실험제목: Genomic DNA isolation실험목표: DNA isolation에 대한 과정을 이해한다.배양한 Aspergillus 균주로부터 PCR에 사용할 DNA주형 가닥을 뽑아낸다.준비물: CM배지, 비커, pipet(1000lambda , 200lambda , 20lambda ), tip, DW(1), 미라크로스, 핀치, 삼각플라스크, 금속 깔대기, 약수저, 티슈, 액화질소, 라텍스 장갑, 유리사기, 막자, micro tube 6개, tube lac, name pen, Lysis Buffer, micro원심분리기, phenol; chloroform; isoamyl alcohol 시약, 3M 소듐 아세트산염, Ethanol(100% 70%), dry oven, RNase, suction실험과정빈 삼각플라스크 위에 금속 깔대기와 미라크로스를 차례로 올려놓는다.CM배지를 위에 부어 배양된 Aspergillus nidulas 균주의 cell을 걸러낸다.1차 DW를 이용하여 cell을 씻어낸다. (이때 몇 번을 닦아내는가는 실험자의 육안으로 확인할 때 cell에 묻은 배지가 제대로 닦였는지 여부에 따른다. 이 과정은 이후 사용될 완충액의 효율성을 높이기 위해서다.)cell이 담긴 미라크로스의 끝을 오므린 후 바깥 면을 약수저로 눌러 물기를 제거한다.4를 두꺼운 티슈로 다시 한 번 물기를 제거한다. (완충액의 효율성을 높이기 위해)라텍스 장갑을 끼고 비커에 액체질소를 담아 유리사기에 붓는다.물기가 제거된 cell을 넣고 즉시 막자로 갈아낸다.cell 분말을 약수저(작은 수저)로 적당량 덜어 micro tube에 넣는다. (micro tube는 미리 액화질소에 담가놓고 사용 시 핀치를 이용해 꺼내 사용한다.) - [1-1; 1-2; 1-3]8에 확인 가능하도록 표시한 후 액화질소에 담가 냉동시킨다. (약 30min)액화질소로부터 micro tube를 꺼내 상온에서 잠시 놓아둔다. (tube 안의 냉각된 공기가 상온에서 빠르게 온도가 올라가면서 팽창할시 압력에 의해 tube가 터질 위험이 있으므로 꺼낸 즉시 뚜껑을 열어놓도록 한다.)Lysis Buffer 500lambda (pipet 1000lambda )를 micro tube에 넣는다.cell분말과 Buffer가 잘 섞일 수 있도록 pipeting을 한 후 뚜껑을 닫는다.micro원심분리기로 1분 정도 돌린 후 heating block (65℃)에서 배양한다. (약 1hour)heating block에서 꺼내 상온에 두고 10분마다 조금씩 흔들어준다. (가만히 두면 세포가 가라앉아서 용해가 제대로 일어나지 않는다.)액체질소는 196℃로 이 액체에 cell이 들어가면 cell의 모든 세포소기관과 함께 각 세포소기관 속에 존재하는 효소들도 얼어 그 작용을 멈추게 된다. 세포소기관 중 리소좀에는 핵산가수분해효소가 있는데 온도가 올라가면 다시 효소의 활성이 높아져 DNA가 모두 분해되어버리기 때문에 위 실험을 수행할 때는 사용하는 micro tube도 액체질소에 담가 사용해야하고 모든 과정을 신속히 진행해야한다.(입속에 nuclease가 들어있어 DNA가 분해될 가능성이 있으므로 이 과정을 수행할 때는 되도록 대화를 하지 않는다.)micro tube의 뚜껑을 열어 lac에 꽂아놓는다.phenol; chloroform; isoamyl alcohol 시약병의 뚜껑을 열고 500lambda (pipet 1000lambda )을 따서 micro tube에 넣는다. (위 시약은 휘발성이 강해 다른 물질로 덮여있으므로 tip 끝을 시약 층에서 좀 더 깊숙한 곳에 두고 딴다. 이때 시약병은 바닥에 놓고 두 손으로 pipet을 잡고 병 입구에 닿지 않도록 조심하여야 한다.)tip을 먼저 버리고 시약병을 뚜껑을 닫는다.micro tube의 뚜껑을 닫고 두 차례 흔들어 준 후 상온에 둔다. (30min)micro tube의 뚜껑을 문질러 내용물이 세는지 확인 한 후 원심분리기로 돌린다. (25℃, 13000RPM, 15min)원심분리기에서 꺼낸 후 상층액 300lambda (pipet 200lambda )을 새 micro tube에 옮긴다. [1-1‘; 1-2’; 1-3‘]페놀은 방향족성의 고리에 히드록시기가 결합한 화합물의 총칭으로 진핵생물의 DNA에는 녹이지 않고 DNA를 감싸는 히스톤 단백질만 녹이는 성질을 가지고 있다. 이 성질을 이용하여 순수한 DNA를 정제하기 위해 위 시약을 사용한다고 한다.3M 소듐 아세트산염 30lambda (6의 10%, pipet 20lambda )를 micro tube에 넣는다.1에 Ethanol (100%) 660lambda `(pipet 1000lambda )를 넣는다.-70℃에서 저장한다. (30min)원심분리기로 돌린 후(4℃, 13000RPM, 10min) 상층액을 제거한다.(pipet 1000lambda )4에 Ethanol (70%) 1㎖ (pipet 1000lambda )을 넣는다.원심분리기로 돌린 후(4℃, 13000RPM, 10min) 상층액을 제거한다.(pipet 1000lambda )dry oven에서 물기가 마를 때까지 말린다.4,6 과정에서 원심분리기에 넣을 때 micro tube의 뚜껑 고리를 바깥쪽으로 향하게 넣고 돌린다.이후 상층액 제거 시, micro tube의 뚜껑 고리와 반대쪽으로 tip을 넣도록 한다.원심력에 의해 핵산이 micro tube의 뚜껑 고리 쪽으로 치우치게 되기 때문이다.3M 소듐 아세트산염- DNA 인산기의 음전하와 결합되어 있는 물 분자를 떼어내고
