추론이번 실험에서는 두 반응물을 다른 상에 녹여 두 상의 계면에서 중합반응이 일어나게 되는 계면 중합방법을 이용하는 것이다. 두 액은 수용액상과 비수용액상으로 밀도 차로 인해 두 층이 분리 될 것이다. 두 액체의 경계층이 완전히 분리가 되는 것이 보여야 고분자를 뽑아내는 것이 쉬울 것 같다. 두 액을 교반하여 섞으면 고분자의 생성속도가 더 빨라진다고 하는데 교반하지 않았을 때와 교반했을 때의 중합속도를 비교해보고 싶다. 계면에 막대기를 넣고 나일론을 뽑아낼 때 완전히 다 뽑아내지 못한다면 마지막에 무게를 잴 때 이론양과 차이가 날 것 이다.논의 및 고찰Step-growth polymerization에는 Bulk, Solution, Interfacial, Phasetrast polymerization 4가지 반응이 있다. Bulk를 제외한 세 반응은 용매를 사용하는 반응이다. 이 중에서 우리는 Interfacial polymerization 실험을 해보았다. 먼저, 비커에 물과 HMD를 넣고 난 후 Hexane과 SC를 넣는데, 이 때 용액에 튀지 않게 서서히 부어야 하는 주의가 요구된다. 그리고 물에 NaOH를 함께 첨가하는데 이는 부산물로 HCl이 생기면 pH가 낮아짐을 방지하기 위함이다. 또한 헥산을 먼저 넣고 물을 넣는다면 후에 비커에 나일론이 덩어리져서 실처럼 뽑지 못하게 된다는 것을 다른 조가 행하는 것을 통해 알 수 있었다. 두 액체는 밀도 차로 인해 서로 섞이지 않아 계면이 생기는데 이를 핀셋을 이용하여 꺼내면 실처럼 뽑아져 나오는데 이를 Nylon 6, 10이라 한다. 이 때 계면이 사라질 때까지 나일론을 뽑아내야 하는데 정확히 모든 양의 나일론을 건질 수 없기에 약간의 오차가 발생 한 듯하다. 다 뽑아낸 나일론은 물과 아세톤용액에 번갈아 가며 세척을 한 후 오븐에 넣어 건조시켰다. 우리조의 건조된 나일론의 무게는 1.34g으로 이론양 __g과 비교하여 __% 오차가 나오게 되었다. 오차의 원인으로는 시약 준비 시, 헥사메틸렌디아민을 실험값과 약간의 오차가 있는 양을 준비하여 생긴 것 같다.
추론Mark-Houwink-Sakurada 식은 고분자의 분자량과 고유점도의 관계를 나타내준다. 합성한 고분자의 실험값을 통해 식을 이용하여 관계를 알아 볼 것이다. 아마 결과는 분자량이 증가할수록 점도 값이 증가할 것이라 예상이 된다. 점도를 흐름에 대한 저항성이라고 생각해보면 분자량이 높을수록 흐름에 대한 저항성이 증가할 것이다.논의 및 고찰이번 실험의 목적은 고분자의 고유점도를 측정하고 고분자의 분자량과 고유점도의 관계를 이해하는 것이다. 이에 우리는 폴리스티렌 합성실험을 행하였다. 이는 연쇄성장중합을 통해 합성되는 것이다. 개시, 성장, 정지의 3가지 단계를 통해 반응이 일어난다. 스티렌은 매우 반응성이 커서 단독중합체나 공중합체를 쉽게 얻을 수 있는 장점이 있다. 건조기에 말려 무게를 측정하니 6.254g 으로 나왔다. 이론값과 오차가 난 이유는 우선 게시제와 모노머를 따로 넣으면 입자가 작게 나와 좋은 결과 값을 낼 수 있는데, 우리는 같이 넣어서 비교적 굵게 나와 오차가 발생한 듯하다. 또한, 게시제의 양을 정확히 넣지 않은 것도 오차가 발생될 수 있는 요인이다.
1. 천연물 Dehydro-α-Lapachone 합성과 그 이용1. 실험 목적2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone을 출발물질로 사용하여 도미노 Knoevenagel-전자고리화 반응을 통해 다양한 생리활성을 보이는 dehydro-α-lapachone 천연물을 합성한다.실험 반응식2. 이론 및 배경Dehydro-α-lapachone(1)과 α-lapachone(2) 천연물은 중남미 lapacho 나무(학명:Tabebuia avellanedae) 및 일본, 한국, 중국 등에 분포되어 있는 개오동나무 (Catalpa ovata)에서 추출된 천연물로 항균성, 항진균성, 항말라리아, 항암성 등의 다양한 약리활성을 보이고 있다. 특히 이러한 식물에서 추출된 추출액은 중국, 일본 등에서 열병, 황달, 부종 등에 한방 치료약으로 사용하고 있다.이 실험을 통해 자연에서 추출된 천연물을 유기합성을 통해 어떻게 합성하고, 천연물의 합성을 통해 어떻게 의약품 개발에 이용되는지를 알아본다.3. 시약 및 실험장치1) 시약① 2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone,C _{10} H _{6} O _{3}, MW=174.15② 3-Methyl-2-butenal,C _{5} H _{8} O, MW=84.12③ EDDA, Ethylenediamine diacetate MW=180.20④ Methanol2) 장치: 이구 둥근 플라스크(two-neck round-pottomed flask), 일구 둥근 플라스크(one-neck round-pottomed flask), condenser, mass cylinder, stirrer, test tube, column 관, TLC plate, 감압증류기(evaperator)4. 실험방법① 100 mL 둥근플라스크에 혹은 2구 둥근플라스크에 메탄올 (10 mL)를 넣은 후 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone (174 mg, 1.0 mmol)과 3-methyl-2-butenal (92 mg, 1.1 mmol)을 가한다. 마지막으로 EDDA (180 mg, 1.0 mmol)을 넣는다.② 이구둥근플라스크에 condenser를 연결한 후 condenser 윗부분에 질소를 채운풍선을 연결한다.③ 실온에서 1시간 동안 stirring 시킨다.④ TLC를 이용해서 반응 진행여부를 판별한다.⑤ 반응이 완료됐다면 evaperator을 이용하여 silica gel을 넣어 methanol을 증발시킨다.⑥ spatula로 긁어내어 시약종이에 부어 column준비를 한다.⑦ column관의 끝부분을 솜으로 막고, 손가락 세마디 정도 되는 높이만큼 silica gel을 채운다.⑧ Hexane으로 한번 내려준 후, 손가락 한마디 정도 남았을 때, 준비된 반응물을 넣는다.⑨ 적당한 용매를 가해주어 Product만 걸러낸다.⑩ 걸러낸 Product를 일구둥근플라스크에 넣어 Evaperator를 이용하여 용매를 증발시킨다.⑪ 진공을 걸어주어 남아있는 용매를 완전히 증발시킨다.중요: ⑤-⑪는 실리카겔 컬럼그로마토그래피를 통해 순수한 생성물을 분리하는 과정이다.5. 실험 결과 추론dehydro-α-lapachone을 TLC판의 아랫부분에 점을 찍었을 때, 분자량에 따라 작다면 빨리 올라갈 것이고 크다면 느리게 이동할 것이다. 분자들을 구분하는 시약으로 처리하면 특정 색이 발색되거나 형광을 나타낼 것이다.
*lysis : 세균의 세포벽이 파괴되어 내용물이 용액으로 방출된 세균의 용해현상.* cell을 깨는 다른 방법(cell-lysis)·물리적인 방법1) blender에 갈기2) agitation (액체를 휘저음)3) sonication (음파처리) : 20kHz 이상의 파장을 쏘여줄 경우 gaseous cavitation이 형성 되고 형성된 gas bubble이 깨지면서 shock가 일어나 세포가 파쇄되는 원리를 가지고 있다. 주의 사항으로서는 contact time 이 증가할수록 heat, free radical, ion 등이 생성되어 단백질 등을 변성시킬 수 있으므로 반드시 얼음에 고정시킨 상태에서 실험을 하여야 한다.·비물리적인 방법1)freezing-thawing : 여러 번 반복할 경우 세포 내에 형성된 얼음이 membrane leakage 를 유발하게 되어 periplasmic, intracellular protein이나 감염 중인virus particle등이 유출되게 된다. 장점으로는 간단하고 closed system에서 실험이 진행될 수 있으므로 병원성균 실험에 유리하다. 단점으로는 효과가 크지 않아 세포벽을 지니고 있거나 freezing을 막 는 intracellular solute를 지니고 있는 경우에는 부적합하다.2)osmotic shock(삼투압 충격)3)enzyme treatment : enzyme treatment의 방법인 lysis buffer를 이용 시에는 detergent 가 세포막으로부터 protein이나 lipoprotein을 분리시켜 세포내 물질 이 유출되게 한다.4)detergent(세척제)1. 실험 결과EtBr염색약은 자외선을 받아 가시광선으로 파장을 변화시키는 일종의 형광물질로써 푸른빛 계통의 짧은 파장의 빛을 붉은 빛 계통의 긴 파장의 빛으로 바꾸어 내보낸다. 254nm 파장의 UV가 DNA에 부딪힐 때 302~366nm의 파장으로 반사되는데 이 빛은 EtBr에 흡수된 후 590m,정도의 가시광선으로 바뀐다. 즉, gel을 EtBr용액 속에서 staining(염색)하면 EtBr이 DNA 이중나선의 염기 사이에 끼어들어가기 때문에 gel에 자외선을 쬐면 DNA에서 형광색이 나와 눈에 보이도록 해 주는 역할을 한다.2. 고찰우선 실험하기에 앞서 하루 전에 미생물(대장균)을 액체배지에서 배양했다. 배지 안에 플라스미드를 만들기 위해 카나마이신을 넣었다. 3월 23일 오후 3시 30분부터 24일 오전 9시까지 미생물을 키웠다. 4℃, 13000rpm으로 3분간 원심분리를 했다. 튜브에 약간의 고체가 생겼다. 이 고체만을 남겨두고 액체는 버리는데 액체가 튜브에서 잘 빠지지 않아 휴지를 말아 넣어서 남은 액체를 제거했다. solution 1을 고체만 남은 튜브에 넣고 vortex 시켜주었다. 솔루션을 넣을 때 썼던 기구인 마이크로피펫은 처음 써보는데다가 비싸기까지 해서 굉장히 조심스러웠다. vortex를 시켜 준 후 solution2를 튜브에 넣고 inverting했다. 조교님이 끈적해지면서 색이 조금 투명해지신다고 하셨는데 눈에 띄게 끈적해지고 투명해지지는 않아서 분간이 어려웠다. 마지막으로 solution3을 넣으면 미생물이 가지는 지방과 단백질이 하얗게 덩어리지는데 이 덩어리들이 한 덩어리가 되도록 이전단계보다 동작을 좀 더 크게 inverting했다. 이 단계가 lysis 단계라고 하셨다. 그리고 다시 4℃, 13000rpm으로 3분간 원심분리를 한 뒤 새 튜브에 액체 상층액만을 부었다. 액체 상층액에 DNA가 있기 때문인데 덩어리가 들어오지 않게 액체만을 따라내었다. 여기에 99.9% 에탄올을 넣었다. 여기서 에탄올은 DNA를 침전 시키는 과정에 쓰이는데 에탄올이 수용액에 녹아있는 DNA의 solubility를 떨어뜨려서 침전시키는 원리를 이용한 것이다. 또 원심분리를 하고 액체층을 따라내고 휴지를 말아 넣어서 액체를 제거했다. 여기에 약간의 물을 첨가하고 vortex를 시켜주자 파란색으로 변했다. DNA buffer를 넣은 뒤 마이크로피펫으로 약간 뽑아서 cast 안의 홈에 조심스럽게 넣었다. 그리고 전류를 흘려주면 음전하를 띤 분자들은 전기적인 힘에 의해 겔 안에서 이동하게 된다. 겔을 EtBr 용액 속에서 염색하면 EtBr이 DNA 이중나선의 염기 사이에 끼어들어가기 때문에 겔에 자외선을 쬐면 DNA에서 형광색이 나와 눈에 보이도록 해주기 때문에 우리는 형광색을 눈으로 확인 할 수 있었다. 이번 실험은 생소한 실험 기구들도 많고 이론도 우리가 배웠던 내용이 아니라서 이해하는데 시간이 좀 걸렸다. 실험을 할 때는 예비레포트를 썼어도 이해가 잘 안갔었는데 실험을 하고나서 결과 레포트를 쓰면서 실험한 과정을 하나씩 되짚어보니 별로 어려운 내용도 아니였고 그저 생소한 분야여서 낯설게 느껴졌던 것 같다.
1. 실험방법1) 전 날 우리가 만든 cell을 1.5mL Tube에 옮긴다.2) 원심분리기에 4℃, 1300rpm, 3분 동안 원심분리를 시킨다.3) 원심분리가 끝나면 cell의 밑에 부분인 pellet이 생성되고, 그 pellet이 떨어지지 않게 상층액을 최대한 제거 시킨다.4) Sol 1(완충용액)을 100uL만큼 덜어 cell에 넣은 뒤 vortex를 이용해 덩어리를 없애준다.5) Sol 2을 200uL만큼 덜어 cell에 넣은 뒤 inverting(shaking)을 하는데 조금 세게 흔들어 준다. Sol 2는 세포를 깨는 역할을 하고 inverting하고 난 뒤에는 콧물과 같이 끈적해진다.6) Sol 3을 150uL만큼 덜어 넣어준 뒤 Sol 2보다 반경 범위가 더 크게 흔들어 준다.7) 원심분리기에 4℃, 1300rpm, 3분 동안 원심분리를 시킨다.8) 흰색 고체 덩어리가 들어가지 않도록 최대한 조심히 상층액을 새로운 Tube로 옮긴다.(흰색덩어리가 들어갈 경우 Tip을 이용해서 제거도 무방하다)9) 상층액을 옮겨 담은 Tube에 Ethanol 800uL을 넣는다. 그 후 vortex를 이용해 잘 섞는다.10) 원심분리기에 4℃, 1300rpm, 3분 동안 원심분리를 시킨다.11) pellet을 남기고 상층액을 버린다. (NA는 원래 투명하나 우리가 실험한 DNA는 약간의 흰색이 섞어서 잘 관찰 할 수 있다.)12) 10분 동안 기다린 뒤 20uL을 넣고 vortex을 이용해 섞는다.13) 전기 연동을 시킨 뒤 5uL의 DNA buffer을 넣으면 DNA가 가라앉고 파랑색으로 변하면서 위치 확인이 가능하다.14) 0.8% agarose gel : 0.8g of agarose + 100mL 0.5x TBE buffer → boiling → EtBr 2uL(2gel) 첨가 → cast에 넣는다.15) 125V에 15가량 작동 시킨다.16) UV를 통해 확인한다.2. 실험결과UV를 쬐어서 형광으로 DNA를 볼 수 있다.3. 논의 및 고찰플라스미드를 만들기 위해 카나이신 넣기를 미리 행하였다.미리 만들어둔 Harvest cell을 tube에 부은 후 원심분리를 시켰다. 약 3분간 원심분리를 한 후 상층액을 버리고 나면 pellet(미생물)이 남게 된다. 상층액을 완전히 빼낼 수 없어 휴지에 대고 털어야 했는데 이 때 pellet이 나오지 않게 조심하여야 했다. Soln Ⅰ을 넣고 vortex를 이용하여 뭉친 cell이 분리되도록 pellet과 Soln Ⅰ이 잘 섞이게 하였다. Solution을 넣을 때는 마이크로피펫을 이용하였다. 두 번재로 넣은 Soln Ⅱ는 SDS(세제)+NaOH로 세포를 깨는 역할을 한다. 이 과정을 lysis라고 한다. 이는 투명하고 끈적해짐을 확인함으로써 알 수 있다. 세 번째로 넣는 Soln Ⅲ는 크게 덩어리지게 만드는 역할을 하였다. 다시 원심분리기에 넣고 난 후 상층액을 새로운 tube에 넣었다. 그 후 99.9% ethanol을 가하고 vortexing을 하면 DNA가 침전이 된다. 또다시 원심분리를 하고, 이제 흰 덩어리, 즉 DNA를 볼 수 있게 된다. 상층액을 버리고 난 후, pellet을 건조시키고 물을 가하여 vortexing 시키면 물에 DNA가 녹게 된다. 여기에 DNA buffer를 넣는다. 이 방법으로는 전기를 연동하여 DNA 존재여부를 알 수 있다. 또한 글리세롤, 글리코즈는 DNA가 뜨지 않도록 무게감을 주는 역할을 한다. 약 10-15분간 전류를 흘려줌으로써 전기적인 힘으로 인해 분자들이 gel 안에서 이동한다. DNA는 음전하를 띠기 때문에 전극을 걸어주면 +극으로 이동한다. DNA를 크기별로 구분하려면 용액이 아닌 적절한 고체 매질이 필요한데 이 때 agrarose gel을 이용한다. agrarose gel에 DNA를 넣고 전극을 걸어주면 전하에 따라 양극으로 이동한다. gel의 이동속도는 분자량이 감소함에 따라 증가하므로 크기에 따라 분리가 가능하다. DNA는 무색이지만 이 gel을 EtBr로 염색하여 결과를 확인할 수 있다. 이 때 EtBr은 발암물질이므로 장갑을 착용하고 실험을 행하여야 했다. EtBr은 DNA의 염기 사이에 끼어들어가 UV조사시 빛을 발하는 특징이 있다. 또한 전기영동 후에도 염색이 가능하다. 또 다른 확인 방법으로는 메틸렌 블루를 이용하는 것이다. 메틸렌 블루는 전기적으로 DNA와 결합한다. 이 방법을 염색 후 탈색 과정을 거쳐야 하므로 시간이 오래걸리는 단점이 있다.
플라스미드 DNA 추출 결과
