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clinical trial and informed consent (연구윤리, 임상실험, 임상실험 동의서)

Comparative Effectiveness Trials and Informed Consent목차 Historical introduction Comparative Effectiveness Research 3 options for CE RCTs Comparing ModelsHistorical Introduction Prior to mid 1960s, RCTs routinely conducted without informed consent Streptomycin Trial (1947) : Patients not informed that they were participating in a clinical trial Sham Surgery Trial : No mention of randomization or use of sham procedure to evaluate real surgeryHistorical Introduction 1962 : Congress directed FDA to require IC for studies of “investigational new drugs” 1966 : based on research scandals, NIH mandated IC to clinical research and oversight by Institutional Review Boards (IRBs) IC with detailed written consent documents became standard practice for RCTsComparative Effectiveness Research Most new drugs approved by FDA on basis of placebo-controlled trials, with narrowly defined patient eligibility criteria Limited rigorous data to support choice between approved drugs in routine practice Growingstitutional Promotion of CER RCTs NIH Collaboratory (2006 ) Supports “the design and rapid execution of several high-impact pragmatic clinical trial demonstration projects.” Patient-Centered Outcomes Research Institute Established 2010 under Affordable Care Act Mandate : “improve the quality and relevance of evidence available . . . to make informed health decisions.” Funds CER projectsElements of IC Study involves research; description of research procedures Reasonably forseeable risks/discomforts Anticipated benefits to subjects Alternatives Protection of confidentiality Whom to contact to answer questions Participation voluntary, no penalty for refusal or dropping outBurden of IC Detailed IC in accordance with required elements arguably impedes performance of needed CE RCTs Reluctance of physicians to disclose randomization and patient refusal of IC can introduce selection bias3 options for CE RCTs “ regulatory consent”: detailed written consent conforming to federal regulations Waiith consent to treatmentWaiving IC for some RCTs? Truog et al: “Is informed consent always necessary for randomized controlled trials?” Waiving IC should be permitted when treatments being compared are medically indicated and have similar risk-benefit profiles Recently , renewed interest in waiving IC for some CE RCTs in context of “ learning health care system”IC and Respect for Persons Argument : waiving IC for treatment RCTs violates respect for persons Respect : vague and capacious norm Need to unpack and specify respect for context of receiving medical care in RCTs Useful source of guidance in Charles Fried’s (1974) account of “the system of rights in personal care” in Medical ExperimentationFried First systematic account of ethics of RCTs • Major concern with practice of conducting RCTs in guise of medical care w/o IC Fried sees RCTs w/o IC as form of “deceit,” violating legitimate expectations to personal carePersonal Care Package of legitimate expectations (rights) of patients Fidelity HumanityTransparency Obligation of physicians to inform patients about relevant facts concerning their medical condition and discuss recommended treatment plan Informing component of ICAutonomy Patient given opportunity to decide whether or not to accept doctor’s recommended treatment plan Making treatment plan consistent with patient’s preferences and values emerges out of transparent communication and opportunity to authorize planFidelity Doctor’s orientation to promoting medical best interest of individual patient and patient’s legitimate expectation that recommended treatment will be guided by this orientation Fidelity underwrites trustworthiness of doctor and patient’s trustHumanity Responsibility of clinicians to care for and care about particular patients In contexts such as medical care, “a person has a right to have his full human particularity taken into account by those who enter into relations to him”Comparing Models No consent No consent Adversely affects rights (oes not adversely affect rights: qualifies as valid consent Regulatory consent would not be practicable for many pragmatic CE RCTs문제 ( 정답 빨간색 ) 1 번 . Streptomycin Trial 은 Informed consent 가 사용 되었다 (T/ F ) 2 번 . Sham Surgery Trial 은 Informed consent 가 사용 되었다 (T/ F ) 3 번 . 1962 년 의회에서 새로운 약물 개발 시 Informed consent 를 사용하라고 지시한 곳은 : 1.FDA 2.FBI 3.IRB 4. WHO문제 ( 정답 빨간색 ) 4 번 . CE RCT 에서 Informed consent 를 사용하도록 권장한 곳은 ? ( 정답 2 개 ) 1. NIH 2. Patient-Centered Outcomes Research Institute 3. IRB 4. WHO 5 번 . Informed consent 의 구성요소가 아닌것 1 . 절차 설명 2. 질문이 생기면 답해 줄 사람 3. 위험성 설명 4. 중도 포기 금지문제 ( 정답 빨간색 ) 6 번 IC 가 너무 상세히 기술하게되면 힘들다 . ( T /F) 7 번 CE- RCT 의 세가지 option 을 고르시오 1. regulatory consent 2. Waiving consent 3. verbal consent 4. option 없음 8 번 “the system of rights in personal care” in Medical Experimentation 와 관련된 사람을 고르시오 1. Fried 2.obama 3.clinton 4. Mohamed Hussain문제 ( 정답 빨간색 ) 9 번 Fried 는 IC 가 없는 RCT 에 대해 무엇이라고 보았는가 ? 1. deceit 2. Transparency 3. Fidelity 4. Humanity 10 번 Fried 의 Personal Carhow}

의/약학| 2017.03.17| 22페이지| 4,000원| 조회(145)

의학, 서울대, 의대, 임상실험, 연구윤리, 동의서, Informed Consent, clinical trial

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HBV의 detection 방법 논문 발표

닭의 serum 과 liver 에서 HBV 의 detection.HBV 란 ? 닭의 serum 에서 HBV marker 의 발견 닭의 간에서 면역조직화학염색 사람과 닭의 HBV DNA 서열 비교 Conclusion 목차Genome:circular DNA Serologic marker: Viral antigen:surface antigen, HBsAg (screening 에 많이 쓰임 ), e antigen, HBeAg (infectivity 지표 ) Antibody:anti -HBs, anti- HBc , anti- Hbe 감염은 사람이 아닌 영장류에도 일어남 . HBV 란닭의 serum 에서 HBV marker닭의 간에서 면역조직화학염색닭의 간에서 면역조직화학염색사람과 닭의 HBV DNA 서열 비교HBV 의 감염방법 : Neonatal transmission Drug injection Sexual activity Occupational activity 기타 등등 그러나 20~30% 는 risk factor 가 없다 . ConclusionChicken 의 serum 과 liver 에서 HBV 가 발견됨 이 HBV 가 사람의 HBV 와 같음을 확인 Chicken 으로 만든 제품으로 HBV 감염의 위험이 있다 . Conclusion{nameOfApplication=Show}

의/약학| 2017.03.17| 9페이지| 3,000원| 조회(72)

Virus, 바이러스, 임상병리, 임상병리학, HBV, 바이러스학, 논문 발표, 비형..

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혈액학 레포트 PT, aPTT 실습 보고서입니다.

혈액학 실습레포트(PT,aPTT검사)실험 원리:1.PT란 프로트롬빈 시간 측정으로 plasma에 tissue thromboplastin과 칼슘을 넣게 되면 외인계인자들의 관여로 thrombin이 형성되고 fibrinogen이 fibrin으로 전환되어 clotting이 일어나게 된다.2.aPTT란 활성부분 트롬보플라스틴시간으로 Thromboplastin(phospholipid를 주성분으로 하는 것)과 활성제를 첨가하였다. 이로 인해 위와 다르게 내인계 응고계를 주로 반영하게 된다.실험 방법(1500rpm에서 15분간 원심분리 시킨 plasma이용)1.PT: plasma와 PT시약을 1분간 incubation 시킨 후 sample cuvette에 PT시약을 200람다를 넣는다. 그 후 GO-S가 뜨면 plasma 100람다를 cuvette에 넣는다.2.aPTT: CaCl2를 최소 2분간 incubation 하고 sample cuvette에 aPTT시약 100람다와 plasma 100람다를 넣고 sample cuvette을 넣으면 자동으로 incubation 된다.GO-S가 뜨면 CaCl2 100람다를 큐벳에 넣으면 자동시작된다.실험 결과1.PT: 14.2S, 2.aPTT:43.2S참고치: 사용하는 시약의 종류에 따라 다르지만 PT는 10~13초사이가 많고 2초 이상일 경우 이상이며 aPTT의 경우 30~45초 사이가 많다.고찰이번 실습은 내인계와 외인계의 응고인자 이상을 알아보는 실험으로 기계의 원리는 다양하지만 이번 실습기계의 원리는 자석과 큐벳 밑에 있는 조그만 비드를 이용하여 clotting이 되었는지 확인하는 원리를 이용하는 기계였다.실습시 주의사항은 채혈시에 tube에서 더 이상 음압으로 혈액이 더 이상 빠져나오지 않을 때 까지 기다리고 있어야 하는데 이는 tube에 존재하는 sodium citrate를 1:9의 비율로 혼합하여 plasma를 이용해야 하는데 이 비율이 맞지 않게 되면 PT,aPTT 시간이 연장되게 된다. 그 이유는 항응고제로 인해 응고인자가 activation이 되도 작용을 정상적으로 하지 못하게 되므로 연장이 되는 것이다.

의/약학| 2017.03.17| 2페이지| 2,000원| 조회(777)

실험, 임상병리, pt, 실습, HEMATOLOGY, 임상병리학, 혈액응고, 혈액학, aPTT

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산과 염기 에 관한 피피티 발표자료입니다.

Chapter15. 산과 염기산 (acid) : 물에서 수소이온 , H⁺ 을 생성하는 물질 염기 (base) : 용액 내에서 수산화이온 , OH⁻ 을 생성하는 물질 15.1 산과 염기의 성질pH 척도 : 어떤 용액의 산도나 염기도를 나타낸다 . 산성 pH7 pH7= 중성 pH7 염기성 pH 척도산이나 염기가 첨가되더라도 pH 변화가 일어나지 않는 용액 구성 : 약한 산 + 약학 산의 염 EX) 시트르산 (citric acid) 과 시트르산나트륨 (sodium citrate) 으로 이루어진 수용액 완충용액아레니우스 산 : 물에서 이온화되어 H⁺ 을 생성하는 물질 아레니우스 염기 : 물에서 해리하여 OH⁻ 을 내놓는 물질 이온화 (ionization): 극성화합물내의 분자가 양이온과 음이온을 형성하는 과정 해리 (dissociation) : 이온화합물 내에 존재하는 이온이 단순히 분리되는 과정 15.2 Arrhenius 산과 염기산의 세기는 이온화에 따라 결정 HCl ( aq ) + H₂O(l) H₃O⁺( aq ) + Cl ⁻( aq ) (~100%) HC₂H₃O₂( aq )+H₂O(l) H₃O⁺( aq )+C₂H₃O₂⁻( aq ) (~1%) H₃O⁺ : 하이드로늄 이온 아레니우스의 강한 산과 약한 산염기의 세기는 해리도에 따라 결정 NaOH ( aq ) Na⁺( aq ) + OH⁻( aq ) (~100%) NH₄OH( aq ) NH₄⁺( aq ) + OH⁻( aq ) (~1%) 아레니우스의 강한 염기와 약한 염기산이 염기를 중화하면 염과 물이 생성된다 . EX) HCl ( aq ) + NaOH ( aq ) NaCl ( aq ) + H₂O(l) 산의 종류를 달리하면 생성되는 염의 종류도 달라진다 . EX) H₂SO₄( aq ) + 2NaOH( aq ) Na₂SO ₄( aq ) + 2H₂O(l) 아레니우스의 산과 염기로부터 어떤 염이 생성되는지 확인할 수 있다 . ∵ 각각의 염의 구성이 염기에서 나온 양이온과 산에서 나온 음이온으로 되어있기 때문 중화반응15.3 브뢴스테드 - 로우리 (BrΦnsted-Lowry) 산과 염기 브뢴스테드와 로우리는 산을 수소 이온 주개로 정의하였다 . 수소 이온을 어떤 다른 물질에게 주는 물질을 산이라고 하였다 . 수소 이온을 받아들이는 모든 물질을 염기라고 하였다 . 브뢴스테드 - 로우리 산 = 양성자 주개 (proton donor) 브뢴스테드 - 로우시 염기 = 양성자 받개 (proton acceptor) 양성자를 줄 수도 받을 수도 있는 물질을 양쪽성 (amphiprotic) 이라 한다 . Ex) H 2 O ( l ) + H 2 O ( l ) → H 3 O + (aq) + OH - (aq)15.4 산 - 염기 지시약 pH 에 따라 예민하게 변색하는 물질을 산 - 염기 지시약 (acid-base indicator) 이라고 한다 . 표 15.4 산 - 염기 지시약 지시약 변색 색깔 메틸 레드 pH ~5 pH 5 이하 : 적색 pH 5 이상 : 황색 브롬티몰 pH ~7 pH 7 이하 : 황색 블루 pH 7 이상 : 청색 페놀프탈 pH ~9 pH 9 이하 : 무색 레인 pH 9 이상 : 분홍색15.5 산 - 염기 적정 적정 (titration) : 가해진 용액의 부피를 구하여 농도를 결정하는 과정 종말점 (endpoint) : 적정에서의 변색점 Ex) 10.0 mL 식초 시료 중의 아세트산의 중화에 0.223 M NaOH 37.55mL 가 소 모 HC ₂ H ₃ O ₂ ( aq ) + NaOH ( aq ) → NaC ₂ H ₃ O ₂ ( aq ) + H ₂ O(l) 1. NaOH 몰농도 37.55mL ☓ 0.223molNaOH/1000mL = 0.00837molNaOH 2. 아세트산 몇 mol? 0.00837molNaOH ☓ 1molHC ₂ H ₃ O ₂ /1molNaOH = 0.00837molHC ₂ H ₃ O ₂ 3. 아세트산 몰농도 0.00837molHC ₂ H ₃ O ₂ /10mL ☓ 1000mL 용액 /1L 용액 = 0.837molHC ₂ H ₃ O ₂ /1L 용액 = 0.837M HC ₂ H ₃ O ₂ 4. 질량백분율 농도전환 0.837molHC ₂ H ₃ O ₂ /1000mL ☓ 60.06gHC ₂ H ₃ O ₂ /1molHC ₂ H ₃ O ₂ ☓ 1mL 용액 /1.01g 용액 ☓ 100% = 4.98%HC ₂ H ₃ O ₂15.6 산 - 염기 표준화 표준용액 (standard solution) : 농도가 정확히 알려진 용액 ex) 0.223M NaOH ☞ 특정한 물질을 분석하기 위하여 사용 Ex) HCl 표준화 0.375g 의 Na ₂ CO ₃ 를 중화하는데 염산 25.50mL 가 필요하다고 할 때 , 이 염산의 몰 농도 ? 2HCl( aq ) + Na ₂ CO ₃ ( aq ) → 2NaCl( aq ) + H ₂ O(l) + CO ₂ (g) 1. HCl 몰수 0.375gNa ₂ CO ₃ ☓ 1molNa ₂ CO ₃ /105.99gNa ₂ CO ₃ ☓ 2molHCl/1molNa ₂ CO ₃ = 0.00708molHCl 2. HCl 몰농도 0.00708molHCl/25.5mL ☓ 1000mL 용액 /1L 용액 = 0.277molHCl/1L 용액 = 0.277M HCl15.7 물의 이온화 - 열쇠가 전도 장치를 완전한 회로를 이루게 하여 전구가 켜짐 - 금속 원자들은 그들의 전자를 느슨하게 잡고 있다 - 전자가 원자에서부터 원자로 이동하는 것과 같이 전기가 금속 열쇠의 한쪽 끝에서 다른 끝으로 흐른다 .15.7 물의 이온화 - 물 한 분자로 부터 다른 물 분자로 이동 시키기가 여렵다 - 순수한 물에서 전기가 약간통하는 현상 순수한 물에 이온이 존재하기 때문15.7 물의 이온화 충돌 반응에 대한 화학 반응식 -H₂O(l) + H₂O(l) →H₃O⁺( aq ) + OH⁻( aq ) 물의 이온화 - H₂O(l) → H⁺ ( aq ) + OH⁻( aq )15.7 물의 이온화 순수한 물에서 수소 이온 농도 : 25 ˚C 에서 1.0 x 10 ⁻ ⁷ mol/L 수산화 이온 농도 : 25 ˚C 에서 1.0 x 10 ⁻ ⁷ mol/L15.7 물의 이온화 - 물의 이온화 상수 : H⁺ x OH⁻ k w = [H⁺] x [OH⁻] -[H⁺] 와 [OH⁻] 는 반비례 , kw 값은 일정 - 모든 수용액에서 [H⁺] x [OH⁻] 의 곱 = 물의 이온화 상수 - 물의 이온화 상수값 = [H⁺] x [OH⁻] =1.0 x 10⁻¹⁴15.8 pH 개념 [H⁺] 를 pH 로 변환 pH = -log [H⁺] pH 를 [H⁺] 로 변환 [H⁺] =10 ⁻ pH15.9 고급 PH 계산 [H+] 를 PH 로 변환시키기 -log 를 취한다 . PH 를 [H+] 로 변환시키기 -10 의 제곱형태로 변환시킨뒤 계산15.10 강한전해질과 약한 전해질 강한전해질 - 수용액이 강한 전도체일때를 말한다 ( 많은 이온화 )( 이온물질 ) 약한전해질 - 수용액이 약한 전도체일떄를 말한다 .( 적은 이온화 )( 비이온물질 )15.11 알짜 이온반응식 전체 이온반응식 - 이온반응식에서 용액에 존재하는 물질 모두 나타나는식 구경꾼 이온 - 이온반응식에서 반응하지 않고 그냥 그대로 있는 이온 알짜 이온반응식 - 이온반응식에서 실제로 반응에 참여하는 물질만을 나타내는 반응식{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2013.06.03| 21페이지| 4,000원| 조회(209)

일반화학, 임상병리, 산과염기, 을지대, 신재호

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DNA sequencing방법에 관한 피피티

Genomic DNA 의 분리 및 정제 사용시약 차가운 증류수와 1.8% NaCl Phosphate-EDTH butter(PEB)8.47g, NaCl 3.69g, Na₂HPO₄3.35g, EDTA.2Na, pH 7.2 5% Dextran solution; 5g Dextran (Sigma, D-5251, PEB 100mL 에 녹인것 10% SDS(sodium dodecylsulfate ) Proteinase K(20mg/mL0 WBC Lysis 완충액 (10mM tris , pH 7.6, 50mM NaCl , 10mM EDTA) Ethanol, 70% EthanolWBC 의 분리 .1 10mL 전혈에 3mL 의 5% dextran 을 가하고 충분히 혼합한 후 실온에 20 분간 세워둔다 . RBC 는 끼리끼리 뭉쳐 빨리 침강하고 WBC 는 아직 침강하지 못하고 혈장층에 남아있다 . ( Dextran 은 긴 탄수화물 중합체로서 RBC 들을 서로 엉기게 하여 무겁게 하고 이 때문에 원래의 침강속도보다 훨씬 빠르게 침전시킨다 . 반면에 용매의 비중을 높여 주기 때문에 WBC 의 침강속도는 느려진다 .)WBC 의 분리 .2 혈장 층을 조심스럽게 취해 새 튜브에 옮기고 1000x g, 5 분간 원심분리한다 . 침전물에 6mL 의 차가운 증류수를 가하고 20 초간 진탕하여 풀고 바로 동량의 차가운 1.8%NaCl 을 가하여 혼합한다 . 차가운 증류수를 가하고 너무 오래 (30 초 이상 ) 방치하면 WBC 도 파괴된다 . 만약 시약들이 차갑지 않으면 RBC lysis 가 완벽히 일어나지 않으므로 항상 얼음에 놓고 사용하도록 한다 .WBC 의 분리 .3 1000x g, 5 분간 원심분리 한다 . 상층액을 버리고 침전물을 관찰하여 노르스름한 WBC 만 보일때까지 이전의 차가운 증류수를 가하고 1.8% Nacl 을 혼합하는 과정을 반복한다 ( 보통 1~2 회 정도면 깨끗한 침전물을 얻을 수 있다 .)WBC 로부터 genomic DNA 의 추출 정제 .1 (1X10 ⁷ cell 이상를 담아둔다 . (DNA 희석용 멸균 증류수와 blank 용 멸균 증류수는 같은 병의 것이어야 한다 . DNA 정량에 사용되는 증류수는 3 차 증류수를 사용하는데 이는 제조한 날짜와 보관 용기에 따라 260nm 에서 흡광도의 차이를 보일 수 있다 .)DNA 정량 .2 피펫 tip 끝을 잘라 구멍을 크게한다 . 이 tip 을 이용하여 담아놓은 튜브 속의 멸균 증류수를 5 μ L 흡입한다 . Tip 위에 가는 펜으로 5 μ L 의 눈금을 표시한다 . 멸균 증류수를 버리고 눈굼까지 DNA 를 취한다 . 5 μ L 이 제거된 증류수 튜브에 (995 μ L) 5 μ L DNA 를 넣고 잘 혼합한다 . ( 고분자의 DNA 는 매우 점도가 높기 떄문에 소량의 DNA 를 취할 떄 정확한 부피를 취하기 어렵기 떄문에 구멍이 큰 tip 을 사용한다 .)DNA 정량 .3 멸균 증류수 blank 로 260nm 에서 영점을 맞추고 test beam 의 큐벳을 멸균 증류수로 씻은 후 검체를 잘 혼합하여 큐벳에 넣고 230nm, 260nm, 280nm 그리고 325nm 에서 흡광도를 읽는다 . 325nm 에서 흡광도가 없고 230nm 의 흡광도가 280nm 에 비하여 80~100% 이며 A 260 /A 280 의 비가 1.7 이상이면 A 260 의 값에 10 을 곱한것이 DNA 의 농도이며 단위는 μ g/ μ L 이다 .DNA 정량 .3 (230nm 는 검체 내의 유기용매의 오염여부를 측정하며 260nm 는 핵산의 양을 280nm 는 단백질의 양을 325nm 는 용매로 사용한 멸균 증류수의 오염도를 측정한다 . DNA 는 OD 260 1.0 이 50 μ g/ mL 의 농도이므로 DNA solution 5 μ L 을 멸균 증류수 995 μ L 로 희석 (200 배 ) 하여 OD 를 측정하면 OD X 50 μ g/ mL X 200( 희석배수 )=OD X 10000 μ g/ mL =OD X 10 μ g/ μ L)각 구역의 PCR.1 검체당 10 개의 튜브를 준비하고 다음과 같이 master 준비한다 . 작은 유리판에 Sigma-coat® 1mL 를 뿌리고 Kimwipes 로 고루 바른다 ( 실리콘 처리된 유리판 때문에 전기영동 후 겔의 분리가 쉽다 )PAGE 판 만들기 .2 10 분간 공기 중에 말리고 70% 알코올을 분사하여 가볍게 닦아낸 후 10 분간 충분히 말린다 (Sigma-coat® 를 보다 고르게 유리판에 바르기 위한 단계이다 . 알코올은 이 시약을 녹이기 때문에 너무 많은 양을 사용하면 애써 바른 코팅효과가 제거될수 있다 .)PAGE 판 만들기 .3 0.4mm spacer 를 사용하여 샌드위치를 위한 유리판을 결합하고 양옆과 하단면을 sequencing 용 접착테이프로 액체가 새지 않도록 접착하여 막는다 . 대형집게를 이용하여 양쪽 spacer 위를 압박하여 유리판 사이의 두께가 0.4mm 를 유지하도록 고정한다 . 유리판 샌드위치를 고정판을 사용하여 45 도 정도 기울여 설치한다 .PAGE 판 만들기 .4 다음과 같이 urea 를 포함하는 DNA 용 변성 -PAGE 용액을 만든다 (8% polyacrylamide (19:1, acrylamide : bis-acrylamide ), 7M urea) (8% PAGE 는 6% 보다 각 밴드 사이의 거리가 좁아져 많은 염기서열을 판독할 수 있다 . Acrylamide 7.6g Bis-acrylamide 0.4g Urea 42g 20x Glycerol tolerance 완충액 5mL H 2 o To 100mL 0.45 μ m pore 주사기 용 여과기를 이용하여 여과한다PAGE 판 만들기 .5 10%ammonium persulfate 을 1mL 가하여 혼합하고 TEMED 를 25 μ L 을 가한 다음 즉시 유리판 사이에 붓는다 . 유리판의 사이가 매우 얇기 때문에 50mL 주사기에 18G 주사바늘을 사용하면 쉽게 제조할 수 있다 .PAGE 판 만들기 .6 유리판을 수평으로 뉘어 놓고 “shark-tooth(Saw-tooth)” comb 의 수평면을 샌드위치에 3~5mm 정도 삽입하여 하나의 equencing 반응 .4 반응액 준비 ( 반응완충액은 효소의 반응 조건을 위한 것이며 프라이머는 PCR 에 사용하였던 것을 그대로 사용하여도 좋으나 가능하면 PCR 증폭산물의 내측에 결합하는 것이면 더 좋다 . 프라이머는 반드시 하나만을 사용하여 한쪽 방향의 산물만을 만들도록 해야 한다 . 사용시약 사용부피 Reaction 완충액 2 μ L DNA(PCR 후 정제된 것 ) ㅁ μ L(=100fmols) Primer(0.5pmol/ μ L) 1 μ L H ₂ O Up to 18 μ L ThermoSequenase (4U/ μ L) 2 μ LDNA sequencing 반응 .5 Cycling termination reaction 4.5 μ L reaction mixture 를 각각의 A, G, T, C 튜브에 분주하고 즉시 혼합한다 . 가볍게 원심분리한다 . PCR 기기에 설치하고 다음과 같이 반응을 진행한다 - dGTP 를 사용한 경우 :[95 ℃ -30 초 ,55 ℃ -30 초 ,72 ℃ -30 초 ]:30 회 - dITP 를 사용한 경우 : :[95 ℃ -30 초 ,55 ℃ -30 초 ,60 ℃ -5 분 ]:30 회DNA sequencing 반응 .5 ( 가장 좋은 결과는 단 한번의 Sanger 반응을 통하여 얻어진 산물로 DNA sequencing 을 하는 것이다 . 따라서 많은 양의 주형 DNA 분자를 사용하여 적은 수의 반응 순환을 하는 것이 비특이적인 결과를 줄일 수 있다 . 일반적으로 250~500fmol 의 주형 DNA 를 사용하여 10~15 회의 반응을 하는 것이 좋다 . 물론 이때 프라이머의 양도 비례적으로 증가시켜야 한다 .)DNA sequencing 반응 .6 4 μ L 정지액을 각각의 termination reaction 에 넣고 잘 혼합한 후 원심분리한다 .전기영동 .1 * 전기영동 완충액 :1XTTE 완충액 . 완전히 굳은 PAGE 겔 샌드위치를 전기영동 장치에 설치하고 위쪽과 아래쪽 탱크에 완충액을 채운다 . 위쪽 완충액이 유리판atts 로 2 시간 정도 전기영동 한다 . Q.C 전기영동의 시간은 검사자의 경험에 따라 조절한다 . 일반적으로 정지시약 내의 bromophenol blue 는 프라이머와 비슷한 이동속도를 보인다 .전기영동 .9 안전 전기영동과정은 동위원소가 들은 반응액이 노출되는 때이므로 장갑을 항상 착용하고 가능한 안면보호대를 착용해야 한다 . 고압 (3000V) 을 사용함으로 감전사고에 주의한다 .전기영동 겔의 건조 및 autoradiography.1 전기영동이 끝나면 상층 완충액 ( 동위원소 포함 ) 을 조심스럽게 제거하고 샌드위치를 전기영동 장치에서 분리한다 . 유리판을 수평하게 위치하고 wedge 를 이용하여 한쪽 유리판을 제거한다전기영동 겔의 건조 및 autoradiography.2 ( 유리판이 너무 뜨거울 경우 혹은 너무 차가울 경우에는 얇은 겔이 찢어지는 경우가 종종 있음으로 주의해야 한다 . 샌드위치를 전기영동 장치에서 분리하자마자 찬 수돗물에 한쪽 유리판 만을 5 초 정도 뿌려 갑자기 식히는 것이 이런 문제를 예방하는 방법이기도 하다 .)전기영동 겔의 건조 및 autoradiography.3 3MM CHR 여과지를 유리판의 크기보다 약간 크게 잘라서 둥글게 휘어 겔의 한 가운데에 위치하고 조심스럽게 양쪽으로 펴 겔 위를 전부 덮도록 한 다음 부드럽게 눌러 겔을 붙인다 (3MM 여과지는 수분을 흡수하면 약간 팽창하여 겔을 찢는 경우가 있기 때문에 미리 증류수를 뿌려서 습기를 머금게 하여 사용하는 것이 좋다 .)전기영동 겔의 건조 및 autoradiography.4 유리판으로 부터 겔이 붙은 3MM 여과지를 조심스럽게 떼어낸다 . 겔이 붙은 여과지를 2L 의 겔 고정액 (10% 에탄올 , 10% acetic acid in H₂O) 에 조십스럽게 담근다 . 흔들지 않고 30 분간 고정한다전기영동 겔의 건조 및 autoradiography.5 ( 이 과정에서 동위 원소 시그널을 향상 시키고 겔 속의 urea 를 제거한다 . Urea 가 완전히 제거되지 않으면 겔}

자연과학| 2013.06.03| 55페이지| 3,500원| 조회(199)

DNA, 분자생물학, 임상병리, 임상, 발표, 병리, 분생, 피피티, 을지대

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