【별표 1】 자 기 소 개 서 성 명 한 글 수험번호 한 자 생년월일 학 력 20년 월 20년 월 20년 월 년 월 일 대학교(대학원) 학부?학과, 전공 졸업(예정) 1. 의학전문대학원에 지원하게 된 동기와 부산대학교 의학전문대학원을 선택하게 된 이유를 기술하시오. 부모나 친인척의 직장 등에 관한 구체적인 기술은 금지함. 1. 지원동기 가. 성장과정 및 가치관 - 중학교 시절 정든 고향을 떠나 낯선 외국에서의 생활을 시작하였고, 그곳 사람들은 언어 및 문화에 적응하지 못하는 동양인을 배척하지 않고 관심과 사랑으로 대해 주었기에 사랑 받음이 무엇인지 알게 되었음 - 언어에 익숙해질 무렵 병원 현장 체험 및 봉사활동을 하게 되었는데, 이러한 활동을 통해서 사람으로써 다른 사람에게 사랑을 전하는 것이 큰 기쁨을 준다는 것을 깨달았음 나. 생명과학에서 의학으로 - 학부에서 생명과학을 배우는 동안 생체 현상 원인 규명, 질환과의 관계, 연구기법, 치료법 등에 관심이 많았으나, 생명과학만을 공부하는것 만으로는 부족하다는 생각을 하게 되었음 - 특히, *** 의료봉사를 통해 한명의 의사가 수많은 사람들의 생명을 구하는 모습을 보게 되면서 병을 배우는 것을 넘어 실제로 치료하고 싶다는 마음을 가지게 되었음 - 4년간 배운 생명과학을 기초로 의학을 배우게 되어 소외된 사람들에게 새 생명을 불어넣어주고 싶은 마음에 의학전문대학원에 진학하고자 마음먹었음 2. 부산대학교 의학전문대학원 지원 사유 가. 부산대학교의 이념 -“세상을 행복하게 함으로써 내가 행복해지는 의료인력 양성”을 목표로 하는 이념이 남을 위해 능력을 사용할 때에 행복을 느끼는 나 자신의 가치관과 부합하였음 나. 비전 - 국내 유일 종합의료단지가 있어 미래성과 발전 가능성이 높아 졸업 후 전공을 정하여 수련 할 수 있는 시설이 마련되어 있음 - 부산지역암센터를 가진 암 치료의 허브를 가지고 있어 향후 암을 연구하며 암으로 고통 받는 이들을 도울 수 있을 것으로 생각됨 - 다양한 해외 연수 기회를 통해 개인의 견문을 넓혀 발전시킴으로써 대한민국 의료의 우수성을 알리고 있음 성 명 수험번호 2. 의학전문대학원에 지원하기 위해 어떤 준비와 활동을 하였는지 기술하고, 또한 그러한 과정에서 지원자의 인생에 변화가 생겼다면 무엇인지 설명하시오. 1. 봉사활동 가. **** ***** Activenture 봉사활동 (20xx.x월) - 활동내역: 정신지체아동(자폐증, 소아마비 등) 수학여행간 생활 및 안전 보조활동 - 느낀점: 단기적인 도움보다 병의 근원 치료의 필요성을 느낌 나. 회복병동 보조 및 노인 요양원 봉사활동 (200x.x월) - 활동내역: 회복병동내의 고름과 혈흔 등의 정화 활동 및 노인 요양원에서의 식사 보조활동 - 느낀점: 작은 배려와 말벗에도 고마워하시는 분들을 보며, 사람을 치료함에 있어 정서적인 면도 중요하다고 느낌 다. *** 의료봉사 - 활동내역: *** 내전 피난민들을 돕는 아시아 협력기구(IACD) 의사들의 의료 활동 보조 - 느낀점: 해외 의료봉사를 함으로써 국경과 이념을 초월해 사람의 생명이 무엇보다 중요하다는 것을 몸소 깨달았으며, 의료활동으로 수많은 소중한 생명을 구할수 있다는 것을 실감하며 그 어느 때보다 의사로써의 소명이 확고해짐 2. 사회 경험 가. ******* 가이드 - 활동내역: 통역 가이드로써 설명 및 안내 활동 - 느낀점: 여러 나라의 다양한 사람들을 만나며 소통의 중요성을 깨달았으며, 팀단위 생활로 인해 배려와 이해를 배우게 되었음 나. 사회적 취약계층을 위한 회사 ******* - 활동내역: 초기 멤버로써 번역에서 기획 등 업무 총괄 - 느낀점: 작은 회사안에서 여러 사람들과 함께 일함으로써 책임감과 팀워크를 배양함 3. 교외 활동 가. 병원 현장경험 - 활동내역: 지역 병원에서의 현장 견학 및 보조활동 - 느낀점: 의사 선생님이 항상 환자 중심으로 환자를 대하는 것을 보고, 환자의 눈높이에서 설명하고 치료하는 것의 중요성을 배움 나. 인터넷 강의 - 활동내역: Open University 제공 Molecules, medicines and drugs 온라인 강좌 수료 다. 논문 연구 학회 - 활동내역: 다양한 논문 발표 및 토론 - 느낀점: 하나의 질병에 대해 수많은 연구가 이루어지고 논문이 나오듯이 현재에 안주하지 말고 항상 새로운 것에 대한 배움의 자세를 가지며 한발 더 나아갈 수 있는 노력이 필요하다는 것을 깨달음 성 명 수험번호 3. 의학전문대학원 졸업 후 어떤 분야에 종사하고 싶은 지를 기술하고, 그것을 이루기 위한 지원자의 계획을 구체적으로 설명하시오. 1. 졸업 후 종사 분야 일반외과의사가 되고 싶습니다. 죽어가는 사람의 생명을 제 두 손으로 치료하여 의사의 소명인 생명 살리는 일에 직접적인 기여가 가능하기 때문입니다. 개인의 노력에 따라 치료효과 가장 가시화 되는 외과에서 느끼는 보람이 클 것이라고 생각합니다. 2. 계획 가. 전공 학습 - 학기 중 우선순위를 학업에 두어 부족한 전공지식 습득을 위해 정진할 것이며, 배움을 나누는 것이 학습효율을 높여주기 때문에 스터디 그룹에 적극 참여할 예정으로, 서로의 약점을 보완하며 전공지식 습득에 주력하겠음 나. 교내 활동 - 선배들과 교수님들과의 교류에 적극 참여함으로써 - 해외 연수에 참여 하여 외국의 의료시스템 및 새로운 지식습득을 - 외과를 진로로 선택한 만큼 교수님들과 외과를 전공하는 선배들을 만나 조언을 구할 것입니다 - 의학전문대학원 4년간 최대한 많은 임상실습기회를 얻기 위해 기회가 있을 때 마다 학생인턴에 지원할 것입니다. 국내 최초의 의학시뮬레이션 센터를 백분 활용하여 의사 국가고시 OSCE와 CPX등의 실기 시험 준비에 최선을 다할 것입니다. 졸업 후 의사 국가고시에 합격하고, 인턴 과정을 거쳐 외과 전공의 과정을 거쳐 전문의 시험을 통과하여 외과 전문의가 되고 싶습니다. 만약 세부전문의가 필요하다면 세부 전문의 과정 까지 할 것입니다. 그리고 펠로우를 하여 교수직에 도전해보고 싶습니다. 부산대학교에서 계속 연구를 하고 실력을 쌓아 한 분야에서 최고가 되고 싶습니다. 또한 배운 것을 나누고 싶기에 전문의가 되어서는 임상과 연구를 병행하며 제가 배운 지식을 학생들에게 전하는 것이 목표입니다. 제가 받은 혜택과 은혜를 잊지 않고 꾸준히 받은 축복들을 지역사회의 어려운 이들에게 나눠주고 싶습니다. ‘***’등의 동아리가 참여하는 하계의료봉사에 참여해 지속적인 봉사활동을 하고 싶습니다. 아직 구체적이지 않지만, 의학전문대학원 4년 과정 동안 이 꿈을 더 구체화하고 다듬어나가고 싶습니다. 성 명 수험번호 4. 수상 및 표창 실적(학부시절 및 그 이후의 것만 기술, 총장, 도지사 및 시장, 장관급 이상의 수상에 한함.) 그리고 주요 자격증(장관급 이상이 인정하는 국가자격증에 한함.)이 있으면 기재하시오. (모든 서류는 원본 제시 후 사본 첨부) 1. 수상 및 표창 가. *****대학원 주최 외국어 스피치 대회 영어부분 금상 (20xx. x) 나. ****** 감사장 ? ** 환경부 장관 수상 (20xx. x) 5. 자신을 잘 설명할 수 있는 단어 3개를 열거하고, 그 이유를 기술하시오. 1. 이성적 어느 상황이던지 감정에 크게 휘둘리지 않고 침착하게, 한발자국 뒤에서 판단을 내립니다. 말 한마디 못하던 **에서는 자기표현을 할 수 없었습니다. 처음에는 답답했지만 곧 한걸음 물러서서 생각하는 습관이 들었습니다. 말을 할 때 한번 생각한 다음 하고, 경청하는 자세를 배웠습니다. 또한 본의 아니게 인내심이 길러지는 경험이기도 하였습니다. 남들 보다 뒤쳐져있는 상황에서 제 상황을 분석하고, 선택을 내려 조금씩 거리를 좁히는 연습을 했습니다. 유색인종 관용이 미숙한 지역에 살면서 차별받기 싫어 남들보다 배로 더 열심히 일하며 일을 깔끔하게 처리했습니다. 경제적 및 제도적 여건으로 입학은 못했지만, 주어진 상황을 분석하고 판단하는 능력이 신앙이라는 신념과 인내심으로 뒷받침된 성장기는 *******대 생화학과 합격을 통해 능력을 인정받았습니다. 2. 이타심 제가 세상과 사회에 얼마나 쓸모 있는 사람인가 고민합니다. **에서는 나이와 능력의 제한으로 봉사활동을 하였습니다. 지체장애아들과 요양병원의 환자들을 돌보며 사회약자를 위해 일함에 보람을 느꼈습니다. 한국으로 대학입학 후 제 능력을 남들을 위해 활용해야겠다는 생각이 강해졌습니다. 자신 있는 부분이 영어이다 보니 통, 번역쪽으로 재능기부를 했습니다. *****에서 논문 초록 번역, 구립 도서관에서 **생활 조언자로 재능 기부, 교회 청소년부 영어 교실 교사를 했고 더 잘하기 위해 테솔 자격증도 스스로 공부해 취득했습니다. 제 능력이 필요한곳에서 사람들을 위해 사용됨이 기뻤습니다. 3. 도전 **생활, **병 지원근무, **. 도전이라 생각되는 것들에서 도망치지 않고 맞부딪혔습니다. 인생은 로켓이라고 생각합니다. 끊임없이 올라가다가 주변환경에 만족하여 추진력을 잃는 순간 떨어지기 때문입니다. 인간은 완벽하지 않지만 완벽을 향해 도전하는 것이 인간다움이라 생각합니다. 그래서 더 배우고 더 나은 사람이 되기 위해 도전하고 자기 자신을 밀어 붙여왔습니다. 이제 다시 한 번 더 의사의 문을 두드리며 도전합니다. 부산대학교 의학전문대학원의 자랑스러운 학생이 되겠습니다. 감사합니다. ※ 글씨체: 굴림체, 크기: 11 point(검정색), 줄간격: 160%, 분량은 제공된 페이지 내에서 개조식으로 기술.
Michaelis Menten Equation xxx xxx This is Michaelis Menten equation. The velocity, V1, of a reaction, is equal to the maximum velocity that is possible to obtain, times the substrate concentration, over kM, the Michaelis Menten constant, plus substrate concentration. Start with the reaction rate of the reaction: A+B P To find out how fast P is being formed, then reaction rate equation is needed. Another way to say the velocity of P formation is: V= d[P]/dt = k [A][B] ‘The change in the concentration of P over the change in time’ is equal to ‘Rate constant k, times concentration of A, times concentration of B’ Where . Rate constant k, has within it, the amount of activation energy that’s needed for above reaction to start. So within the k term, there’s activation energy. This is enzyme substrate reaction. On the left side, the reaction starts with enzyme and substrate. Then they form Enzyme substrate complex called ES. From ES, there are two ways. The common way is to go back and regresver, on rare occasion, the ES can go forward and form the product (P) and reform into enzyme (E). Each one of these steps have rate constant. Going to E + S to ES has k1, from ES to E + S has k-1, and from ES to E + P has k2. The velocity of the reaction, finding out how fast the product (P) is being formed is what matters. Because the P is the end product. Therefore finding out V0 = d[P]/dt is needed. From the precursor ES, there is reaction constant k2, so k2 times the concentration of [ES] will give the rate of P formation. Combining these two gives us V0 = d[P]/dt = k2[ES] Michaelis Menten equation looks at: what changes the concentration of ES? Since whatever changes the concentration of ES is going to lead to the change in the concentration of P, because the formula ‘k2[ES]’. Therefore this formula can be made: d[ES]/dt Since if change in ES over change in time is found, it is possible to find out d[P]/dt. Therefore all the reactions which synthesize ES or does the opposite need creating ES. So give this positive sign and it can be written down as: k1[E][S] Going away from ES, There is reaction: ES E + S, and reaction: ES P + E. These need to have minus sign since they are going away from ES. These can be written down as: –k-1[ES] and –k2[ES] Add them all together: d[ES]/dt = k1[E][S] –k-1[ES] –k2[ES] An assumption needs to be made here that k-1 is much larger than k2. So in majority of time, ES formed from E+S just simply goes back to E+S since k-1 is much greater than k2. Therefore from this assumption, it can be said that ‘d[ES]/dt = 0’ (Not in real life, but this assumption helps with easier calculation) The formula ‘d[ES]/dt = 0’ can be said because if the reaction is going in circle from E+S to ES, and then ES to E+S and so on, then the concentration of ES isn’t really changing. The formula signifies that the concentration of ES is not going to change over change in time. So if d[ES]/dt = 0, then: 0= k1[E][S] –k-1[ES] –k2[ES], rearrange this: k1[E][S] =e in concentration of ES over time affects the concentration of P over time, the above equation can be solved for the concentration of ES: The rate constants (k1, k-1, k2) are quite cumbersome, so Michaelis and Menten did was to come up with a constant to replace these three constant. Here’s Michaelis Menten constant Km: The rate constants are inversed. Therefore when Km is substituted to the equation , Km needs to be in place of denominator, giving the equation: The next thing to do is to get rid of the term [E] in the above equation. Get rid of E by: [ET] = [E] + [ES] The formula means that the enzyme total equals amount of free enzyme plus the amount of enzyme substrate concentration. Rearrange this to solve for [E] in order to substitute in to the equation: , [E]=[ET] – [ES] Substituting gives: However, now [ES] is in both sides of the equation. giving the equation: minator. ator. these three constant.S ntration of P over time, ime. and so on, then the co Rearranging once again to the equation gives: Earlier, there was an equation: v= k2[ES] Therefore it is possible to substitute into v= k2[ES] Which gives: Michaelis Menten equation considers the maximum velocity that’s possible to obtain. This can be done by thinking what can make the reaction velocity to go faster? It can be done by adding more substrate. Therefore if infinite amount of substrate is added to the equation: , then the result would be vmax = k2[ET] Substitute this in to the equation: , This would give: This is the Michaelis Menten equation. Reference Hyperlink "http://themedicalbiochemistrypage.org/enzyme-kinetics.php" http://themedicalbiochemistrypage.org/enzyme-kinetics.php Hyperlink "http://en.wikipedia.org/wiki/Michaelis%E2%80%93Menten_kinetics" http://en.wikipedia.org/wiki/Michaelis%E2%80%93Menten_kinetics Hyperlink "http://www.bgu.ac.il/~aflaloc/BioHTML/Goodies/DeriveMMEqn.html" http://www.bgu.ac.il/~aflaloc/BioHTML/Goodies/DeriveMMEqn.html Lehninger Principles Of Biochemistry, 5th edition,
Competent cell (수용세포) 만들기Principle이 실험은 transformation을 위해 Escherichia coli 가 다른 DNA를 잘 받아들일 수 있는 상태인 competent cell을 만드는 실험이다. 일반적 환경에선 대부분의 박테리아가 외부 DNA를 잘 받아들이지 않기 때문에 물리적, 화학적 처리를 해준다. 즉, 숙주세포가 외부 DNA (여기선 plasmid DNA)를 받아들일 수 있는 상태의 세포를 만들기 위함이다. 대장균의 세포막 및 세포벽에는 세포막과 세포벽을 연결하는 channel들이 있는데 이곳을 통해서 DNA 분자들이 세포 안으로 들어간다. 수용세포를 만드는 시험의 많은 단계가 차가운 상태에서 진행 되는데, 이는 영하에 가까운 (또는 영하의) 상태에서는 세포막이 얼어 있기 때문에 세포막의 여러 구조들이 (특히나 pores들이) 안정화 되어 있을 수 있기 때문이다.Apparatus피펫얼음37도 shaking incubatorTable top centrifuge시험관e-tubeReagentsLB broth: competent cell이 될 E. coli 를 우선 배양해주기 위해서. LB (Luria-Bertani) 배지는 undefined medium이다. 즉, 정확히 무엇이 얼마나 들었는지 모른다는 것이다. 이는 trypton과 효모 추출물 때문에 그런데, 질소, 당분, 무기질, 유기질 등의 여러 영양소를 공급한다. 덕분에 다른 추가물을 넣을 필요가 없다. 박테리아가 완벽히 통제된 상황에서 자라야 한다면 M9같은 defined media (배지의 구성요소와 양을 다 앎)을 쓰겠지만 이 실험에선 DNA source나 DNA를 받아들일 숙주로 쓰이기 때문에 LB broth 같은 complex, undefined medium이 더 알맞다.Ice cold MgCl2-CaCl2 (80mM MgCl2, 20mM CaCl2): 차가운 상태의 MgCl2-CaCl2는 세포벽이 플라즈미드 DNA에게 침투되게 해주는 역할을 한다. 정확히는 M.5ml를 e-tube 3개에 각각 옮겨 담은 후 10분간 얼음에 보관한다. 얼음에 보관하는 이유는 차가워야 세포막이 안정화 되고 이온화가 골고루 일어나기 때문이다.5. 13,000rpm, 4oC에서 10분간 centrifuge를 돌린다.6. 상층액을 버린 다음 티슈위에 e-tube를 올려서 1분간 말린다. 이때, 피펫을 사용하지 않는데 pellet이 너무 말라버리면 좋지 않기 때문이다.7. 차가운 상태의 MgCl2-CaCl2을 1.2ml 만큼 pellet이 들어있는 e-tube안에 넣어 주고 pipetting으로 잘 섞어준다.8. 13,000rpm, 4oC에서 10분간 centrifuge를 돌린다.9. 상층액을 다시 버리고 이때 pellet이 같이 버려지지 않도록 주의한다. 뒤집어서 1분간 말린다.10. 100ul의 차가운 상태의 CaCl2을 넣고 pipetting으로 섞어준다.11. 얼음에 e-tube를 보관한다.Discussion실험이 차가운 상태에서 진행되었다. 균체가 얼거나 배지 안의 수분이 얼면 부피가 팽창함으로 세포가 파괴될 수 있다. 때문에 제대로 된 competent cell이 안 만들어 졌을 수가 있다.Pipetting을 잘 해주지 않아서 pellet 덩어리가 그대로 e-tube 하단에 붙어 있는 상태에서 MgCl2-CaCl2나 CaCl2와 섞었을 수도 있다. 즉, 제대로 잘 안 섞였을 수도 있다.Heat shock를 이용한 TransformationPrincipleHeat shock는 competent cell과 플라즈미드를 섞은 용액에 잠깐 동안 비교적 높은 온도 (42도)로 열을 가하여 세포안과 새포 외에 온도차를 만들어서 플라즈미드 DNA가 세포 안으로 빨려 들어가게 도와주는 절차이다.Heat shock는 CaCl2로 처리된 세포막을 강하게 depolarize한다. Membrane potential이 낮아짐에 따라, 세포 안의 negativity가 낮아져서 negative charge인 플라즈미드 DNA가 세포안으로 들어갈 수 있게 한맞춰둔다.2. 23ul의 competent 박테리아와 4ul의 ligased plasmid DNA를 e-tube에 넣어 섞어준 뒤 얼음에 30분관 보관한다. Positive Control을 위하여 23ul competent 박테리아와 4ul inserted plasmid를 넣은 e-tube또한 만들어 얼음에 30분관 보관한다.3. 두개의 e-tube를 틀이 끼워 42도 heat block에 90초간 넣는다.4. e-tube를 heat block에서 빼낸 후 얼음에 1~2분간 넣어 식혀준다.5. e-tube에 100ul의 LB broth 를 넣어준다.6. Water bath를 37도로 맞춰 좋고 e-tube를 45분 동안 incubation 시킨다. 이 과정을 통해 박테리아 세포가 recover하게 할 기회를 준다.Discussion온도와 시간 측정의 정확성이 중요했지만 e-tub등을 실험실 안에서 옮기면서 시간과 온도의 차이가 발생 했고, 이로 인해 세포가 완전히 통제 되지 않았고 stress를 더 받았을 수도 있다.LB agar plate (containing 100g/ml of ampicillin)에 spreadingPrincipleHeat shock transformation 과정을 마치면 ligased plasmid를 가진 박테리아와 inserted plasmid를 가진 박테리아를 얻는데, 모든 박테리아가 plasmid를 받아들인 것이 아니기 때문에 plasmid를 받아들인 박테리아만 고르는 작업을 하기 위해 이 실험을 한다. 만약 ligased plasmid가 제대로 벡터에 ampicillin 내성 유전자가 ligased 되었다면, inserted plasmid와 ligased plasmid 둘다 ampicillin에 내성을 가지고 있어야 한다. 그래서 ampicillin이 포함된 LB agar plate에 ligased plasmid를 가진 박테리아와 inserted plasmid를 가진 박테리아를 접종해 주고 배양시키면, plasmid를 받아들여 d plasmid, competent cell + ligased plasmid, competent cell을 각각의 plate 위에 뿌려주고, spreader 를 사용하여 agar에 흡수 되도록 고루 spreading해준다.2. 1개의 LB agar plate (Ampicillin 불포함)에 competent cell 80ul을 spreading 해준다.3. incubator에서 37도로 하루 배양한다.ResultDiscussion만약 ligased plasmid를 만들 때 벡터에 ampicillin 내성 유전자가 잘 들어 갔고, competent cell이 잘 만들어져서 이 plasmid가 competent cell에 heat shock transformation을 통해 들어갔다면, ampicillin이 포함된 LB agar plate에 spreading 되었을 때 콜로니가 나타나야 정상일 것이다. Inserted plasmid는 원래 plasmid에 ampicillin 내성 유전자가 있었으니 heat shock transformation에 의해 inserted plasmid가 competent cell에 들어가지기만 했다면 ampicillin 포함 LB broth agar plate에서 잘 자라날 것이고, control로 사용한 competent cell은 ampicillin 내성 유전자를 가지고 있지 않기 때문에 competent cell 만드는 과정이나 heat shock transformation에 문제가 없었다면 ampicillin 불포함 LB agar 에서 잘 자라고, ampicillin포함 LB agar에서는 자라나지 못했을 것이다.하지만 위의 결과에서도 볼 수 있듯이, ligased plasmid를 heat shock 로 transform한 박테리아가 ampicillin포함 LB agar에서 전혀 자라지 못했다는 것을 발견할 수 있다. 이에는 두가지 이유가 있을 수 있는데, 하나는 ligased plasmid를 박테리아가 받아들이지 않았다는 것 없는, 즉, 박테리아들이 플라즈미드를 받아 들이는 과정에는 문제가 없었음을 의미하기 때문이다. 또한 플라즈미드는 섞지 않고, competent cell 만 배양한 agar를 보면, 예상 대로 ampicillin이 들어간 배지에는 자라지 않았고, ampicillin이 없는 배지에만 자랐는데 (colony를 셀수 있는 정도가 아닌, 배지를 덮은 정도로) 이는 competent cell을 만들고 회복하는 과정에는 문제가 전혀 없었고, 배지 자체도 E. coli를 배양하기에는 문제가 없다는 것을 뜻한다.결국 Plasmid 벡터에 ampicillin 내성 유전자를 넣는 과정인 ligation 단계에서 에러가 나서 ampicillin 내성 유전자를 포함한 plasmid가 만들어지지 못했는데, 이 이유로는 ligase가 denature 되었다는 것이다. 효소이기 때문에 외부 영향을 많이 받고, 실험 도중에 오래 바깥에 꺼내놓거나 손으로 만지거나 하여 변성 되서 제 역할을 못했을 수가 있다.LB Broth에 (Containing 100g/ml of ampicillin) transformant를 multiplicationPrinciple위 실험으로 ligased plasmid를 받아들인 박테리아는 ampicillin 내성 유전자가 없다는 것을 알 수 있었기 때문에, 대신 inserted plasmid를 받아들인 박테리아만 골라서 이 박테리아가 ligased plasmid 를 받아들인 박테리아라고 가정하고 실험을 계속 하겠다.Ampicillin을 포함한 LB agar에서 자라난 박테리아가 다른 contaminant가 아닌지를 알아보기 위해서 colony 몇 개를 ampicillin이 들어간 LB broth media에 키운다.또한 Ampicillin을 포함한 LB agar에서 자라난 박테리아가 가지고 있는 plasmid가 ligased plasmid가 맞는지 확인하기 위해서 plasmid만 빼내서 전기영동을 시킬 필요가 있는데, 이를 위한 다량의 plasmid를 얻기 위해 박한다.
분자생물학 실습 Pre-lab Report 분자생물학 실습 x분반 xxxxxxxx xxx Chapter 3 Purification of DNA from Living Cells 3가지 다른 DNA 종류 준비하기. 첫번째는 Total cell DNA. 클론 해야 할 유전자 확보 위해서. Genomic DNA 들어가있고 plasmid 같은 부가적 DNA 있음. 두번째는 plasmid DNA. 처음과 정제법 같지만 마지막 염색체 DNA와 plasmid DNA 나누는 단계 있음. 세번째는 cloning 벡터 사용해야할때 필요한 phage DNA. Phage capsid 없애는 기술 필요함. M13은 예외, 박테리아 플라즈미드 같이 정제됨. 3.1 Total cell DNA 준비-박테리아 배양한다. 세포들을 파괴시켜 내용물이 나오게 한다. 이 세포 추출물들을 처리해서 DNA 빼고 다 없앤다. 남은 DNA 용액을 농축시킨다. 3.1.1 박테리아 배양 증가 및 수확 -액체 배지에서 대부분의 박테리아를 키운다. 배지는 박테리아가 효율적으로 자라날 수 있는 영양소와 농도를 맞춰줘야 한다. M9는 합성배지이다. 내용물을 다 알고 있다. 이 배지는 질소, 마그네시움, 칼슘 같은 무기질과 탄소와 에너지 공급을 위한 포도당 등을 포함하고 있다. 실제적으론 미량 원소와 비타민도 M9에 첨가된다. 정확히 어떤 첨가물이 들어가는지는 박테리아 종에 따라 다르다. Luria Bertani (LB)는 다르다. 복합적 또는 불확정한 배지이다. 구성요소가 어떤 것들이고 얼마나 들어갔는지 모른다. 이것들은 모르는 화학 합성체로 이루어진 혼합물이기 때문이다. LB는 다른 부가 첨가물 필요 없음. 합성배지는 통제된 상태에서 박테리아가 자라야 할 때 필요함. 하지만 DNA 때문에 키우는거면 복합배지가 더 낫다. 원심 분리기 사용해서 배지에 있는 박테리아 분리. 박테리아 시험관 밑 부분에 쌓인다. 윗부분에 있는 배지액은 따라낸다. 3.1.2. 세포 추출물 준비-세포 추출물 얻기 위해서 세포막, 벽 같은 것들d 하나라도 부숴지면 supercoil이 풀어지고 relaxed된 상태로 돌아간다. 이때는 플라즈미드가 open-circular (oc) 형태이다. Supercoiled된 플라즈미드는 그렇지 않은 DNA에서 분리해내기가 쉽다. 알칼리 변성 - 수산화나트륨이 세포 추출물이나 cleared lysate에 더해져서 pH가 12.0-12.5로 맞춰지면 supercoiled하지 않은 DNA의 수소결합은 끊어진다. 여기에 산성이 더해지면 변성된 DNA가 스스로 얽혀 덩어리로 된다. 이는 원심 분리기로 분리 가능하고 플라즈미드는 상청액에 남는다. Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation - Caesium chloride (CsCl) 용액을 원심분리 해서 density gradient를 만들어 낸다. CsCl 용액 안에 있는 고분자들은 원심분리 했을 때 부력 밀도에 따라 특정 지점에 모인다. 여기에 Ethidium bromide (EtBr) 를 넣고 원심분리하면 이것이 DNA에 붙어 이중나선을 풀어주어 부력 밀도가 내려간다. 하지만 DNA가 supercoiled 하면 잘 붙지 않는다. 그래서 DNA가 supercoiled, non-supercoiled에 따라 나눠진다. UV를 비추면 EtBr이 형광을 내서 DNA가 어디에 있는지 볼 수 있다. 주사기를 시험관 옆에 꽂아 플라즈미드 DNA를 뽑아낸다. EtBr는 n-butanol로 제거하고, CsCl은 투석으로 제거하면 순수 플라즈미드 DNA가 남는다. 3.2.3 플라즈미드 증폭-박테리아에 플라즈미드는 소량밖에 없다. 증폭해서 양을 늘린다. Multi-copy 플라즈미드가 단백질 생산 없이도 복제 가능한 능력을 가지고 있다. 박테리아 염색체는 이러한 능력이 없다. 충분한 세포 밀도를 얻은 뒤, chloramphenicol같은 단백질 생성 억제제를 넣어 12시간 동안 배양한다. 몇천개의 플라즈미드가 얻어진다. 3.3 박테리오파지 DNA 준비-박테리오파지transferase는 DNA 분자 3’ 말단에 deoxyribonucleotide를 더한다. 4.2 DNA 절단 효소-restriction endonucleases-유전자 클로닝은 DNA가 아주 정확하고 재생산적인 방법으로 절단되는걸 요구한다. 벡터 분자는 한 부분에서 잘려저서, 새로운 DNA가 그 자리에 들어갈 수 있게 된다. DNA 절단 이유는 유전자 하나만 클로닝 하려면 큰 DNA에서 잘라 내져야 한다. 대형 DNA는 벡터가 운반할 수 있을 정도로 작게 잘라져야 한다. 4.2.1 Restriction endonuclease의 발견과 성능-host controlled restriction이라는, 어떤 박테리아들은 박테리오파지 감염에서 내성을 보인, 현상에서 처음 발견됨. 박테리아의 제한효소가 파지 DNA를 잘라버리지만 박테리아의 DNA는 methyl기를 가지고 있어서 절단되지 않는다. 4.2.2 Type II restriction endonuclease는 특정 DNA sequence를 절단한다-Type II restriction endonuclease는 특정 염기 배열에서만 DNA 분자를 자른다. 4.2.3 Blunt ends and sticky ends-제한효소는 DNA 분자에 blunt ends나 sticky ends를 만든다. Blunt ends는 제한효소가 인식 염기배열 가운데에 이중 DNA 절단을 한다. Sticky ends는 제한효소가 두 개나 네 개의 nucleotide를 엇갈리게 잘라져서 짧은 single strand 돌출부분을 생기는 곳이다. 4.2.4 DNA 분자 안에 있는 인식 배열 빈도-특정 제한효소의 인식 염기배열이 길이를 아는 DNA 분자에서 몇 개나 있는지 수학적으로 계산 가능하다. 하지만 실제로는 nucleotide가 불규칙적으로 배열되어 있지 않으며 각각 비율도 다르다. 또한 일정한 간격으로 restriction site가 있지도 않다. 실제 실험만이 답을 준다. 4.2.5 실험실에서 restriction digest 실행- 곳에서 사용하면 blunt ends 가지고 있는 DNA 분자 끝에 homopolymer tail이 생성된다. 벡터 DNA 끝과 클론될 DNA 끝에 각각 상보하는 꼬리를 붙여주면 염기 쌍이 형성되며 ligase가 이 둘을 이어주기 편해진다. 4.3.4 Blunt end ligation with a DNA topoisomerase-Topoisomerase는 dsDNA에 turn을 더하거나 없엔다. DNA helix의 한 가닥을 자르고, 다시 잇는 능력이 있기 때문에 ligation도 할 수 있다. 5장 Living Cell에 DNA 넣기 살아있는 세포에 재조합 DNA를 넣으면 세포가 분열하며 많은 양의 재조합 DNA도 생산, 즉 클론된다. 재조합 DNA를 받아들인 세포랑 그렇지 않은 DNA를 받아들인 세포를 구분해야 한다. 5.1. Transformation-박테리아 세포의 DNA 흡수-배지에 있는 DNA 분자를 대부분의 박테리아는 흡수한다. 대부분의 흡수된 DNA는 분해되지만, 어쩔땐 살아남아 세포안에서 분열한다. DNA가 플라즈미드고 숙주가 인식 가능한 replication origin을 가지고 있으면 더 그렇다. 5.1.1 모든 박테리아가 DNA 흡수에 능률적이지 않다-transformation은 자연적인 유전정보 획득 방법이 아니다. 그래서 제한된 DNA밖에 흡수 못한다. 그래서 흡수가 잘 되도록 세포를 competent하게 만든다. 5.1.2 Competent한 E. coli 세포 만들기-CaCl2으로 처리한 E. coli는 DNA를 더 잘 흡수한다. 이때 DNA는 세포 바깥에 붙고, 온도를 순간적으로 42도로 올리면 세포 안으로 들어간다. 5.1.3 Transform된 세포 선택-competent 세포들의 transformation은 비효율적이다. 또한 transformed된 세포와 그렇지 않은 세포를 구분해야 한다. 플라즈미드가 흡수 되었으면 플라즈미드 유전자의 발현을 봄으로써 구분가능하다. 예로써 항생제 저항성을 들 수 있다. 5.2. Identi텅스텐이나 금으로 코팅해서 세포에 ‘폭격’하는 것이다. 이를 biolistics이라 한다. 5.5.2 Transformation of whole organisms-transform된 식물세포 하나 가지고 transform 된 식물을 만들 수 있다. 동물의 경우에는 수정란을 뽑아 DNA를 microinject하고 다시 이 수정란을 자궁에 심으면 transform 된 동물이 태어난다. 제 6장 Cloning vectors for E. coli 6.1 Cloning vectors based on E. coli plasmids-가장 간단한 클로닝 벡터는 플라즈미드이다. 구입가능하고, 정제 가능하고, transformation 효율 높고, 형질전환체와 재조합 분자들에 편리하게 선별 표식 가능하며, 꽤 큰 DNA 조각을 클론 할 수 있다. 6.1.1 The nomenclature of plasmid cloning vectors-pBR322의 p는 플라즈미드, BR는 백터가 처음 구축된 실험실, 322는 같은 실험실에서 개발된 다른 플라즈미드와 구분. 6.1.2 pBR322의 유용한 성질-pBR322의 특징은 크기이다 (4363bp). 10kb 보다 낮기 때문에 정제될 때 DNA가 분해되지 않으며, 재조합 되더라도 재조합 DNA 크기가 6kb정도면 10kb 보다 낮다. 또한 항생제 내성 유전자 두개를 가지고 있다. 덕분에 플라즈미드를 흡수한 세포를 선별하는데 사용가능하며 각 표식자 유전자는 여러 제한효소에 의해 잘릴 수 있다. 그리고 높은 복사수 이다. Chloramphenicol 같은 단백질 합성 억제제를 쓰면 세포안의 플라즈미드가 3000개까지 늘어난다. 6.1.3 The pedigree of pBR322-pBR322는 원래부터 이런 특징을 가지진 않았다. ampR 유전자는 R1 플즈미드에서, TetR 유전자는 R6-5에서, pBR322 replication origin은 pMB1에서 얻어졌다. 6.1.4 More sophisticated E. coli plasmid
서평: 생명의 윤리를 말하다 학번: xxxxxxx 이름: xxx 마이클 샌델의 ‘생명의 윤리를 말하다’는 짧고, 읽기에 무리 없는 책이며 다음 세대의 아이들에게 유전 강화를 적용하려는 사회에게 주는 일종의 비판이라 할 수 있겠다. 이 책에서 전반적으로 나타나는 것은, 프로메테우스적인 자연을 지배하려는 움직임과 선물로써 주어진 삶에 입각한 샌델의 윤리의 싸움이다. 샌델은 이 ‘선물적’인 삶을 존중 하지 않을 때, 인간으로써의 기본적인 가치가 위협당한다고 한다. 1장은 매우 다양한 예시들과 가능성들을 말해주고, 두 가지 경우를 다 말해주며 읽는 이로 하여금 도덕적으로 불편하게 만드는 동시에 정확히 뭐가 잘못되었는지 생각해보게 해준다. 샌델이 여러가지 흥미로운 제안들은 던진 뒤 결국 하는 말은 자율성과 권리는 앞서 설명한 이 ‘도덕적 불편함을’ 해결 할 수 없지만, 선물적 삶은 할 수 있다는 것이다. 2장은 운동 목적으로 유전 강화나 다른 방법을 쓰는 것에 대한 질문을 던진다. 흔히 이런 곳에서 나오는 애기들은 유전 강화 같은 것을 쓰는 사람은 그 사람의 인간성을 떨어뜨리기 대문에 좋지 않다고 하는데 샌델은 여기서 있어 다른 방향에서 접근한다. 그가 걱정하는 것은 더 큰 위험은 유전공학이 자연적 재능과 소질을 침식할 수 있다는 것이다. 이 타고난 재능, 즉 선물로써 주어진 삶이 스포츠의 요점이라는 것이다. 운동선수들이 스스로 열심히 노력하고 그들의 자연적 기량을 내뿜는 것이 스포츠인데 유전 공학이 이를 망친다는 것이다. 미식축구에서 선수들이 그저 몸집만 커지게 된다는 것이 미식축구 본질을 잃어간다는 것이고 이 대문에 선수들의 기량과 재능이 묻힌다는 것이다. 3장에서는 어떻게 보면 좀더 심각한 문제라고 할 수 있는 부모가 아이들을 디자인 하는 문제에 대해 얘기한다. 샌델이 말하는 것은, 아이들을 선물로써 고마워 하려면 그저 그것 자체로 받아들이면 되지, 디자인의 대상으로 보면 안된 다는 것이다. 부모의 사랑은 아이들의 재능에 따라 달라지는 것이 아니지 않는가? 샌델은 장에서 샌델은 ‘선물적 삶’에 대해 자신의 직접적인 견해를 나타내며 자신의 의견에 반대하는 반대를 낸다. 정복과 지배가 만연한 세상에서는 크게 세가지 가치들이 위협당하는데, 그 중 하나는 겸손이고 (부모들이 확정할 수 없는 것에 미래에 열린 마음을 가지게 한다) 또 하나는 책임이다. 샌델은 유전조작의 위험은 책임이 사라지는 것이 아니라 더 많은 것들이 선택에 근거하며 더 적은 것들이 운에 따르기 때문에 우리의 삶에 큰 책임이 지워진다는 것이라고 한다. 책에서 예를 든 것 같이 야구 선수들은 ‘암페타민’등을 복용하게 압박이 가해지고 부모들은 자신들의 아이들에게 더 좋은 자질을 선택해 줘야만 하는 책임이 생기는데, 샌델은 자신이 생각하기에는 인간들은 이렇게 늘어난 책임을 가지고 살아가기에는 준비되지 못했다고 한다. 마지막으로 연대성이 약해진다는 것인데, 보험의 예를 들어가며 설명한다. 유전 강화는 운명적 결과를 거부하기 때문에 사회가 사회적 연대성을 조성해야 할 필요가 약해진다는 것이다. 에필로그에서 샌델은 자신의 핵심, 즉 ‘정복과 통제의 가치가 우연과 경외의 가치를’ 억압해서는 안된다고 한번 더 강조하긴 하지만, 자신이 왜 줄기세포 연구에는 찬성하는지 설명한다. 강화는 정복과 통제 아래에 있지만 치료는 아니기 때문이라는 것이다. 또한 치료와 강화의 경계는 샌델의 주장하기로는 분명하여, ‘정상적인 인간 기능의 회복으로 한계선이’ 있기 때문에 이 선까지의 치료는 강화가 아니며, 때문에 우연과 경외의 가치를 누르지도 않는다는 것이다. 샌델은 일단 지금까지 있어왔던 대부분의 유전공학 반대자들의 반대를 일괄적으로 함축시켜버린다. 그 반대란 이 기술들이 안전하지 못하고, 압력적이고 치료목적이 아니라던가 또는 가난한 자에게 주어지지 못한다는 건데 일단 샌델은 그런 문제가 해결 되었다고 가정하자 라고 하며 자신이 정말로 걱정하는 것을 꺼낸다. 그는 유전공학을 통한 향상이 인간 안에 내제된 규범을 침해하는 것에 대해 걱정한다고 하는데, 그렇다면 이 보편적 규범들이 있다는 것쟁을 돕는 유전 공학이 생겨난다면 아마 대부분의 이들이 이를 받아 들일 것이며 결과적으론 유전공학 전후 상황이 똑같아 질것이란 것이다. 결국 유전공학이 경쟁을 부추기든 말든, 결과가 똑같은데 유전조작을 수용하건 말건 무슨 소용인가? 즉, 경쟁으로 인해 선물로서 삶의 의미가 이미 결핍된 사회에선 유전조작이 있으나 마나 하다는 것이다. 이 ‘선물로 주어진 삶’의 개념은 우생학으로도 연결되는데, 사실 세계 2차대전 전의 우생학은 별로 논할 가치가 없다고 여겨진다. 아돌프 히틀러에 찬성하는 사람은 없기 때문이다. 문제로 대두되는 것은 자유주의 우생학이다. 강압적이지 않고 안전한 우생학의 선택권. 하버마스의 이론을 샌델이 많이 인용하는데, 결국 주요 골자는 우리가 통제 못하는 우연한 시작만이 진정한 자유를 줄 수 있다고 하는 것이다. 우생학은 진정한 자유의 본질을 해치기 때문에 거부할 만한 일이라 한다. 또한 통제 불가능한, 그러니까 선물 같이 그저 우리에게 주어진 삶은 우리가 우리 삶에 전적인 책임을 지지 않아도 되고, 그러므로 비난 받을 점이 없다는 것이다. 하지만 유전공학으로 인한 늘어난 책임과 선물 같은 삶이 주는 결백함 사이에서 하나를 고르라면 전자를 선택하겠다. 우연히 주어진 결함을 안고 사느니 차라리 유전자 치료를 통해 더 나아진 나를 선택하겠다는 것이다. 샌델은 보험의 예를 들며 사회적 공동체의 연대와 ‘주어진 선물’의 연결고리를 설명한다. 우리가 노력해서 얻은 결산물이 아니고, 주어진 선물이기 때문에, 공동체의 다른 사람들과 나누어야 한다는 것이다. 솔직히 말해서 이 부분은 설득력이 많이 약하다고 생각한다. 미국 사회에선 이렇게 생각하는지 몰라도 적어도 나는 우연히 주어진 선물 조차도, 그 사람이 우쭐거릴 수 있는 이유 중 하나라고 생각하기 때문이다. 우리 주위를 둘러보면 쉽게 알 수 있다. 샌델이 말한 것이 우리의 현재 사회라고 하긴 설득력이 없다. 우리 사회가 정말 나누고, 연대적인 삶을 보여주고 있는가? 어느 면에선 그럴지도 몰라도 겉으로 들어난,나 주제를 놓고 말하는 책들의 본론은 3장으로도 압축 가능하다. 어쩔 땐 3줄도 충분하다. 하지만 출판하려고 하면 최소 200장 정도는 되어야 하니 샌델이 진짜 말하고 싶은 본론 위에 살과 껍데기가 들어간 것이다. 139쪽 전 까지는 샌델의 직접적인 의견을 찾아보기 매우 힘들다고 할 수 있다. 대부분의 케이스에서 샌델은 한 문제에 관하여 두 가지 양반 되는 입장을 던지고 독자에게 질문을 던지는 것으로 끝난다. 상당히 짜증나는 경우라 할 수 있다. 샌델의 가장 직접적인 결론은 책 마지막 부분에서 여실히 들어난다. 나는 책을 읽을 때 목록과 해설, 그리고 그 앞의 들어가는 글 등을 자세히 읽는 편이다. 읽는 책의 방향성을 제시해 주기 때문이다. 이를 통해 나는 이 책이 2001년 말, 대통령생명윤리위원회에 있었던 위원 중 한 명이었고, 또한 그가 줄기세포 연구 옹호에 표를 던졌지만 윤리적인 부분에서 제제를 가하자고 하던 사람이란 걸 알았기 때문에 책을 읽으면서도 사실 샌델이 궁극적으로 무엇을 말하고자 하는 지 파악 할 수 있었다. 샌델은 유전학적 강화에 반대한다. 결국 그가 하고 싶었던 말은 인위적으로 인간의 불완전한 부분을 고치는 것이 아니라, 사회적으로, 그리고 정치적으로 인간의 부족한 부분을 채워주고 배려하는 제도를 위해 노력을 해야 한다는 것이다. 유전공학에 대한 샌델의 생각은 유전공학이 삶을 선물로 받아들이는 것을 몰아내고, 자신의 의지 밖의 긍정할 것을 남겨두지 않는다고 한다. 이렇게 되면 샌델 자신 또한 자기 자신의 결정에 반대되고 만다. 그는 분명 줄기세포 연구를 찬성했던 사람이다. 때문에 그는 에필로그에서 줄기세포가 윤리적 문제가 되지 않는다는 것을 얘기한다. 사실 이 책의 나머지 부분과 에필로그는 상당히 떨어져 있다면 떨어져 있다고 할 수도 있는데, 아무래도 에필로그의 줄기세포에 관한 내용은 샌델의 대통령생명윤리위원회와 직접적인 관련이 있는 글인 것 같기 때문이고, 나머지는 그렇지 않기 때문이다. 내용으로 보면 에필로그를 따로 때어내서 책으로 만여러 가지 법적 제제를 가해야 한다고 한다. 여기서 뭔가 나는 이상하다고 느낀다. 샌델이 말하는 것같이 아무리 이원적인 견해가 뒤집힌다고 해도, 결국 배아가 인간이 아니라면 그 사실로 모든 논증은 끝난 것이나 마찬가지다. 샌델이 말하는 것 같이 ‘오래된 숲을 존중해서 나무를 한 그루도 베면 안 된다는 것이 아니다, 숲의 본성에 적절하게, 가치 있는 일일 때는 베어도 된다’고 어쩌고 할 필요가 없다. 인간은 숲이 아니다. 이건 확연한 사실이다. 배아가 인간이 아니라면 다른, 훨씬 더 낮은 도덕적 가치를 가진 물체로 보아도 무방하지 않겠는가? 배아가 인간이 아니라고 하는 순간 그냥 배아를 마구잡이로 써도 되지 않은가? 어차피 인간도 아닌데? 센델이 사용한 숲이나 고희의 같은 건 자연적, 문화적 가치가 있지만 그저 실험실에서 인공적으로 만들어진, 육안으로도 거진 확인 불가능한 세포 조각에 무슨 가치 부여를 할 것이며 또 한다고 해도 그것이 무슨 의미가 있겠는가? 나의 소견은 생명 공학과 윤리는 정말 어렵다는 것이다. 예를 들어 줄기세포 같은 문제는 나에게 있어 확실한 이분적법 문제이다. 그러나 센델의 논리를 따라가긴 어렵고 내가 ‘생명의 윤리를 말하다’를 통해 센들을 다 이해했다고 하지도 못한다. 나에게 있어 확연한 문제가 다른 이에겐 그렇지 않을 수도 있다는 것이다. 세상만사가 다 성경에 기록되어 있지 않다. 내가 하는 행위의 선과 악을 구별할 수 있는 성경적 잣대가 생명공학에 와서는 상당히 애매모호 해진다. 줄기세포 같은 문제야 ‘살인’에 연관 지어 생각 할 수 있으니 다른 문제보단 성경에 기대기가 낫다고 할 수 있겠다. 그러나 다른 생명공학 분야라면 딱히 성경에 직접적인 연관성이 없으면 별 문제가 없지 않을까? 새로운 기술에 관한 진보세력과 보수세력의 대립은 예전부터 지금까지 항상 존재해 왔고 그게 빠르던 늦던 결국 새로운 기술은 받아들여져 왔다. 예전엔 이 기술이 세계의 종말이다 뭐다 하던 문제들이 지금 와서는 일상에 당연하게 자리잡고, 옛 반대언론들은 사라