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유전자 증폭 기술의 기본 원리와 고찰

유전자 증폭 기술의 기본 원리와 고찰**대학교***과 ***목 차Ⅰ. PCR 이란 ?Ⅱ. Step-by-step reaction during PCRⅢ. Taq polymeraseⅣ. Competitors of TaqⅤ. Components of PCRⅠ. PCR 이란 ?분자생물학은 그 연구방법의 특성상 실험이 아주 중요한 부분을 차지하고 있다. 즉 분자생물학의 발전은 실험방법의 발달을 그 전제로 하고 있다고 할 수 있을 것이다. 그 동안 여러 획기적인 실험방법들의 개발로 과거 불가능했던 연구를 가능하게 해 주었고 그 결과 분자생물학이라는 새로운 학문이 탄생하게 된 것이다. 현재 여러 분야의 생물학 연구에서 분자생물학(molecular biology)이라는 도구 없이 실험을 한다는 것은 상상하기도 힘들 것이다. 그 도구들 중 가장 중요한 것이 현재 각광을 받고 있는 PCR이라는 것에는 누구도 이견이 없을 것이다. 과거에는 박물관 시료, 건조 시료, 범죄 현장에서의 여러 증거물 그리고 화석 등과 같은 경우 DNA분리는 가능했지만 양이 너무 적거나 DNA가 너무 오래되어 연구에 사용할 수 없었다. 그러나 1983년 4월, Cetus 회사에서 일하던 화학자 Kary Mullis에 의해 PCR (Polymerase Chain Reaction)이 고안되면서 DNA의 양이나 질에 관계없이 증폭이 가능하게 되었다. 이 기술의 고안은 분자생물학에서 높은 성과를 인정받아 1993년 Dr. Kary Mullis는 분야에서 Novel 상을 받았다.PCR (Polymerase Chain Reaction)은 DNA Denaturation, Primer Annealing과 Polymerization을 한 주기로 하여 DNA 단편을 빠르게 증폭하는 방법이다. 95℃ 정도로 가열하여 DNA를 변성시킨 후 60℃ 정도로 온도는 낮추어져 primer가 상보적인 염기와 결합할 수 있게 한다. 그 후 온도를 72℃ 정도로 다시 높여 DNA 복제가 일어날 수 있게 한다. 이 과정이 한 cycle로써CR의 최종적인 sensitivity와 specificity를 결정하는 제일 중요한 과정이다. primer는 templates 같은 긴 DNA와는 달리 보통 15bps이상 30bps이하의 oligonucleotide를 사용하는데 이런 짧은 DNA의 hybridization temperature를 결정하는 데에는 length, GC content, pH, salt concentration 등 여러 요소가 영향을 미친다. 이 과정에서 primer가 binding하여 free 3' end를 제공하면 여기서 polymerase가 chain extension을 시작한다.4. ExtensionTaq polymerase가 primer의 3‘end의 free OH기를 시작점으로 새서 single strand template의 상보적인 dNTP를 가져와서 붙여나가며 chain extention을 시행한다. 처음 cycle에서는 template를 기준으로 합성이 되므로 target sequence와는 상관없이 3’ 방향으로 60bps/sec의 속도로 계속 합성이 되어 나간다. 이론적으로는 template의 5‘ end까지 합성이 되어 나갈 수 있지만 extension time이 무한대가 아니므로 다름 cycle의 denaturation step까지 합성이 된다. 보통 500bps 이하의 size는 20초면 충분한 extention이 되는 것으로 알려져 있다.[Genomic DNA로부터 특정 유전자 부위의 증폭]Ⅲ. Taq polymerase원래 PCR에 사용되었던 polymerase는 E.coli의 DNA polymeraseⅠ인 Klneow fragment 이었는데 이는 DNA를 single strand로 풀기 위해 온도를 올리면 파괴가 되어버리기 때문에 매 cycle 마다 enzyme 넣어주어야 하는 불편함이 있었다. 그러나 이러한 문제를 해결한 것은 Dr. Saiki이며, 그가 발견한 Thermus aquaticus 라는 온천에 사는 미생물에서 추출한 polymerase를 Taq에서 빈번하게 관찰이 되는 Lys->Arg의 변화는 chain의 hydrophobicity의 증가와 2차구조의 flexibility 감소를 유도해 높은 온도에서 안정한 enzyme이 된다. 또한 Taq.에 포함된 helix 구조 자체를 더욱 tighter하게 packing시키는 역할도 한다. Gly과 같은 conformational phi나 psi angle을 가질 수 있는 amino acid를 Ala처럼 amino acids chain내에서 conformational option이 아주 제한적인 것으로 바꿈으로 인해서 protein backbone의 flexibility를 감소시켜 높은 온도에서 구조의 변화를 최소화 한다. (Matthews 1987)Beta tuern의 second position에 있는 Pro의 증가는 자체의 phi와 psi angles 제한이외에도 앞뒤 residues의 phi와 psi angles 역시 제한한다.(Matthews 1987)Taq의 크기가 작은것과 surface-to-volume ratio가 낮아서 생기는 solvent-accessible surface area의 감소 역시 thermostability의 증가를 가져오는 것으로 보고되었다. (Matthews 1987, Elie 1988, Menendez-Arias 1988, Park 1993, Tanner 1996)위의 결과를 종합해 보면 Taq PolⅠ은 chain 자체의 rigidity를 증가시키는 Pro의 증가와 주 2차 구조인 alpha helices를 안정화하는 Lys->Arg의 amino acid substitutions과 secondary structures의 tighter packing에 의한 hydrophobic interactions의 증가 그리고 hydrogen bonds and salt bridges의 증가에 따른 primary, secondary, and tertiary structure의 종합적인 변화에 의해서 thermostability가이들의 ionic 혹은 hydrogen bonds의 힘이 약해지지 않는다면 (물 분자에 의해서 hydrogen bond attraction은 80배 가량 감소한다.) 서로 crosslinking이 일어나서 반응은 고사하고 bulk로 남아있을 것이다. PCR의 요소들이 서로 자유운동을 해서 만날 수 있는 환경을 제공하기 위해서는 물이 꼭 필요하다.2) Hydrophobic attraction을 일으킨다.물 분자의 hydrogen bonds와 competition하는 성질이 macromolecules들 간의 reaction에 미치는 영향은 치명적이다. Hydrogen bond나 ionic bonds는 생명에 꼭 필요한 결합이므로 물 분자에 의한 weakening을 극복해야 한다. 이를 위해서 hydrophobic attraction이라는 현상을 biologic system은 응용하고 있다. 간단한 예로 물에 기름방울을 떨어뜨려보면 한 덩어리로 동글동글하게 뭉쳐있는 것을 볼 수 있다. 이는 hydrophobic molecules가 서로 뭉치려는 힘이 작용하기 때문인데 이는 사실 hydrophobic moleculesrks에 afffinity가 있어서 끌리는 것이 아니라 물 분자가 서로 hydrogen bonds를 이루려는 힘이 강해서 이 결합을 최대로 만드는 상태가 열역학적으로 안정하기 때문에 hydrophobic molecules가 밀려서 서로 뭉치게 되는 현상이다. 표면적이 작을수록 hydrogen bonds의 breakage가 최소가 되기 때문인 것이다. 만약 biologic system에서 이런 힘을 작용하고 있지 않다면 enzyme과 substrates가 만날 확률은 순전히 불확정성의 원리에 의해 통계적인 값만 가지게 되어 비효율적일 것이다. 또한 이 hydrophibic attraciton은 protein 같은 macromolecules가 self-folding 되는 원동력을 제공한다.2. BufferProtein이 제대로 작용하기 위해서 pH는 아주 중te base인 Tris o는 생성되는 H+와 반응 해서 Conjugate acid인 Tris +를 생성한다. PCR을 통해서 180uM의 H+가 생성되었으므로 위에서 얻은 값을 대입하면 [Tris +] = 3.87 + 1.18mM = 4.05이고 [Tris o] = 6.13 - 0.18mM = 5.95가 된다. 이때의 pH값을 계산해 보면 pH = 8.1 + LOG(5.95/4.05) = 8.26이 된다. Original pH에서 얼마 변하지 않은 값이다. 그런데 만약에 buffer가 없다면pH = log 1/[H+]이므로 pH = log 1/0.0002 = 3.9가 된다.[Tris-HCl]만약 buffer가 없다면 pH가 3.9까지 떨어진다는 계산이 나오는데 이 정도면 PCR은 고사하고 있는 nucleic acids도 hydrolysis되어 나가기 시작합니다. 하지만 Tris-CI buffer 덕분에 pH는 8.26으로 0.04의 변화만 생기는 것이다.3. Templates preparation methods1) Crude lysatesSimple boiling이나 Proteinase K treatment 만으로 cell membrane이나 protein 등을 그냥 lysis 시킨 것을 바로 template로 사용. Degraded protein과 lipid가 아주 많이 포함이 된다.장점 : 빠른 시간 안에 templates를 준비할 수 있고 경제적이다.단점 : target sequences가 많지 않을 것으로 예상되는 경우는 사용이 힘들다.적용 : 주로 cell culture에서나 human 조직처럼 target sequences의 양이 많을 것으로 기대될 때 사용을 한다.2) Phenol extraction methodProteinase 처리 후 Pheno-chloroform으로 lipid나 protein을 추출해낸다. 그리고 나머지 수용액에 alcohol을 사용해 nucleic precipitation을 시켜서 농도를 올려준다.장점 : Nucleic

공학/기술| 2015.12.14| 14페이지| 4,000원| 조회(207)

PCR, Protein, 분자생물학, polymerase, 유전자 증폭 기술, P..

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유전자 증폭 기술의 종류

유전자 증폭 기술의 종류**대학교***과 ***목 차Ⅰ. PCR의 일반적인 thermal programmingⅡ. PCR기법의 응용Ⅲ. ReferencesⅠ. PCR의 일반적인 thermal programming.1. Hot StartPCR은 동일한 parameter로 구성된 반복 cycle들을 통해서 이루어진다. 이것은 PCR machine의 thermal parameter가 반복된다는 의미이다. PCR reaction은 매 cycle마다 달라지게 된다. PCR의 components와 pH 등은 역동적으로 변화하면서 매번 새로운 환경으로 cycle을 지난다. 크게 이 역동적인 cycle들은 initial screening phase와 exponential replication phase 두 가지로 나누어 생각할 수 있다.1) Initial screening phase에서는 primer가 target으로 하는 sequences를 찾아서 annealing하고 원하는 size의 target fragment를 만들어 내는 phase.2) exponential replication phase는 만들어진 target fragment를 계속 복제해내는 phase.이렇게 두가지로 크게 나누는 이유는 initial screening phase에서 PCR의 scnsitivity 혹은 yield와 specificity가 결정이 되기 때문이다. 이 phase에서 primer mismatch나 partial binding에 의해서 잘못된 fragments가 생겨나면 이후에서는 원하는 target fragment와 동일한 조건에서 같이 증폭이 되어 버리기 때문이다.처음 annealing step에서 온도 값이 적절하다면 primer는 정확히 자기의 matching sequences에 binding합니다. 하지만 Tm값보다 낮은 온도에서 annealing을 시킬 경우 31 end의 부분적인 sequences만 matching 되더라도 primer의 partial binding이 일어난일 좋은 방법은 실제 annealing temperature를 약 2℃정도의 차이로 trial test를 해서 값을 구하는 것이다.일반적으로 PCR시에는 모든 cycle의 annealing temperature를 같은 값으로 설정하는 경우가 많은데 PCR machine이 지원한다면 automatic program을 사용하여 initial screening phase와 exponential amplification phase의 annealing temperature를 달리 설정해 주는 것이 좋다. 그러니까 처음 1/3 cycle들은 optimal Tm value보다 약간 높은 값을 설정해서 specificity를 확보하고 나머지 cycle들은 annealing temperature를 일정값(대략 0.2~0.5℃)씩 감소시켜가면서 PCR이 수행이 되도록 하여 yield를 높여주는 방법을 쓰는 것이 좋다.3. Extension일반적으로 extension temperature는 72℃를 설정한다. 실제로 Taq polymeraserk maximum activity를 나타내는 온도는 75℃이지만 온도가 너무 높은 경우 primer의 binding이 제대로 이루어지지 않을 것을 걱정해서 suboptimal temperature에서 extension을 시행하는 것인데 이 것이 표준화 되어 버린 것이다. Primer의 Tm값이 높은 경우는 extension temperature를 높여주는 것이 PCR이 오히려 성공적으로 나옵니다.또 하나 생각해야 할 것은 Taq polymerase 자체가 cycle을 많이 지날수록 denature 되어 버려서 activity 자체가 떨어진다는 것이다. 즉 PCR 후반부로 갈수록 target size를 합성하는 데 걸리는 시간이 점점 길어진다.4. Denaturation이 step에서 templates DNA extension이 끝난 target fragment가 single strand로 풀어진다. 이 step에서는 온도와 시간을 잘 조절하수행한다(대개 25-30번). 그 결과 증폭된 DNA 단편의 수많은 copy들이 합성된다.프라이머는 PCR을 포함한 모든 증폭공정의 성패를 좌우하는 핵심요소이다. 프라이머가 정확하게 design되면 그 실험은 주형분자의 target region과 대응하는 단일의 DNA단편을 증폭시킬 것이다. 프라이머가 부정확하게 design되면 그 실험은 실패하여 증폭이 일어나지 않거나 잘못된 단편이 증폭되거나 한 종류이상의 단편이 증폭될 것이다.앞서 언급하였듯이, PCR의 각 cycle동안에 reaction mixture는 세 가지 온도를 거치게 된다.1) Denaturation temperature(보통 94℃)2) Hybridization or annealing temperature3) Extension temperature(보통 74℃, 이는 Taq polymerase의 최적 활성 온도보다 약간 낮은 온도임)[RT-PCR의 기본 원리]PCR은 DNA 주형의 증폭에만 제한되어 있는 것이 아니다. RNA분자가 우선 단일 가닥의 cDNA로 역전사 효소에 의해 전환된다면 증폭될 수 있다. 일단 이전 step이 수행된 후에는 Taq polymerase를 첨가하여 standard technique과 정확히 동일한 방법이 사용된다. 이를 reverse transcription-PCR(RT-PCR)이라 한다.2. RT-PCR(Reverse Transcriptase Chain Reaction)특정 부위의 RAN를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나누어지며, ⑵ 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 Northern blot hybridization과 같은 프라이머가 같이 반응을 하여 증폭이 되는 경우이다. 이 경우 양끝단으로 보면 네 종류의 프라이머가 반응을 하는 효율을 나타내며 이로 인해, 프라이머의 혼성화 반응을 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또하나의 경우는 처음부터 양끝단에 다른 sequence를 가지고 있는 프라이머 set와 기존 PCR에서 사용하는 프라이머 set를 직접 주입하여 증폭하고자 하는 sequence의 양끝단에 새로운 sequence를 포함시키게 하는 경우이다. 이 경우에는 부가적으로 첨가된 sequence를 이용하여 후 공정인 측정공정에 직접적으로 사용할 수 있다.6. NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) & TMA (Transcription Mediated Amplification)현재 BioMerieux사에서 기술을 보유하고 있는 NASBA와 Gen-Probe 사에서 기술을 보유하고 있는 TMA는 RNA를 중점적으로 이용하는 증폭기술로써 기능상 매우 비슷하다. 이 기술들은 RNA specific 한 기술로써, 현재 가장 많이 사용하고 있으며, 특징으로는 프라이머 한곳에 T7 polymerase가 활동할 수 있는 promotor sequence를 보유하고 있다는 것이다. 이 기술이 현재 각광받고 있는 이유 중에 하나는, 단일온도에서 수행되기 때문에, PCR과 같이, 온도 조절기가 필요하지 않고, 간단하게 RNA를 specific 하게 증폭할 수 있다는 것으로써, virus 검사나 살아있는 박테리아 검사 시 유용한 검사법으로 알려져 있다.[NASBA의 기본 원리]기본적으로 NASBA의 원리를 간단하게 요약하면 다음과 같다. 기본적으로 NASBA는 PCR과 같이 두 개의 프라이머를 기본으로 한다. 하지만, 아래 그림에서 보여지듯이, 프라이머 1은 5' 말단에 T7 polymerase promotor를 가지고 있다. 프라이머 1이 타겟 RNA 와 혼성화 반응이 일어나게 되면, RTase에 의해 RNA를 기초로 하여, DNA가 역전사가 일어나ivity와 ISH의 specificity를 고루 갖추고 있다. ISPCR의 실험원리는 일반적인 CPR 방법과 같으나, slide glass 등의 사용에 적합한 ISPCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.ISPCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질(예:PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCL, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR이 끝난 후에 세포 안에서 증폭된 PCR 산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로 적당한 세제의 적절한 선택과 사용이 무엇보다 중요하며 PCR 산물이 세포 밖으로 유출되는 것을 막기 위해서는 single primer pair with complementary tail, biotinylated dNTPs, multiple overlapping primer pair 등을 이용한 방법이 소개되어 있다.현재까지 ISPCR 방법의 효율은 그다지 높지 못한 것으로 알려져 있으며 specificity를 증가시키기 위해서는 DNA probe를 이용한 in situ hybridization을 시행하거나 Southern blot hybridization을 시행하는 것이 좋은 방법이 된다. 효율이 별로 높지 못한 방법임에도 불구하고 ISPCR에 대한 관심이 최근 크게 증가하고 있는 것은 여러 가지 질병들의 조기 발견에 큰 도움을 받을 수 있을 것으로 기대되기 때문이며, 지금도 여러 회사에서 ISPCR에 유용한 기구들을 제작, 판매하고 있으나 더 좋은 기구의 개발이 이루어져 효율을 더욱 높일 수 있다면 ISPCR이 더욱 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.10. DDPT-PCR(Differential Display Reverse Transcript있다.

공학/기술| 2015.12.14| 25페이지| 4,000원| 조회(289)

PCR, pcr기법, 유전자 증폭 기술

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