 유사한 착화합물을 만들며 단백질의 경우에는 청자색 또는 적자색을 나타낸다. 이 원리를 이용하여 단백질을 정량한다. 보통 이 방법으로는 약 1~10mg의 단백질을 정량할 수 있지만, 미량 뷰렛법은 약 0.25~2.0mg까지 정량할 수 있는 감도를 가진다. 착화합물의 색은 1~2시간동안은 안정하지만, 그 이상의 시간에서는 점점 색도가 증가한다.- Lowry법Lowry등이 고안한 이 단백질 정량분석법은 용액에 있는 단백질뿐 아니라 건조된 시료에도 이용될 수 있다. 특히 이 정량방법은 5ug/ml정도의 단백질 양을 정량할 수 있는 대단히 민감한 방법이어서 널리 쓰이고 있다. 이 Lowry 방법에서 사용하는Folin-Ciocalteau시약에 의한 발색은 뷰렛 시험에서와 마찬가지로 단백질과 알칼리성 구리와의 반응과 포스포몰리브덴산-포스포텅스텐산 염들이 단백질에 있는 티로신과 트립토판 들에 의한 환원반응으로 생긴다. 이 두 아미노산의 함량은 단백질의 종류에 따라서 상당히 다르므로 1mg의 단백질에 대한 색의 세기가 일정하지가 않다. 표준곡선을 결정하는 데 사용한 단백질이 나타내는 색의 세기와 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 단백질을 정제하는 과정에 있어서 단백질의 함량변화를 측정하는 데는 매우 유용한 방법이다.- BCA법(BCA 단백질 assay방법)Bicinchoninic acid에서 나온 말이다. Pierce방식이라고도 한다. 샘플 내에 있는 단백질 양을 측정하고자 할 때 쓰이는 것으로서, 단백질이 구리 이온(Cu 2+, Cu 1+)을 환원 (Reduction) 시킬 수 있는 성질을 이용합니다. 이 반응은 2step으로 일어난다.1. protein + Cu2+ + OH- → Cu+2. Cu+ + 2BCA → Cu+/BCA chromophore (562nm)단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서, 보라빛의 화합물을 생성하게 됩니다. 이 화합물은 빛의 특정 영역(562nm)에서 구리 이온이 담긴 용액 -N=N-, -NH-NH-, -NHNH2, pyridine 등의 질소이다. 이들 질소도 페놀산을 넣어 분해하거나 NO3―, NO2, NO 등을 미리 환원한 후에는 Kjeldahl법으로 측정할 수는 있으나 보통 식품의 질소 정량목적이 단백질의 산출에 있으므로 이와 같은 특별처리는 하지 않는다.*Macro-Kjeldahl법 : 검체를 Kjeldahl분해병 내에서 분해제로 c-H2SO4와 발연황산의 혼액을 사용하고 분해보조제로 Hg（또는 HgO） 및 K2SO4를 사용하여 완전히 분해한다.- 전기영동법전기영동은 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다.이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다.따라서, 어떤 용액에서의 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결정된다. 그러므로 전기영동법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질들과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단으로 이용된다.- BSA(Bovine serum albumin)bovine은 소를 의미하고 serum은 혈청 ( 혈액의 액체 성분), albumin은 혈청에 녹아있는 단백질의 한 종류이다. -(소혈청알부민)이 단백질을 정제해서 용액 속에 녹인 것이 BSA 용액으로 보통 단백질의 농도를 알고 싶을 때 standard 로 사용한다.분자량은 약 66.4 kDa 정도 되는 단백질로써 대부분의 동물에 많이 존재하는 단백질이다.대부분의 단백질이 그러하듯 분자량이 매우 큰(66400 g/mol) 화합물이라 구조식은 매우 복잡하고 보통 3D structure 로 전체적인 모양을 보여지게 된다. BSA의 용도로는 생화학/생물학에서 세포 배양시에 세포의 영양분으로써 첨가해주는 경우도 있고, 또한 단백질의 정량에서 검정곡선을 얻기 위한 표준물로도 많이 쓰이며 제한효소를 사용할 때 적은양의 효소(단백질)를 사용해야 하므로 용액내otein에 존재하는 arginine, tryptophan, tyrosin, histidine, phenylalanine residue와 bind하면서 나타나는 흡광도 변화를 측정하는 원리이다. CBBG는 protein에 bind하고 있지 않을 때는 cationic form을 하고 있으며 470nm light에 대한 흡광도가 제일 높지만, protein에 bind하고 있을 때는 anionic form을 하고 있으며 595 nm light에 대한 흡광도가 제일 높다. 따라서 spectrophotometer에서 595nm light에 대한 흡광도를 측정하는 방법을 이용하여 protein 농도를 결정한다. 빠르고 비용이 적게 들며, protein에 specific하고 sensitive하다는 장점이 있다. Dye와 protein의 complex가 1시간 정도 stable하게 존재한다. 측정하고자 하는 sample의 수가 적을 때 많이 사용하며 부분적으로 겹치는 것을 감안하여 standard curve를 반드시 작성해야 하며, curve가 넓은 범위에서 linear하지 않다. 또한 arginine이 다른 residue에 비해 훨씬 더 많은 빛을 흡수한다. 그래서 arginine rich protein 농도 측정시 arginine rich control protein을 사용하여야 한다.◎ Method- Ninhydrine reaction1) 실험에 필요한 protein을 조제한다.protein의 조제1% albuminalbumin 0.1g / DW10㎖1% caseincasein 0.1g / ethanol10㎖(insoluble)1% peptonepeptone 0.1g / DW10㎖1% gelatingelatin 0.1g / DW10㎖1% glycineglycine 0.1 / DW10㎖* casein의 경우 물에 녹지 않아 ethanol에 녹였다.ethanol의 휘발성 때문에 pH측정이 어렵다.2) 각 protein의 pH를 측정하고 pH7로 맞춘다.0.1M Acetic다.

자연과학| 2009.07.09| 12페이지| 1,000원| 조회(1,087)

생화학, 단백질 정량, 원리, 아미노기, 침전반응

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