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바이오에너지 생산 및 연료화 및 신재생 에너지 생산 공정 과정 조사 자료

Ⅰ. 바이오 매스(<바이오 에너지)1. 바이오 에너지태양광을 이용하여 광합성되는 유기물(주로 식물체)과 이러한 유기물을 소비하여 생성되는 모든 생물유기체(바이오매스)의 에너지를 바이오에너지라 하며, 바이오에너지 생산기술이란 생물유기체를 각종 가스, 액체 혹은 고형연료로 변환하거나 이를 연소하여 열, 증기 혹은 전기를 생산하는데 응용되는 화학, 생물, 연소공학 등을 말한다.바이오매스를 에너지원으로 이용하는 방법으로는 직접연소 / 메테인발효 / 알코올발효 등이 있다. 바이오매스( Bio-mass )태양에너지를 받은 식물과 미생물의 광합성에 의해 생성되는 식물체·균체와 이를 먹고 살아가는 동물체를 포함하는 생물 유기체를 일컬는다.따라서 바이오매스자원은 곡물, 감자류를 포함한 전분질계의 자원과 초본, 임목과 볏짚, 왕겨와 같은 농수산물을 포함하는 셀룰로오스계의 자원과 사탕수수, 사탕무와 같은 당질계의 자원은 물론 가축의 분뇨, 사체와 미생물의 균체를 포함하는 단백질계의 자원까지를 포함하는 다양한 성상을 지니며, 이들 자원에서 파생되는 종이, 음식찌꺼기 등의 유기성폐기물도 이에 포함된다. 바이오매스에서 만들어지는 다양한 연료로 액체 연료로는 에탄올, 메탄올, 바이오디젤, 피셔-트롭스크(Fischer-Tropsch) 디젤이 있고 기체 연료로는 수소와 메탄이 있다.2. 바이오매스의 사용 원료나무, 곡물, 식물, 농작물 찌꺼기, 축산분뇨, 음식 쓰레기 등이 모두 바이오매스로서 에너지 생산에 이용될 수 있다. 바이오매스는 나무처럼 가공하지 않은 형태로 손쉽게 열을 생산하는 데 이용될 수도 있고, 가공하여 메탄올, 에탄올, 바이오디젤유 등의 액체 연료와 수소나 메탄 같은 기체 연료 등의 바이오연료(biofuel)를 얻어 자동차 연료나 발전용, 난방용 연료로 이용하는 것도 가능하다초본 에너지 작물, 다 자라기까지 2내지 3년이 걸리고 이후로 매년 수확이 가능한 다년생식물이 포함된다. 농작물, 대개 당, 기름, 그리고 플라스틱이나 다른 화학물질들을 만드는데 사용될 수 있는 여러 추출물 등을 산출하는 것으로 현행 유통 중인 생산품과 미래에 새롭게 개발될 상품의 성분을 포함하는 작물, 육상에서 자라는 것 외에서도 수중 바이오매스 자원이 있는데, 조류, 대형 해조, 그 외 해초와 해양 미생물등이 이에 포함된다.

자연과학| 2014.08.08| 8페이지| 1,500원| 조회(397)

생산공정, 신재생에너지, 바이오에너지, 바이오공정, 에너지생산공정, 바이오에너지연..

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BCA 정량법을 이용한 미지 시료의 단백질 정량의 실험 방법 이론 및 고찰

단백질 정량 - BCA를 이용한 단백질 정량법1. 실험 제목 : 단백질 정량 - BCA를 이용한 단백질 정량법-* 실험 목적 : 미지시료 단백질의 농도 측정,단백질 정량을 위한 농도 계산 이해와 표준곡선의 작성2. 실험 원리 :* 실험 이론정량분석 :어떤 물질이 시료에 어느 정도 포함되어 있는가를 검사하는 것. 정성분석에서‘무엇’이 있는가를 알게 되면, 그에 따른 화학반응 등을 이용하여 함유량을 측정한다(물질을 구성하는 양적 관계를 명확하게 하는 분석법의 총칭)흡수분광법 : 단백질을 이루고 있는 아미노산중 대부분의 단백질이 함유하고 고리를 가진 방향족 아미노산 (ex) 페닐알라닌, 타이로신 등)은 280nm 파장에서 빛에너지를 강하게 흡수하는 특징을 가진다. 이중결합 구조가 있는 단백질 화합물의 단백질 용액을 분광 광도계에 넣어 흡수량과 단백질 농도의 상관 관계를 이용하여, 흡수량을 보고 농도를 알 수 있다. 예외가 있기는 하지만 순수한 단백질의 경우 단백질의 농도가 1mg/ml이고 자외선이 통과하는 경로가 1cm 일 때 280nm에서의 흡광도는 1.0이다. 따라서 대부분의 순수한 단백질의 농도는 280nm 에서의 흡광도를 측장함으로써 신속히 결정할 수 있다. 이 방법은 정량하는 데 시간이 적게 들 뿐만 아니라 정량하고 난 후의 단백질을 완전히 회수하여 재 이용할 수 있는 이점이 있다.염료(dye) 결합 後분광 : 단백질 용액에 dye를 결합하는 반응을 시키면 염료는 색이 바뀌는데 이때 반응물의 최대흡광도를 이용하여 분광광도법으로 단백질의 흡수량을 통해 정량 측정이 가능하다.구리 환원 법 (Cu{} ^{2+}ㅡ>Cu{} ^{+} 2가이온 reduction)단백질용액을 구리황산용액에 넣어 알칼리조건에서 반응시키면 착화합물을 형성하며 구리 2가이온이 환원된다. 이때 구리용액에 BCA 용액을 첨가 시키면 다시 착화합물을 형성하며 최대 흡광 파장이 562nm인 BCA-Cu{} ^{+}가 생기는데 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 562nm에서의 흡수량과 단백질과의 정량Lowry법은 알칼리 상태에서 Cu{} ^{2+}ㅡ>Cu{} ^{+}로 환원시키고 첫반응이후에 반응의 감도를 높이기 위하여 Cu{} ^{+}으로 Folin-Ciocalteu 시약을 환원시키고 발색된 시료를 750nm에서 측정한다. Lowry법은 pH에 민감하여 10~10.5로 유지되어야한다. 실온에서 반응이 이루어지므로 간편하고 가장 널릿 ㅏ용되는 단백질 정량법이다. 그러나 환경의 영향을 받기 쉽다는 단점이 있고 cooper시약이 제조, 보관이 어려우며 시간이 오래걸린다는 단점이 있다.BCA방법은 단백질이 구리 이온Cu 2+, Cu 1+)을 환원 (Reduction) 시킬 수 있는 성질을 이용한다. 단백질에 의해 환원 된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서, 보라빛의 화합물을 생성하게 된다. 이 화합물은 빛의 특정 영역 562nm에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기에, spectrophotometer를 사용해서 측정하면 흡수율 차이를 측정할 수 있다. 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보라빛 화합물이 생성되었을 테고, 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수하니까 흡수율이 증가하고, 그것에 비례해서 샘플 안에 있는 단백질 양을 가늠한다. Lowry assay의 변형된 최근의 새로운 방법으로써 간단한 실험을 통하여 단백질을 정량할 수 있는 장점이 있다.BCA정량법의 장점 -일반적인 buffer물질의 간섭에 덜받는다.높은온도에서 하면 아주 민감하고 빠른 반응을 할수 있다계면활성제와 같이 사용할 수있다.반응시약이 안정적이다.서로다른 단백질 사이에 반응의 차이가 거의 없다.Lowry assay를 사용했을때보다 방해를 주는 물질이 없다.단점 -실온에서 반응이 완전히 수행되지 않는다. 다량의 단백질 정량시 문제가 된다.농축된 단백질 샘플은 희석이 필요하다.단백질의 성질이 변한다.켈달 방법 : 습식 질소 정량법의 하나로 단백질을 산용액에서 열을 가해주며 분해되어 나온 암모니아 NH{} _{3} gas를 정량하는 방법이다. 이 유출된 암모니아의 양에서반적으로 빛이 물체에 닿으면 그빛은1. 물체의 표면에서 반사, 2. 물체의 표면에서 조금 내부로 들어간 후 반사 3.물체에흡수, 4.물체를 통과하는빛으로 나누어 지는데 물체에 의하여 흡수되는 빛의 양은 그 농도에 따라 다르다. 그러므로 이와 같은 빛의 흡수 현상을 이용하면 시료용약 중의 빛을 흡수하는 화학물질의 양을 정량할 수 있다.시료용액을 통과한 빛의 양 (T) 는 흡광 물질이 존재하지 않았을때의 빛의 강도(I) 즉, T=I/10으로 표시되기 때문에 빛의 통과율은 항상 1보다 작으며 다음과 같이 %로 표시할 수 있다. %T=T*100빛의 통과율은 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내는건 아니지만 그 로그함수는 시료의 농도와 일정한 상관 관계를 나타낸다.- log T = K*C여기서 C는 시료 중 흡광물질의 농도이고, K는 상수이다. -log T를 흡광도 A라고 한다면 흡광도는 시료의 농도아 특별한 상관관계를 지니게 된다.그러므로 강도를 비교하여 단백질 정량에 사용할 수 있다A= K*C (흡광도 = 흡광물질의 상수*흡광물질의 농도)3. 실험 재료표준용액 (BSA(Bovine Serum Albumin 소혈청에많은 알부민.) 10mg/mL)BCA(Bicinchoninic Acid) 용액 (SIGMA LifeScience./ b9643-1L Batch #46696BM).Copper(Ⅱ) sulfate solution (SIGMA-ALDRICH. C2284-25ML)Spectrophotometer (T60 UV-Visible spectrophotometer)Nuclease-Free Water(Part# P119C Lot#24259601)미지시료 1,2distilled water(증류수. 희석에 사용)4. 실험 방법1) BCA 용액 10ml와 Cupric sulfate 용액 0.2ml를 혼합하여 Working solution을 제조한다.2) 표준용액 0, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 μg/μl 를 각각 1ml 씩 준비한다. 이때 0은 증류수로 10 μg/ 10mg/ml용액 0.5ml에 증류수 0.5ml를 넣어 희석하여 제조, 2mg/ml는 10mg/ml용액 0.2ml에 증류수 0.8ml를 가한다. 그리고 5, 2mg/ml를 각각 10배, 2배 희석하여 좀더 간편하게 0.5, 1, 0.2 mg/ml를 제조한다.3) 제조한 표준용액과 미지시료 2개에 working solution을 1ml씩 넣고 20μl의 시료를 넣어 섞으면 색이 변하고, 60℃에서 30분간 BCA 반응을 수행시킨다.4) 반응 완료 후 실온에서 식히고 562nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정 한다. 이때 흡광도 값의 정확성을 위해 10배로 더 희석한 후 흡광도를 측정하고 후에 다시 희석배수를 고려하여 값을 구하여 표준정량곡선을 작성한다.5. 실험 결과Ⅰ. 미지시료 1,2의 흡광도 값시료흡광도x10- blank 값미지시료 10.3183.182.869미지시료 20.6106.105.789흡광도 측정 전에 농도가 1이 넘어가면 측정값이 불균일 하므로 10배를 더 희석해준다. 따라서 희석한 것의 흡광도를 측정한 것이므로 거기에 10배를 한 값에서 blank값을 빼준다. (blank 값 = 0.311)시료 1 : 3.18 - 0.311 = 2.869시료 2 : 6.10 - 0.311 = 5.789Ⅱ. 표준 용액의 흡광도 값표준 용액 농도 (μg/μl)측정 흡광도(2~10μg/μl) X 10- blank값00.30700.20.5270.2160.50.8090.49811.1110.80020.3063.062.74950.4894.894.579100.6666.666.349농도가 1 이하인 표준 용액들은 10배 희석을 해주지 않고 바로 흡광도 측정이 가능하다.분석Ⅲ. Standard Curve (흡광도 vs 단백질 농도)y=0.652x + 0.427R{} ^{2}=0.928Ⅳ. 미지 시료의 흡광도 측정값을 이용한 농도의 결정y=0.652x + 0.427미지시료의 흡광도 측정값을 y에 대입하여 농도인 x의 값을 구할 수 있다미지시료1의 흡광도 2.869 = 0.652x 442 ∴ x = 3.745미지시료2의 흡광도 5.789 = 0.652x + 0.427-> 0.652x = 5.789 - 0.427 = 5.362 ∴ x =8.2246. 논의 및 결론 고찰구리의 환원과 흡수분광법을 이용한 단백질 정량법 중 하나인 BCA 정량법을 통하여 단백질의 농도를 측정하는 실험을 하였다. 표준 정량 곡선 작성을 위해 표준용액을 농도별로 희석하여 제조하여 실험하였는데, 희석을 보다 간편하게 오차 범위를 줄이는 쪽으로 하기 위하여 10 mg/ml 용액을 바로 1, 0.5, 0.2 mg/ml 용액으로 직접 희석하지 않고 5, 2mg/ml 용액을 만든후 그것을 다시 희석하여 1, 0.5, 0.2 mg/ml 용액을 제조하는 쪽으로 실험하였다. 후에 미지시료도 표준용액과 함께 working solution 1ml와 20μl의 시료를 넣어주면 색깔이 변하게 된다. 그런데 5mg/ml 용액은 색깔이 거의 변하지 않았으며 다른 용액들도 색깔이 안변하여 실험에 실수가 있었던 듯 했다. 다른 용액들은 잘 섞어주지 않은 것이 문제이었기 때문에 60도씨에서 반응시키기 전에 흔들어주니 색이 변하였지만 5mg/ml 용액은 여전히 거의 변하지 않았다. 마이크로 파이펫의 사용 미숙으로 제대로 된 양을 주입하지 못한 것을 원인으로 보고 있다. 마이크로 파이펫이 평소 많이 쓰던 피펫보다 더욱 간편하고 양을 맞추기도 편하지만 아직 익숙하게 사용하지 못하여서 실험 내내 문제가 있는 편이었다. 후에 30분간 반응을 시킨 용액들을 꺼내어서 실온에서 냉각시켰다. 반응 전과 색이 또 변해 있었고 농도가 짙을수록 진한 남보라색도 더 진하다는 점을 볼 수 있었다. 식힌 후에 분광광도계에서 흡광도를 측정하기 전 농도가 1.00 보다 큰 값이거나 농도를 알 수 없는 미지시료는 측정값을 더욱 정확히 하기 위해 더 희석해준 후에 실험을 진행하였다. 이것은 이론에서 조사한 실험 원리에 BCA 정량법의 단점인 농축된 단백질 샘플은 희석이 필요하다는 뜻을 알게 해주었다. 하지만 이렇게 또 미숙한 파다.

자연과학| 2013.11.05| 6페이지| 2,500원| 조회(3,798)

흡수분광법, 단백질 정량 분석, BCA, 단백질 정량법, 단백질 농도 구하기, 단..

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Chromosome에서 genomic DNA 분리/ 분석 실험 보고서

생화학 실험 보고서< mammalian DNA isolation >1. 실험 제목 :- Mammalian DNA isolation1주차) 간세포에서 추출한 DNA 분리/ 제한효소 반응2주차) DNA 전기영동분석 / vector DNA : Plasmid 형태* 실험 목적 : Chromosome에서 genomic DNA 분리/ 분석2. 실험 원리->실험 이론DNA 분리.DNA 분리를 위해 동물세포는 세포막을 제거하고 핵막을 제거한 후 , 단백질과 RNA를 분리해내어 DNA를 취할 수 있다. Plasmid 같은 경우에는 Chromosomal DNA보다 작으며 세포내에서 다른 DNA로부터 분리가 쉬우며 다른 생물체로의 형질전환이 가능하므로 유전자 조작에서 Vector DNA로 널리 사용된다. Plasmid의 정제를 위해서는 우선 plasmid를 지니는 세포를 액체배지에서 배양, 세포벽 및 막을 제거하여 Cell을 Extract 상태로 만들고 단백질과 염색체 DNA를 제거하고 에탄올 침전으로 DNA을 응축하여야 한다. Plasmid를 분자량이 큰 Chromosomal DNA로부터 분리하는 방법은 물리적인 차이점을 이용하여 이루어진다.조직의 Genomic DNA 분리 방법은 세포용해 ( Cell lysis Buffer 이용 ), 단백질과 RNA의 제거, DNA의 추출과 분리된 DNA의 양과 순도 측정등 4개의 단계를 필수적으로 가지고 이러한 과정에서 주의해야 할 사항은 DNA의 물리적인 결단 및 손상과 DNase에 의한 화학적 분해이다. 심한 현탁이나 교반과 같은 강한 물리적인 힘을 가하지 않도록 하며 모든 용액과 기구를 멸균하거나 DNA 억제제를 첨가하여 DNA분자가 분해되지 않아야 한다.제한효소DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제(핵산분해효소의 하나)로서 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소이다.아라로오스 겔 전기영동 .agarose gel electrophoresis겔 전기영동법(gel electrophoresis)의 하나로서 정제된 한천 겔(gel)을 지지체로 사용하여 직류 정전압의 전류를 통함으로써 하전된 목적물질을 분리한다. 핵산 특히 DNA 분자나 그의 단편(제한효소처리로 생성된 단편)의 분리에 사용되고 있다. 보통 0.5~2.0% 농도의 아가로오스를 사용한다. 이 겔(gel)을 유리관 중에 만든 디스크(disc)식과 수직 혹은 수평의 겔판(gel plate) 중을 전기이동시키는 평판식이 있다. DNA는 -(음)로 하전하므로 ＋(양)전극으로 영동하며 분자의 크기에 따라 작을수록 빨리 영동한다. 또 영동속도는 DNA 분자의 형상에 따라서도 다르며 같은 분자량이라도 폐환상, 직쇄상, 개환상의 순으로 이동한다. DNA의 위치는 에티듐브로미드 용액으로 염색시켜 자외선으로 조사하면 붉은 색 또는 오렌지색의 밴드로 검출된다. DNA의 제한효소처리와 조합시켜 DNA 단편의 분자량결정, 플라스미드의 검출, 특정 DNA 단편의 분리 등 핵산 연구법 중에서도 장치의 간편화 등으로 일상적인 방법으로 이용되고 있다.벡터. vector.DNA 재조합 실험에 있어서 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA로서 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. 벡터(vector) DNA는 제한효소 등으로 절단하여 개환하고 여기에 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결하고 숙주균에 도입시킨다. 목적 DNA 단편을 연결한 벡터 DNA는 숙주균이 증식됨에 따라 복제하여 균의 분열과 더불어 각 낭세포로 분배되어 목적 DNA 단편을 대대로 유지하여 이어져 나간다. 플라스미드(plasmid), 파지 염색체를 주로 사용한다.플라스미드(plasmid) - 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA의 고리 모양인 유전물질3. 실험 재료① 소간 (sample 10~20mg tissue)② 추출용액 (extraction buffer)② CH{} _{3}COOK(potasium acetate buffer)③ 침전된 알콜 -> Isopropyl alchol (RNA만 따로 침전시킴)④ 원심분리기((MICRO 17TR, Micro High Speed Centrifuge)⑤ Balance(ARB120, Ohaus Corp., NJ, US)⑥ Vortex⑦ pET-21b(+)(plasmid)⑩ 항온수조⑪ 전자레인지.⑭ EtBr ( Ethidium Bromide ): 염색료. 형광물질로 DNA 나선의 염기 사이에 끼어들어가 결합하기 때문에 강렬한 발암물질. UV를 받게 되면 가시광선으로 파장을 변화시키는 형광물질로 전기 영동 후에 DNA 확인을 가능 하게한다.4. 실험 방법1) 10~20 mg 간조직을 준비한다. (Eppendorf tube 사용)2) tube에 600mu l의 lysis buffer를 첨가한다.3) vortex를 한 후 위 용액을 혼합, 파쇄한다.4) RNase를 1mu l처리한다. --> 37℃. 20min 반응 (RNA 분해)5) 20mu l의 potassium acetate 용액을 처리하고 vortex 시킨다.6) centrifuge at max speed (최대속도로 원심분리기 4℃,3분)7) 상등액을 새로운 tube에 옮긴다.8) 600mu l의 isopropanol을 첨가한다.9) 600mu l의 70% Ethanol을 넣어(washing) 섞는다.(1~5분.max speed)10) 상등액을 버리고 pallet에 남아 있는 물기제거를 위해 air dry한다.11) 5분정도 공기 중 방치한 후 Buffer or 증류수 20mu l,50~100mu l를 넣는다.-> 제한효소 반응 (Ecor1이라는 제한효소로 간 조직에 있는 genomic DNA를 잘라서 밴드 확인)1) DNA 5μl, 10X buffer, DW 33μl, 10X BSA 5μl EcoRⅠ(제한효소) 2μl를 넣고원심분리기에서 처리한다. max speed. 1min2) 37?C에서 밤새 놔두고, 다시 저온 -20℃에 보관한다.-> DNA 전기영동 분석 (Agarose gel electrophoresis)5. 실험 결과각 조별, 개인으로 genomic DNA를 로딩한 사진에는 아무것도 나타나지 않았고 Size marker 부분은 모두 선명하고 두껍게 나왔다.pET-21B(+)의 밴드는 거의 5000bp에서 나타나며, 제한효소 처리가 된 pET-21B(+) 에도 거의 같다. pET-21B(+)에 외부유전자를 삽입한 lane에서는 밴드가 나타나지 않았으며 pET-21B(+)에 외부유전자를 삽입하였을 경우 5000pb와 1000pb에서 2개의 밴드가 나타냈다.6. 논의 및 결론 고찰이번 실험은 2주에 걸쳐 이루어 졌으며 소의 간 조직에서 DNA를 추출하여 genomic DNA의 분리에서 제한효소반응, Agarose 겔 전기영동을 이용한 DNA의 크기에 따른 분리를 하였다. 소간을 파쇄하여 샘플을 만들고 Cell lysis Buffer를 이용하여 간 조직 세포를 파괴하였고, RNA와 Protein을 따로 분리 해내는 과정을 거치고 gDNA를 얻었다. 샘플들을 전기영동하기 전에 튜브에 DNA가 눈에 보이는 조도 꽤 있었다. 그러나 전기영동 후 사진은 Size marker의 밴드만 뚜렷하게 나오고 genomic DNA는 거의 모든 조와 개별 로딩한 것도 다 나오지 않았다. 그러므로 분리 과정에서 공통적인 실수가 있었던 듯 싶다. 실험이론 조사를 하며 플라스미드와 백터의 관계와 플라스미드 백터를 이용한 유전자 재조합, 플라스미드 백터에 존재하는 복제개시점과 클로닝 사이트와 제한효소의 쓰임과 종류에 따라서도 달라진다는 것에 대해서도 알아 볼 수 있는 기회가 되었다.. S겔 전기영동에 사용된 아가로스의 농도는 DNA의 크기가 작을 수록 %가 커진다. 따라서 사용할 제한효소와 백터에 따라 아가로스의 농도를 다르게 한다. 이번 실험에는 대표로 두 친구 겔을 각각 0.8%, 1.2%로 만들었다. 그래서 1.2%의 겔에서 백터를 로딩하였고 0.8% 겔에서 gDNA를 로딩하였다. 1.2%의 겔의 실험에서 2번 Lane의 백터에서 제한효소를 사용하여 절단한 3번 Lane에서 여러 개의 밴드가 나오지 않았다. 제한효소 처리를 잘 못한게 아닌가 싶다.

자연과학| 2013.09.30| 6페이지| 2,000원| 조회(486)

Agarose gel Electrop, DNA 분석, DNA 전기영동, Chr..

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크로마토그래피의 이해를 돕고 TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용한 아미노산 분리.분석 실험 방법과 이론과 개념 및 결과 고찰에 대한 실험보고서

생화학 실험 보고서< 크로마토그래피 >학 과 :생명화학공학과1. 실험 제목 : 크로마토그래피- TLC(Thin Layer Chromatography)를 이용한 아미노산 분리.분석* 실험 목적 :① chromatography이 원리 숙지② Thin Layer chromatography를 이용하여 아미노산을 분리하고 정성 분석.③ TLC 법으로 아미노산 표준 시료들과 비교하여 미지시료 분석2. 실험 원리 :* 실험 이론크로마토그래피종이끝을 물(이동상)에 담가 놓으면 물(고정상)이 그 종이의 틈을 타고 올라간다. 그러면서 잉크와 만나면 그 잉크를 녹여서 같이 끌고 올라가게 되는데, 이 때 색깔 성분은 각기 끌려 올라가는 길이가 다르다. 종이에 세게 달라붙는 정도, 전개시킬 때 사용할 액체에 녹는 정도, 녹아있는 물질의 분자량 등에 따라 움직이는 거리가 달라진다. 따라서 처음에 한 점에 모여 있던 각각의 성분들이 이동속도의 차이에 따라 띠처럼 갈라지게 된다. 이처럼 화학적 혼합물이 어떤 매체 위를 이동할 때 각각의 물질의 매체에 대한 친화도의 차이를 이용한 물질을 분석하는 방법을 크로마토그래피라 한다.TLC(Thin layer chromatofraphy, TLC 얇은막크로마토그래피,박층 크로마토그래피)크로마토그래피의 기술 중 하나인 TLC는 혼합물을 분리하는데 사용된다. TLC는 사용 목적에 따라 실리카겔, 알루미늄 산화물, 셀룰로오스와 같은 흡착제로 도포한 유리판, 플라스틱판, 알루미늄 호일판 위에 전개된다. 도포된 물질들은 고정상이다. (이번 우리 실험시간에는 실리카겔이 도포돤 유리판 TLC plate를 사용.)시료를 팔 위에 점적한 후 이동상인 용매 또는 용매 혼합물로 적셔 전개시킨다. 시료안에 여러 가지 물질들은 전개 용매에 대하여 각기 다른 친화성을 가지고 있어 다른 이동 속도로 전개되게 된다.* TLC에서 이동상과 고정상의 역할(1) Stationary phase 고정상(정지상) :크로마토그래피에 분리나 정제될 물질이 올려질 고체 지지제이다. 범용적으로 주 사용되는 흡착제(absorbent)로는 제일 많이 쓰이는 것이 실리카겔이고, 그 다음이 알루미나, 드물게 셀룰로오스. 취급하고자 하는 물질의 성질에 따라 다른 고정상 물질을 사용한다.(2) Mobile phase 이동상 :고정상에 올려질 물질을 이동시키기 위한 수단이다. 전개제(developer)라고도 부르며, 전개용매라고 한다. 보통 극성용매와 비극성용매를 적절한 비율로 혼합하여 사용한다전개용매는 초기 경험자는 교재나 문헌 등을 찾아 결정하고, 많은 실험을 거치면 경험적으로 용매의 종류와 혼합비율을 찾을 수 있습니다.* TLC의 장점TLC 법은 원리상으로는 종이크로마토그래피와 다를 바가 없으나 종이크로마토그래피에 비해 전개 시간이 짧고, 분리 능률이 양호하며, 지지체가 거름종이와는 달리 열이나 진한 무기산에 잘견딜 만큼 매우 안정하다. 따라서 강한 산.염기나 강렬한 시약 등을 발색시약으로 사용할 수 있는 특징을 지닌다. 유기화합물의 분리, 정제, 정량, 순도, 검정 반응이나 대사과정의 추적, 무기 이온 분석 등 응용 범위가 넓다. TLC는 매우 손쉽고 빠르게 할 수 있어서 혼합물 조성의 1차적인 분석방법으로 사용되고 관 크로마토그래피를 위한 최적의 elution solvent를 찾는데도 유용하게 사용되며 특히 아주 적은 양으로도 분석할 수 있는 장점이 있다.*TLC의 용도방사성 의약품의 방사화학적인 순도검사식물이 함유하고 있는 색소 확인식품에 들어있는 살충제 또는 제초제의 검출섬유의 염색 혼합물의 분석 또는 주어진 물질 내에 존재하는 혼합물 식별유기반응의 관찰 등Rate of Flow(Rf) value. Rf 값 = D1/D2각 물질마다 특정한 용매 조성에서 얼마나 멀리 이동한가를 나타낸다.이 값이 근접하거나 같으면 이 물질이 동일한 물질임을 알 수 있는 지표이다.Rf 값은 용질이 이동한 거리(D1)를 용매가 이동한 거리(D2)로 나눈 값으로 정의한다.-Rf값의 경향① 용매와 같은 극성의 것이 Rf 값이 크다② 분자량이 작은 것이 같은 조건에서 Rf값이 크.③ 입자와의 친화력이 작은 쪽이 Rf 값이 크다.*아미노산 (TLC 용매의 pH 영향)- 아미노산의 종류에 따라서 알파탄소에 결합된 곁사슬 또는 R기가 서로 다르다.- pH8 수용액 내에서의 아미노산은 주로 쌍극성 이온들이다. 이것은 일반적으로 세포내의 pH에서 아미노산이 어떻게 존재하는지를 알려준다. -NH2는 하나의 양성자를 받아 -NH3+가 되고 -COOH는 양성자를 내주어 해리된 -COO-가 된다. 산성용액과 짝염기는 완충용액으로서 작용하여 사과 염기가 첨가될 때 pH가 변화하는 것을 막기 때문에 중요한 생물학적 완충용액이다.- 비극성 곁사슬을 가지는 아미노산은 소수성인 반면에극성 곁사슬을 가지는 아미노산들은 친수성이다.- 산성의 아미노산들은 곁사슬에 카르복실기를 함유한 아미노산을 가지고 세포속의 pH에서 카르복실기 해리되어 R기는 (-)전하를 띤다.- 아미노산의 구조아미노산의 기본구조비극성 곁사슬을 가진 아미노산Glycine 중성. (R의 구조식 -H)Phenylalanine, 방향족 .(R의 구조식 - CH{} _{2}-Phenyl기(C{} _{6}H{} _{5}))전하를 띠지 않는 극성 아미노산Tyrosine, 방향족, (R의 구조식 - CH{} _{2}-Phenyl기(C{} _{6}H{} _{5})-OH)Threonine, (R의 구조식 - CH{} _{3}-CH(OH))* ninhydrin 발색법C9H6O4. 분자량 178.14. 아미노산이나 펩티드의 검출 및 정량을 위한 닌히드린반응에 사용하는 시약. 아미노산과 반응하여 청자색을 띤다. 닌히드린은 1,2,3-인단트리온 모노히드라드와 평형에 있고 후자는 아미노기와 반응성 시프염기를 형성한다닌히드린 반응[ Ninhydrin reaction ]닌히드린은 아미노산의 아미노기에 완만한 산화제로 작용하여 닌히드린 2분자와 아미노산의 아미노기의 질소분자와 결합하여 보라색 색소를 생성한다.따라서 닌히드린 반응을 통해 아미노산 용액은 청자색을 띠게 된다.3. 실험 재료TLC Plate -> 뒷면은 유리 앞면 실리카겔이 코팅되어 있는 얇은 막 판물이나 에탄올로 녹인 0.1M 아미노산 용액(Glycine, Tyrosine, Phenylalanine, Threonine, Mix 용액(2가지a.a혼합)),2% ninhydrin 용액 (in acetone)-> ninhydrin을 아미노산의 수용액에 가하면 청자색으로 변하는 닌히드린 반응(ninhydrin reaction)을 이용하여 발색시약으로 사용한다.TLC 용매(에탄올:아세트산 /90:10), Hot plate(전열기.가열판. 건조에 이용한다)4. 실험 방법1) TLC plate를 준비한다. (10cm x 10cm). plate 표면이 긁히지 않도록 손을 대지 않도록 조심하며 아래로부터 2cm 지점에 연하게 연필로 선을 표시한다.2) 선 (start line이다) 위에 적당한 간격인 1cm으로 9개의 점을 찍는다.3) 준비한 아미노산 용액 중 Glycine 0.1M 용액을 0.05, 0.01M로 희석한다. 0.1M Phenylalanine 용액과 Threonine 용액도 0.05M으로 각각 희석한다.4) 4개의 Mix 용액 중 하나인 D 용액을 선택하여 준비한다.5) TLC 판에 표시한 점 위에 아미노산 용액과 미지시료를 1μl 양으로 (Gly0.1M-Tyr0.1M-Phe0.1M-Thr0.1M-Gly0.05M-Gly0.01M-Phe0.05M-Thr0.05M-MixD0.1M 순으로) 점적한 후 plate를 건조시킨다.6) Beaker에 TLC plate의 아래 부분이 충분히 잠길 정도의 TLC 용매를 넣고, filter paper로 용기의 내부를 둘러서 용매를 흡수하도록 한다. wrap으로 덮은 후 포화시킨다.7) TLC PLATE를 용기에 덮고 EN껑을 덮은 후 용매를 약 85% 정도 높이까지 전개 시킨다.8) 전개가 완료된 후 TLC plate를 꺼내서 용매가 이동한 거리를 연필로 표시하고 hot plate에 완전히 건조될 때까지 기다린다.9) TLC plate를 hood로 옮긴후 ninhydrin 용액을 뿌린다.완전히 말린 후 hot plate에서 가열하여 발색한다. 아미노산은 청보라색으로 나타난다. 발색된 부위의 중심을 연필로 표시한다.10) 출발선에서부터 용매가 이동한거리, 각각 아미노산 물질이 이동한 거리를 측정한 후 Rf 값을 계산하여 미지시료에 포함된 아미노산을 동정한다.5. 실험 결과결과 : 발색된 TLC plate의 모습Gly 0.1M-Tyr 0.1M-Phe 0.1M-Thr 0.1M-Gly 0.05M-Gly 0.01M-Phe 0.05M-Thr 0.05M-D0.1M순으로 1μl씩 로딩하여 발색한 결과이다.a.Rf값 (Rf = D1/D2 (용질이 이동한 거리(D1), 용매가 이동한 거리(D2)))자로 재어 출발선으로부터 용질이 이동한 거리와 용매가 이동한 길이를 재었을때,시료Gly0.1MTyr0.1MPhe0.1MThr0.1MGly0.05MGly0.01MPhe0.05MThr0.05MMix D 0.1M전개된길이(cm)0.82.72.71.20.70.62.71.22.9,0.8Rfvalue0.130.450.450.20.120.100.450.200.48,0.13b.희석에 따른 μg 단위 측정 (아미노산 동정)Glycine 0.1M을 1μl로 점적했으므로(1mol = 75.07g)0.1μmol/μl x 75.07μg/μmol=7.507μg/ulTyrosine0.1μmol/μl x 191.19μg/μmol=19.119μg/ulPhenylalanine0.1μmol/μl x 165.1μg/μmol=16.51μg/ulThreonine0.1μmol/μl x 119.12μg/μmol=11.912μg/ul6. 논의 및 결론 고찰크로마토그래피 방법 중 얇은 막 크로마토그래피 TLC를 이용하여 아미노산 용액을 TLC 전개용매를 통해 분리하고 분석하는 실험이었다. 우리가 쓴 TLC plate는 얇은 실리카겔이 도포된 유리판이었으며, 전개 시료(이동상)로 Glycine, Tyrosine, Phenylalanine, Threonine, 그리고 2가지 아미노산이 섞인 미지 mix 용액을 사용하다.

공학/기술| 2013.09.30| 9페이지| 2,500원| 조회(625)

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