*준* 스토어

*준*

개인

팔로워0 팔로우

소개

등록된 소개글이 없습니다.

전문분야 등록된 전문분야가 없습니다.

판매자 정보

학교정보

입력된 정보가 없습니다.

직장정보

입력된 정보가 없습니다.

자격증

입력된 정보가 없습니다.

판매지수

판매중 자료수

5개
전체 판매량

11개
최근 3개월 판매량

0개
자료후기 점수

-
자료문의 응답률

-

전체자료 5개

Westernblot Cell harvest&Sampling

Western blotCell harvest & cell lysis & 단백질 정량(sampling)1) 서론(1) 실험 목적Western blot을 통해 drug이 CPT1의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인한다.(2) 배경지식 및 이론Western blot을 하기 위해선 그 전에 미리 준비해야할 과정들이 존재한다. Western blot은 단백질의 발현양을 측정하는 방법으로 세포 내에 존재하는 단백질양을 측정한다. 그러나 세포내에 단백질들은 3,4차 구조로 존재하여 실제 분자의 무게와는 다르게 측정 될 수 있기 때문에 1차구조인 linear 구조로 풀어줘야 한다. 따라서 비공유결합인 소수성결합, 수소결합, 정전기적 인력, 이황화결합 등을 모두 풀어줘야 한다. 이때 이러한 비공유결합을 분해하기 위해선 SDS라는 detergent와 heat 그리고 DTT(dithiothrenol)등을 이용해 분해를 시켜준다. 이렇게 얻어낸 단백질의 농도를 측정하기 위해선 BCA method를 진행한다. 이것은 단백질 용액에 Cu2+이온을 반응시킨 후, BCA가 Trp, Tyr, Cys의 도움으로 Cu+ 이온과 복합체를 형성하여 자색으로 발색하는 반응을 이용한 방법이다. 이 방법은 562nm에서 흡광도를 측정하며 BSA(bovine serum albumin)을 이용하여 standard curve를 그린 후, 얻어낸 standard curve의 방정식을 이용하여 농도를 모르는 미지시료의 농도를 구하는 방법이다. 이 방법은 다른 방법에 비하여 detergent의 영향을 덜 받는다.2) 재료 및 방법(1) 재료e-tube, scraper, ice, DW, 96 well plate, rack, pipet, tip, vortexerPBS, RIPA, BSA, BCA,50mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC(deoxycholate), protein inhibitor cocktailCentrifuge, microplate reader(2) 방법① E-tube2개를 준비한 후 labeling한다.② Dish에 있는 배지를 버린 후 DPBS 5ml를 넣고 washing 해준다.③ DPBS를 제거하고, 350ul,의 RIPA buffer를 넣어주고, scraper를 이용하여 cell을 긁어서 떨어뜨리고, 이를 모아 각 e-tube로 옮겨준다.④ 15초간 cortex 하고, 30분간 ice에 incubation 해준다- 5~10분마다 15초씩 vortex 해준다.⑤ Cell을 모은 e-tube를 13000rpm으로 20분간 원심분리한다.⑥ 상층액을 따서 새로운 e-tube로 옮겨준다.- pellet까지 따지 않도록 조심하고, 이후 tube는 ice에 꽂아두도록 함⑦ BSA를 DDW를 이용하여 희석해 준다.- 0, 250, 500, 1000, 2000 ul/ml를 만들어 준다.⑧ 96well plate에 BSA와 sample(⑥에서 얻어낸 단백질)을 10ul씩 넣어 준다.⑨ BCA reagent를 A와 B를 50:1 비율로 결합한 후 200ul씩 분주한다.-sample의 경우 색이 너무 빨리 나와서 standard curve를 그릴 BSA의 농도보다 높을 수 있기 때문에 다른 well에 2ul씩 넣어주었다.⑩ 37℃에서 20분간 incubation한다.⑪ Microplate reader를 이용해 562nm로 측정 후, standard curve를 그린다.⑫ 정량을 마친 후, 5X sample buffer를 넣고 95℃에서 15분간 끓인다⑬ ice에선 5분정도 식힌 후, spin down한 다음, -20℃ 냉장고에 보관한다.BSA(ul/ml)0*************0OD값0.0780.1800.2840.4700.7763) 결과[사진1] standard curvey = 0.338x + 0.033 R2 = 0.996SampleA(10ul)B(10ul)A(2ul)B(2ul)OD값1.1581.2301.1881.0800.2830.2630.2340.300Sample을 10ul로 넣었을 경우 standard curve를 그린 BSA보다 OD값이 높게 나와 농도가 더 높다는 것을 알 수 있다. 이 경우 standard curve를 벗어난 농도이기 때문에 그보다 낮은 2ul의 OD값을 이용하여 농도를 구한다.

자연과학| 2017.12.13| 5페이지| 1,500원| 조회(211)

cell, sampling, Western blot, cell harvest, harvest

미리보기

닫기
Westernblot SDSpage&transfer&blocking

Western blotGel electrophoresis(SDS page) & transfer & blocking1) 서론(1) 실험 목적Western blot을 통해 drug이 CPT1의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인한다.(2) 배경지식 및 이론Western blot에서 단백질을 1차구조로 풀어줬다고 해서 단백질을 정확하게 분자량으로만 측정을 할 수 있는 것은 아니다. 그 이유는 단백질을 구성하고 있는 아미노산이 charge를 띄고 있는 종류도 있기 때문이다. 따라서 SDS를 이용하여 모든 단백질은 (-)charge를 띄게 한다. 그 후 gel을 2가지 종류를 만드는데, gel의 종류는 stacking gel과 running gel이다. 실제로 size를 분리하는 것은 running gel에서 일어나고, stacking gel에서는 단백질들의 출발선을 갖게 해주기 위해 존재한다. 즉, 여러 크기로 존재하는 단백질을 일정한 출발선으로 모이게 해준다. 또한 gel의 acrylamide의 농도는 gel의 단백질 분류능을 결정한다. Acrylamide의 농도가 클수록 저 분자량 단백질 분류능이 우수하고, acrylamide의 농도가 낮을수록 고 분자량 단백질의 분류능이 우수하다. 또한 Transfer 단계와 electrophoresis 단계에서 둘다 전류를 걸어주게 되는데 V와 A의 차이는 V는 gel의 총 길이에 따라 달라지게 된다. V가 클수록 gel의 길이가 길어지면 V또한 커지게 된다. A의 경우는 gel을 몇 개를 걸어주는지에 따라 다르다. Gel을 한 개만 걸어준다면 50A일 경우 두 개를 걸어주면 그의 2배인 100A를 걸어줘야 같은 결과가 나온다.Transfer 과정에선 gel내에서 nitro cellulose 또는 polyvinylidene difluoride(PVDF)로 제조 된 membrane으로 이동시킨다. 단백질을 이동시킬 땐 gel이 (-)charge를 띄고 membrane이 (+)charge를 띄게돼서 기기를 통해 gel에서 분리된 단백질이 membrane으로 옮겨가게 되는 electroblotting 방법을 사용한다.Blocking과정에선 antibody가 다른 단백질이나 membrane에 결합하는 것을 방지하기 위해서 유단백(전지분유)를 이용해서 blocking을 해준다.2) 재료 및 방법(1) 재료Pipet, tip, 변압기, comb, gel tank, tray, 핀셋, cassette, 3M paper, PVDF, 가위Methanol, transfer buffer, skim milk,Electrophoresis, incubation(2) 방법① Running gel과 stacking gel 만들기Running gel stacking gel10% gel10mlH2O4.030% acrylamide mix3.31.5 M Tris(pH8.8)2.510% SDS0.110% ammonium persulfate0.1THMED0.00610% gel4mlH2O2.730% acrylamide mix0.671.5 M Tris(pH6.8)0.510% SDS0.0410% ammonium persulfate0.04THMED0.004② Comb을 양쪽 끝을 잡고 흐트러지지 않게 제거한 후 물로 세척한다.③ Cassette 밑의 스티커를 제거하고 gel tank에 넣은 후 고정시킨다.④ Running buffer를 채운다.⑤ Marker와 이전시간에 준비한 sample을 gel에 loading한다.⑥ 80V로 30분 running⑦ 120V로 1시간 30분 running⑧ Transfer 준비 : tray에 transfer buffer, 작은 통에 메탄올, 3M paper 2장, PVDF 1장, 핀셋⑨ cassette에서 gel을 꺼내 stacking gel과 밑 끝 부분을 제거한 후, tray로 옮긴다.⑩ PVDF를 메탄올에 30초 담근 후 tray로 옮긴다.⑪ Transfer cassette ? sponge ? 3M paper ? gel ? membrane(PVDF)? 3M paper ? sponge 순서로 쌓는다.⑫ Transfer tank에 buffer, 얼음팩, cassette를 넣고 100V로 1시간 transfer한다.- Cassette의 검은 면은 (-), 투명한 부분은 (+) charge를 띄며 검은면이 검은색 쪽으로 가면 된다.

자연과학| 2017.12.13| 5페이지| 1,500원| 조회(138)

SDS, Western blot, SDS PAGE, Transfer, Block..

미리보기

닫기
Westerblot incubation&developing

Western blotPrimary, secondary antibody incubation & developing(using film)1) 서론(1) 실험 목적Western blot을 통해 drug이 CPT1의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인한다.(2) 배경지식 및 이론Blocking과정 후 단백질의 특이적인 epitope을 인지하는 primary antibody를 반응시킨 후, 이 primary antibody를 특이적으로 인지하는 secondary antibody를 반응시킨다. 이 secondary antibody에는 발광 물질이 결합되어 있어 기기를 통해 이 발광물질의 발광양을 측정하여 단백질의 발현양을 측정하는 것이다. 이 발광 물질은 산화되어서 빛을 낸다. 이 방법 외에도 ponceau s, sypro ruby, Coomassie R-350, amido black 등 다양한 염색 방법등이 존재한다. Ponceau s의 경우 polypeptide의 서열 분석에 해로운 영향을 미치지 않으며, 물 세척으로 쉽게 세척되기 때문에 단백질 밴드를 확인하기 용이하다. Coomassie R-350같은 경우는 단백질의 amino 및 carboxyl과 정전기적으로 상호작용합니다. 따라서 단백질에 결합하여 단백질 ? 염료 복합체를 형성하여 염색된 단백질의 농도를 정량화 합니다.2) 재료 및 방법(1) 재료Pipet, tip, blotting후 membraneprimary antibody, secondary antibody, TBS-T, ECL A,B,chemi-doc, shaking incubator(2) 방법① Primary incubation② TBS-T wash 5min, 3 times③ Secondary antibody incubation for 1hour 30mins.④ TBS-T wash 5min, 3times- 위의 과정은 전부 shaking incubator에서 진행한다.⑤ ECL A,B를 각각 200ul를 e-tube에 섞는다.⑥ 랩에 membrane을 올려 놓고 ECL을 뿌려 놓는다⑦ Chemi-doc으로 측정한다.3) 결과[사진1] CPT1 발현양[사진2] β-actin 발현양위의 사진에서 왼쪽은 control이며 오른쪽은 WY-14643을 처리한 것이다. 사진2를 보면 β-actin의 발현양은 control과 WY-14643을 처리한 것이 비슷한 양으로 나온 것으로 보아 잘 나온 것으로 보인다.사진 1을 보면 CPT1의 발현양이 drug을 처리한 것과 처리 안 한 것이 비슷하게 발현된 것을 볼 수 있다.따라서 drug을 처리한 것과 안 한 것의 CPT1의 발현양의 차이는 거의 없는 것으로 보인다. 하지만 원래는 drug을 처리한 것이 더 많은 CPT1을 발현해야 하는 것이라 실험은 실패한 것으로 보인다.[사진]3 markerMembrane filter를 자를 때 orange색 band와 바로 밑의 band사이를 잘랐으므로 β-actin의 경우 42kda이고 CPT1은 옆에 marker가 보이지 않아 정확하진 않지만 가장 위에있는 것으로 생각되므로 170kda이라 생각 됩니다.4) 고찰Q1. Lowry method, Bradford method에 대해 알아보세요.Bradford method란 염료 Coomassie blue를 사용하여 Coomassie blue의 흡광도 변화를 기반으로 측정합니다. 산성 조건 하에서 염료는 청색의 형태로 변환되며, 정전기적 상호 작용을 통해 반데르발스 힘과 amino group에 의해 단백질의 카르복실기와 강한 공유 결합을 형성합니다. 이러한 복합체의 양은 단백질 농도의 척도이며, 흡광도 판독법을 사용하여 추정 할 수 있습니다. 이렇게 청색의 Coomassie blue의 경우 595nm로 유지되는 최대 흡수 스펙트럼을 갖는다. 이 흡광도의 증가는 결합 된 염료의 양과 시료에 존재하는 단백질의 양에 비례한다. 그러나 Coomassie blue는 SDS의 농도에 민감하다. SDS가 고농도로 존재할 때 Coomassie blue와 강하게 결합하여 청색을 띄게 되며, 단백질 존재와는 무관하게 595nm에서의 흡광도를 증가시킵니다. 이와는 반대로 SDS의 농도가 낮다면 SDS가 단백질과 강력하게 결합하여 Coomassie blue와 결합을 억제하여 단백질 농도가 더 낮게 나오게 됩니다.Lowry method란 단백질의 산화와 함께 알칼리 조건하에서 구리 이온의 반응과 펩타이드 결합을 합니다. Lowry method에선 folin-ciocalteu 시약을 사용하며 펩타이드 결합의 산화에 의해 생성 된 cu+의 반응을 기반으로 합니다. 이러한 반응은 Folin-ciocalteu시약의 감소와 방향족 잔기의 산화를 수반한다.

자연과학| 2017.12.13| 5페이지| 1,500원| 조회(85)

Western blot, developing, Incubation

미리보기

닫기
Mammalian cell culture Real time PCR

Mammalian cell culture III(Real-time PCR)I. IntroductionReal Time PCRReal Time PCR기법은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술이다. End Point에서 PCR 증폭산물을 확인하는 기존의 PCR기법에 비해서 다음과 같은 이점을 지닌다.? DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능.? 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험석이 적다.먼저 Real Time PCR에 의한 정량 매커니즘을 살펴보자. Real Time PCR에서는 PCR 증폭산물을 Real Time으로 모니터링하여 증폭이 지수적으로 일어나는 영역에서 정량 하기 때문에 기존 기술인 RT-PCR법과 달리 PCR의 증폭속도 이론을 기초로 정확한 정량이 가능하다. PCR에서는 1 cycle마다 DNA가 지수적으로 증폭하다가 plateau에 도달한다. 이 증폭의 모습을 Real time으로 모니터링한 그림이 증폭곡선이다. 아래의 모식도는 DNA 농도(실제의 증폭산물량)를 청색으로 나타내고 그것을 형광으로 검출한 signal 강도를 적색으로 나타내었다. PCR 증폭산물량이 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 signal이 상승하다가 plateau에 도달한다.초기 DNA량이 많을수록 증폭산물량이 검출 가능한 양에 달하는 cycle 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 Real time PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 threshold를 설정하면 threshold와 증폭곡선이 교차하는 지점: Ct값 (Threshold Cycle)이 산출된다.Ct값과 초기 주형량 간에는 직선적인 관계가 있어 아래 그림과 같은 검량선을 만들 수 있다. 미지의 시료에 대해서도 표준시료와 마찬가지로 Ct값을 산출하여 이 검량선과 대조하면 초기 template량을 구할 수 있다.Real time PCR 장치와 검출방법그렇다면 Real time PCR에서는 어떤 방법으로 tube 내의 PCR 증폭산물을 검출하는 것일까? 여기에서는 Real time PCR 장치와 PCR 증폭산물의 검출방법에 대해서 설명하고자 한다.장치Real time PCR를 하기 위해서는 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 Real time PCR 전용 장치가 필요하다. Thermal cycler로 DNA를 PCR 증폭시키면서 분광 형광 광도계로 그 증폭산물을 측정해 나간다. 다양한 기종의 Real time PCR 장치가 판매되고 있는데, 고속으로 PCR 반응이 되도록 연구된 것과 96 well plate 단위로 반응할 수 있는 것 등 다양한 특성을 갖춘 장비들이 판매되고 있다.검출방법의 선택Real time PCR에서는 PCR 증폭산물을 형광을 통해 검출한다. 검출방법은 크게 interchelating법과 형광표식 probe를 이용하는 2가지 방법이 있다. Interchelating법은 double strand DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별로 probe를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다는 장점이 있는 반면 검출 특이성은 그다지 높지 않다. 형광표식 probe를 이용하는 방법은 비용은 많이 들지만 검출 특이성이 높아 비슷한 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 검출방법은 실험 목적에 따라서 선택한다.검출방법의 원리형광표식 probe에는 몇 가지 종류가 있는데 TaqMan probe와 cycling probe 등이 대표적이다. Interchelating법에는 일반적으로 SYBRGreen I를 사용한다.(1) Interchelating법(SYBR Green I)SYBR Green I는 Double strand DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다. Interchelator는 PCR 반응으로 합성된 double strand DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다.(2) TaqMan probe법5’말단은 형광물질(FAM 등)로 3’말단은 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 oligonucleotide(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법이다. TaqManTM probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridize하지만, probe상에 quencher에 의해 형광 발색이 억제된다. Extension 반응시에 Taq DNA polymerase가 갖는 5’→ 3’exonuclease 활성으로 template에 hybridize한 TaqManTM probe가 분해되어 형광색소가 probe에서 유리되면서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다.3) Cycling Probe법Cycling Probe법은 RNA와 DNA로 이루어지는 chimera probe와 RNaseH로 구성된 고감도의 검출방법이다. Probe는 5’말단은 형광물질로, 3’말단은 quencher 물질로 표식되어 있다. 이 probe는 일반적으로 quencher에 의해 형광을 발하지 못하지만 증폭 산물 중의 상보적인 서열과 hybrid를 형성한 후 RNase H에 의해 RNA 잔기가 절단 되면 강한 형광을 나타내게 된다. 또 probe의 RNA 부분이 mis-match 되면 RNase H에 의해 절단되지 않기 때문에 서열 특이성이 매우 높은 검출방법으로 특히 SNPs typing 등에 최적이다.Primer 설계Real time PCR 실험의 첫번째 단계는 목적 유전자를 검출할 수 있는 primer(및 probe)의 선택이다. 전용 소프트웨어를 이용하여 직접 설계 할 수도 있고 설계가 끝난 것을 구입해서 사용할 수도 있다. Primer 설계는 Real time PCR를 성공시키기 위한 가장 중요한 요소로,PCR 증폭효율이 나쁜 primer로는 고감도 검출이 불가능하고 또 primerdimer 등 비특이적 증폭이 발생하기 쉬운 primer로는 정확한 정량이 어렵다. Primer 설계 전용 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 조건을 만족하는 primer를 설계하는 것이 중요하다.·표적 DNA 서열에 안정되게 annealing 할 수 있다(Tm값이 적절한 범위).·PCR 반응효율이 좋다(Primer 내부 혹은 primer간에 상보적인 서열이 없다).·특이성이 높다(template DNA상에 mis-priming하는 부위가 없다)II. Materials & MethodscDNA SynthesiscDNA Synthesis kit, PCR machine, PCR tube? cDNA 합성을 위해 tube에 표와 같이 순서대로 넣어준다.? PCR machine 으로 cDNA합성1) Priming 5min at 25’C2) Reverse Transcription 20min at 46’C3) RT inactivation 1min at 95’C4) Optional step Hold at 4’C? cDNA dilution: RNA 1μg로부터 동량의 cDNA가 합성되었다고 가정하면, 합성된 총 cDNA는 1μg/20μL = 50ng/μL이후 real-time PCR에 사용되는 cDNA templete는 20ng 사용함.(합성된 cDNA 20 uL + 180 uL nuclease-free water = 200 uL)Real-Time PCR? 96 well PCR plate의 정해진 위치에 cDNA 4ul 씩 loading? Mixture (primer, DDW, SYBR Green) 16ul loadingb-actincontrol Targetb-actinWY Target? Cover Film을 붙인다? Centrifuge 1000rpm, 2min? Real time PCR machine에 넣고 작동시킨다.III. ResultsCt 값Target gene(gene X)Reference gene(b-actin)control31.98284523.328655WY 1646336.25532524.369805Ct 값dCt(target ? Ref)control8.651419WY 1464311.88552Ct 값ddCtcontrol0WY 146433.231336상대비율2 ^{rm-ddct}control1WY 146430.106481control에 비해 WY 14643 처리 시 발현양이 약 1/8 정도로 줄었음을 확인할 수 있다.

자연과학| 2017.12.13| 10페이지| 1,500원| 조회(142)

PCR, cell, Cell Culture, rpcr

미리보기

닫기
TLC(Thin Layer Chromatography

Thin layer CromatographyIntroduction지질의 종류와 역할지질은 생체구조나 에너지대사에서 생명유지에 필수적인 역할을 한다. 지방산은 세포 내의 미토콘드리아에서 β산화되어 에너지를 생산한다. 인지질은 인산기를 가지고 유리콜레스테롤은 수산기를 가지기 때문에 어느 정도 물에 녹는다.콜레스테롤의 역할콜레스테롤은 주로 간에서 합성되며, 체내에서는 생체막의 구성성분이나 스테로이드호르몬(부신겉질호르몬, 성호르몬)의 전구체로서 이용된다. 또 쓸개즙산의 원료가 되기도 하고 그 유화작용, 미포(micelle)형성 작용으로 지방의 흡수를 돕는 등 체내에서 중요한 역할을 한다. 쓸개즙산으로 배설된 콜레스테롤은 대부분 돌창자 말단에서 재흡수되어 문맥을 거쳐 간으로 돌아와 재이용된다.인지질의 역할인지질은 인산기를 포함하고 있기 때문에 극성을 가지고 있어서 안정된 생체막을 형성할 수 있다. 또 콜레스테롤도 마찬가지로 극성을 가지고 있어 생체막의 일부로 이용된다.트리글리세리드의 역할트리글리세리드(TG)는 간이나 지방세포에 축적되었다가 에너지가 부족할 때 리파아제에 의해 글리세롤과 유리지방산(FFA)으로 분해된다. 글리세롤은 간을 중심으로 흡수되며 당신생에 의해 글루코오스로 변환되어 에너지로 이용된다. 유리지방산은 세포 내의 미토콘드리아에서 β산화되어 에너지로 이용된다.Chromatography 실험 원리Thin Layer Chromatography- 얇은 기판 위에 정지상을 입혀 사용하는 크로마토그래피로, 주로 비휘발성의 물질을 분리해내는 데에 사용.- 모세관현상에 의해 전개 용매가 위로 이동함.- 극성이 큰 물질은 정지상(극성)과의 상호작용이 더 강하므로 이동상에 의한 이동이 느림. (극성은 극성끼리 무극성은 무극성끼리 상호작용)Retardation Factor- 기준선에서부터 용매와 시료가 이동한 각 거리의 비를 나타낸 것.Materials & Methods실험 1Homogenizer, PBS, glass tube, chloroform, Triton X-100, water bath, Centrifuge, pipette, tip, DW, MeoH, Vortex, Nitrogen gas1. Place approximately 50~100mg tissue in 1ml PBS and homogenize.2. Add 2ml of chloroform : methanol (2:1)3. Vortex and spin at 3000rpm for 10min4. Transfer the organic phase (bottom) to a glass tube5. Add more 1ml of chloroform : methanol mixture in sample vial6. Vortex and spin at 3000rpm for 10min7. Separate the bottom layer to glass tube8. Dry under Nitrogen실험 2후드,TLC판, TLC전개통, 건조기, 유리판 덮개, 전개용매, 추출액, 표준물질1. (후드 안에서) 전개통을 준비하고 전개용액을 부어둔다.2. 지질 추출액과 대조물질들을 TLC판에 점적한다.3. 드라이기로 점적한 용액을 충분히 말려준다.4. TLC판을 전개통에 넣고 전개용액이 충분히 전개되도록 한다. (약 1시간)5. 다른 전개통에 아이오딘을 넣고 발색시킨다.6. 추출한 지질이 나타낸 반점들의 Rf값을 측정한다.Results[그림1] 발색된 TLC판전개용매 = 9.7cm , 지질 = 7.2cm, 6.3cm, 5.4cmRf값 = 0.74, 0.65, 0.56Discussion1.Triton x-100은 비이온성 계면활성제로 세포막을 구성하는 막단백질을 용해시켜주는 역할을 수행한다. 비슷한 역할을 수행하는 또 다른 물질로는 sarkosyl이 있다. sarkosyl은 triton과 같이 세포의 inner membrane의 solubilization에 사용된다.2.지질을 분석하는 또 다른 방법으로는 고성능 액체 크로마토그래프(High Performance Liquid Chromatography)가 있다. HPLC를 이용한 분리분석의 기본적인 원리로는 액체 크로마토그래피와 동일하며, 가스크로마토그래피(GC;Gas Chromatography) 시스템과 마찬가지로 고정상과 시료 및 이동상과의 상호작용이 시료 성분의 분리에 영향을 미치지만, 액체 크로마토그래피 시스템은 GC와는 달리 분석 가능한 분자량의 제한이 없다. 즉, HPLC는 GC에 비해 비교적 분자량이 크거나 비휘발성인 시료를 분석할 수 있으며, 분석한 시료의 회수가 가능하다는 장점이 있다.HPLC의 원리· 흡착작용(adsorption):고정상에 부착된 기능단에 시료가 흡착되어 각 성분을 분리· 분배작용(partition):고정상의 기능단이 역상으로 각 시료성분들이 서로간의 분배로 분리· 이온교환작용(ion exchange):양이온이나 음이온의 시료가 상대이온과의 경쟁으로 교환이 일어나 정지상에 분포· 분자체 작용 (size exclusion, gel permeation): 겔의 다공성 크기에 시료분자의 크기에 따라 투과성에 의해 분리하는 경우.즉, 분자가 큰것이 먼저, 작은것이 나중에 용리되는 원리· 순상(normal phase): 고정상(컬럼)이 이동상(용매)보다 극성이 강한 경우. 극성이 큰 실리카겔을 충진제로 사용하면 실리카 표면에 존재하는 하이드록시그룹과 시료간의 머무름 현상이 나타남.

자연과학| 2017.12.13| 7페이지| 1,500원| 조회(369)

크로마토그래피, 실험, TLC, thinlayerchromatogra

미리보기

닫기