Patch Clamp Techniquespatch clamp 기술은 세포의 전기적 활동을 연구하는데 유용한 기술로 single 혹은 multiple channel을 연구하는데 사용된다. 이 기술은 생물학적 membrane의 ion channel을 분리하기 위한 노력에서 비롯되었다. 1970년대 초반에 integral membrane protein의 신경과 근육에서의 electrical signaling에 관여하는 것이 밝혀졌다. 그리고 artificial lipid membrane 연구에서 bacteria에서 추출한 특정 protein이 membrane conductance에 steplike change를 일으킨다는 것이 밝혀졌다. 이 protein은 각각의 channel-like structure를 가진 pore의 열림과 닫힘에 관여하고 이러한 것들이 일련의 전기적 변화를 일으키는데 관여하였다. 그래서 국지적인 전기적인 변화를 관찰하기 위해 patch ( membrane 표면의 작은 부분 ) 을 isolation하기 위한 시도가 이루어졌다. glass micropipette을 voltage-clamped cell의 표면에 위치시킴으로써 수행되었다.pipette glass의 다양한 크기, 형태, surface charge, hydropathy seal resistance를 특정 이상 향상시키는 것이 불가능한 것처럼 보였다. 그러나 enzymatic cleaning 과정과 pipette의 geometry를 optimizing하여 해결하였다. 기존 seal formation의 원리를 이용하여 새로운 개념으로 방법을 개선한 것이라고 볼 수 있다.골격근 세포막(결체조직은 효소로서 제거한 다음)에 끝이 1μm 가량되는 매끄러운 유리전극을 붙이고 기계적으로 압박을 가하였다. 유리전극 속은 정상 extracellular fluid와유사한 조성을 가진 전해질 용액으로 채우고 금속선을 전극 속 전해질 용액에 접촉시켜 회로가 성립되게 하였다. 이런 실험 조건에서 전극내에 acetylcholine이 존재하면 noise 비슷한 이온 통로 활동을 기록할 수 있었다. 그러나 이 당시에는 잡파와 신호의 구분이 완전하지 못하였었다. 그러다가 1980년 Neher는 유리전극 속으로 약한 negative pressure을 가하면 전극과 세포막 사이의 seal이 크게 향상되는 것을 발견하였다. 이 발견의 의미는 전극내부와 외부 사이의 절연도가 아주 커져서 잡파를 크게 줄여 기존방법으로는 상상조차 할 수 없었던 세포막을 통한 작은 이온의 이동을 기록할 수 있게 되었다는데 있다. 이러한 방법이 성공하므로써 Neher, Sakmann을 비롯한 많은 학자들이 patch clamp 방법을 사용하여 여러 종류의 세포에서 이온통로를 연구하게 되었다Cell-attached configuration은 연구대상 이온통로의 작용 및 기능이 세포내의 어떤 factor를 필요로 할 때 사용할 수 있는 방법이다. 이 방법은 이온통로를 보다 생리적인 환경하에 두는데 의미가 있다. 그러나 세포의 실제 안정막 전압을 정확히 알 수 없고, 세포막 안팎 용액조성을 마음대로 바꿀 수 없는 단점을 갖고 있다.Inside-out configuration은 membrane patch의 cytosolic part를 마음대로 조절할 수 있는 장점을 갖고 있다. 이 방법은 cell-attached configuration과는 반대로 세포내 cytosolic factor를 필요로 하는 이온통로를 연구하기에는 적합하지 않다.Outside-out configuration은 membrane patch의 extracellular side를 마음대로 조절하는데 적합한 방법이다. 따라서 수용체에 의해 개폐되는 이온통로를 연구하는데 주로 쓰이고 있다. 그러나 outside-out configuration은 cell-attached configuration후에 whole-cell을 만든 다음 patch excision을 하는 만큼 안정적인 기록을 얻기는 매우 힘들다.
Influenza Virus그림 . Influenza그림 . Virus Replicationvirion이 숙주의 상피세포 표면에 있는 sialic acid sugar에 hemmagglutitin을 이용하여 붙는다. 그리고는 receptor에 의한 endocytosis를 통해 세포질로 들어간다.cellular trypsin-like enzyme이 HA를 HA1과 HA2로 분해한다. HA2는 virus 외피와 endosome 막의 융합을 일으킨다. virus 외피 단백질 M2는 이온 채널로 작동하여 virion의 내부를 더 산성화 시킨다. 그 결과 virus 외피 단백질 M1은 nucleocapsid로부터 분리된다. vRNA는 NP와 세포 수송 기관들의 상호작용을 통해 핵으로 이동하게 된다.핵에서 viral polymerase 복합체가 전사되고 vRNA가 복제된다. 새롭게 합성된 mRNA는 세포질로 이동하고 번역된다.vRNA는 핵에 남아있거나 세포질로 이동하여 번역된다.새롭게 합성된 viral 단백질은 골지체를 통해 세포 표면으로 분비 되던가 vRNA와 결합하여 핵으로 이동한다. 또한 새로운 viral genome particle을 형성하기도 한다. 다른 viral 단백질은 숙주에서 cellular mRNA의 분해, vRNA 합성을 위한 nucleotide의 방출, 숙주 세포의 mRNA의 번역을 저해시키는 등의 다양한 작용들을 한다.새로운 virus의 genome을 구성하는 Negative-sense vRNA와 다른 viral 단백질은 서로 결합한다. Hemagglutinin와 neuraminidase은 세포막의 bulge에 뭉쳐있다. vRNA와 viral 핵심 단백질은 핵을 떠나 세포막의 이 돌출부로 들어간다.성숙한 virus는 숙주의 인지질막 으로부터 발아한다.virus는 hemagglutinin을 통해 세포에 부착한다. 성숙한 virus는 neuraminidase을 이용하여 sialic acid residues을 끊어 숙주로부터 떨어진다. 이렇게 새로운 influenza viruse가 방출되고 나면 숙주 세포는 죽게 된다.그림 . Hemagglutinin그림 . Neuraminidase Ribbon Diagram▣ HemagglutininHA는 세포 수용체의 sialic acid에 부착하여 목표 cell의 인식을 가능하게 한다. 또한 숙주의 membrane과 viral membrane을 융합을 일으켜 viral genome의 숙주 내로의 유입을 가능하게 한다.HA는 목표 세포의 표면에 있는 단당류 sialic acid에 결합한다. 이것은 virus가 세포 표면에 부착 가능하게 해준다.virus는 세포막으로 둘러싸인 endosome을 형성하게 된다. 세포는 endosome 내부를 산성화 시키고 lysosome을 안으로 수송해 소화시키기 시작한다. 곧 endosome 내부의 PH는 약 6.0 정도로 떨어지고 원래 접혀있던 HA 분자는 불안정해져서 일부분이 접혔던 것이 풀리기 된다. 따라서 접혀져서 가려져 있던 단백질의 매우 소수성 부분이 드러나게 된다."fusion peptide"라 불리는 이러한 과정을 통해 분자 갈고리처럼 작용하여 endosome의 membrane에 부착하게 된다. 나머지 HA분자 또한 새로운 구조(낮은 pH에서 더 안정한 구조) 로 변하여 endosomal membrane을 virus의 membrane으로 끌어당기게 된다. 그리고 두 개의 membrane이 서로 융합되게 된다. 이러한 과정을 통해 virus 물질들이 숙주의 세포질내로 자유롭게 들어갈 수 있게 된다.
Patch Clamp Techniques
단백질, 인플루엔자, 세포질, H1N1, Influenza Viru
