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DNA추출과 PCR을 통한 Gene Cloning (금붕어를 이용, LacZ이용)

실험 보고서유전자공학 및 실험2015. 06. 12목차1. 실험 제목?유전자 재조합 ?2. 실험 목표?DNA추출과 PCR을 이용한 Gene Cloning ?3. 실험 방법 및 고찰(1) 금붕어 해부(2) RNA 추출(3) cDNA 합성(4) PCR(5) 전기영동(6) Gel purification(7) Ligation(8) Transformation(9) Pick up(10) 집균(11) 효소처리실험 방법(1) 금붕어 해부- 해부 준비물 : 얼음, 마취제, 가위, 핀셋, 장갑, 튜브- 해부 과정A. 금붕어를 준비하고 MS-222(마취제)를 사용하여 마취한다.B. 마취된 금붕어는 얼음 위에 올려둔다C. 해부가위를 이용하여 원하는 부위를 sampling한다.D. Sampling한 조직을 1.5ml 튜브에 담아 다음 실험까지?80℃에서 보관한다.Goldfish* Taxonomy* kingdom : Animalia 동물계* Phylum : Chordata 척색동물군* Class : Actinopterygii (Ray-finned Fish)* Order : Cypriniformes 잉어목* Family : Cyrinidae* Genus : Carassius* Species : auratus* Carassius auratus auratusCommon gold fish* The name Wakin in Japanese literally means Japanes* The Wakin is a true mutation that was originally discovered in China* The Wakin ancestor is thought to be the first type of goldfish introduced into Japan around 1500AD.* Most Wakin display a caudal peduncle flash.The fleshy area where the caudal fin attaches to the body is the light and rol에 담긴 튜브에 넣는다.C. 조직을 분쇄(homogenize)한다.(막대로 분쇄할 때 지그시눌러 분쇄하여 내용물이 튜브 밖으로 튀지 않도록 한다.)D. 실온에서 5분간 방치한다.(Trizol이 반응하는 시간을 기다린다.)E. 튜브에 Chloroform 100㎕을 첨가한다.(당류와 기타 찌꺼기 제거하는 역할.)F. Vortex를 한다.(튜브 속 내용물이 잘 섞이도록 해주는 과정.)G. 실온에서 3분 방치한다.(Chlororoform이 반응하는 시간을 기다린다.)H. 원심분리 (12000x g,4°C) 15분 실시한다.(원심분리기 사용 시 무게균형을 맞추도록 한다.)I. 윗 부분의 맑은 상층액을 다른 튜브로 옮긴다.(RNA가 들어있는 부분이다.)J. Isopropyl alcohol 250㎕를 첨가한다.(RNA 분리 침전, 응축하는 역할)K. 실온10분 방치 후, 원심분리(12000x g,4°C) 10분 실시한다.(RNA 분리,침전,응축 하는과정)L. 밑부분의 흰덩어리(RNA)를 제외한 나머지 액은 버린다.M. EtOH (70%) 500㎕를 첨가한다.(RNA를 세척하는 역할)N. 원심분리 (7500x g,4°C) 5분 실시한다.O. RNA를 제외한 나머지 액은 버린다.(RNA가 붙은 부분을 밑 방향으로 해서 피펫으로 뽑아낸다.)P. DEPC 30㎕를 넣고 Vortex를 한다.(RNase를 불활성 시킴, RNA의 양에 따라 넣어준다. )Q. -80°C에서 보관한다고찰① RNA 종류에는 rRNA, mRNA, tRNA가 있다. rRNA는 리보솜내에 존재하고, mRNA는 유전정보를 가지고 있으며, tRNA는 아미노산을 운반한다. 우리가 사용하는 RNA는 mRNA이다. DNA는 단백질의 아미노산 배열순서를 결정함으로써 유전형질을 발현시킨다. 이 형질발현 과정에서 RNA는 DNA의 유전정보를 전달하고 아미노산을 운반하는 역할을 한다. 단일 나선으로 매우 약하며 잘 부서지고, 따라서 얼음위에서 실험해야 한다.② 간에는 뇌 조직보다 DNA와 RNA가 매우 많이 존재한다.③ D소를 이용하여 합성한다. 역전사효소는 단일 가닥 mRNA의 아데닌, 유라실, 구아닌, 사이토신에 각각 티민, 아데닌, 사이토신, 구아닌을 짝지어 상보적 DNA를 합성한다.Oligo dT : RNA의 염기서열에서 5′-AAA........AAA-3′에 상응하는 5′-TTT........TTT ?3′형태의 염기, DNA정제에 중요한 역할(인트론이 없는) 진핵생물의 cDNA를 얻는 방법1. 진핵세포가 DNA를 RNA로 전사하고 RNA는 전사 후 변형과정을 거친다. 인트론이 제거되고 아데닐산 중합반응(Polyadenylation) 및 5' 캡 형성(5' cap)이 이루어진다.2. 세포에서 전사 후 변형 과정을 거친 성숙한 mRNA를 추출한다. 폴리-A 꼬리(아데닌)가 올리고 dT(티민)와 염기쌍을 형성하는 것을 이용하여 친화성 크로마토그래피로 분리할 수 있다.3. 프라이머로는 폴리-T 올리고뉴클레오타이드를 사용해 폴리-A 꼬리에 혼성(hybridization)되게 하거나 무작위로 6개 염기를 배열한 헥사머(hexamer) 단일 가닥 DNA를 합성하여 사용한다. 역전사효소는 프라이머가 결합한 이중 가닥 분절에서 역전사할 수 있다.4. 역전사효소와 더불어 디옥시리보뉴클레오타이드(A, T, G, C)를 넣어준다. 추출한 mRNA에 혼성된 상보적 가닥의 DNA가 합성된다.5. DNA를 계속해서 합성하기 위해서는 리보뉴클레이스(예를 들면 리보뉴클레이스 H)나 알칼리로 RNA를 분해한다.6. RNA를 분해한 후에 단일 가닥 DNA는 3' 말단에 헤어핀 구조를 형성하는 경향이 있다. 이 헤어핀 구조를 프라이머로 하여 DNA 중합효소가 cDNA를 합성한다.7. 원래 mRNA와 동일한 서열으로 이루어진 cDNA를 얻을 수 있다.실험 방법(4) PCR- 실험 과정A. DNA 변성 → Primer와의 결합 → DNA신장(사용 Primer : β-action)SDW 18.5㎕+ 10X buffer 2.5㎕+ dNTP 2㎕+ Forward primer 0.5㎕+ Reverse primerel 만들기1xTAE 25㎖Agarose 0.25gEtBr 1㎕B. PCR product 와 loading buffer를 섞어서 겔 홈에 넣는다.(loading buffer의 역할 : 분자량이 큰 글리세롤이 들어있어 무거워서 DNA가 든 시료를 가라앉히고 푸른색으로 표시되어 전기영동 하는 동안 얼만큼 진행되었는지 알 수 있다.) C. 겔의 끝부분에 marker를 넣는다.(넣을 때 피펫을 홈에 수직으로 조심스럽게 넣어 찢어지지 않도록 한다.)D. 30분 영동시킨다.E. 자외선을 조사하여 형광이 발하는 DNA 부분 중 원하는 size의 DNA 밴드만 면도칼로 잘라 tube에 보관한다.고찰전기영동 : 전기영동은 전기장의 영향을 받아 하전된 물질들이 유동성 매체내에서 이동하는 것을 말한다.하전된 성분들로는 단백질과 같은 분자나 세포 또는 하전된 입자들이 있다. 하지만 여기서 다루는 것은 하전된 분자(이온들)에 한정하기로 한다. 유동성 매체로 액체 또는 기체가 사용되지만 생물학적 시스템에 있어서는 액체를 주로 이용한다. 전기영동에서 다루는 것은 전기화학적 기법에서의 전극의 반응이나 이온 교환에서의 반대로 하전된 이온들의 상호 작용이 아니라 전기장의 영향에 의한 분자의 이동도이다.실험 방법(6) Gel purification- 실험 과정A. Gel 무게 구하기 (Gel이 든 튜브무게) - (빈 튜브무게) = Gel 무게B. Gel 무게 x 3 -> GB buffer 필요량C. 50°C에서 Gel을 완전하게 녹인다. (중간중간 Vortex)D. iso-propanol 100㎕씩 분주E. Invert 조금 후 살짝 vortex, spindown 한다.F. Spin column에 옮긴다.G. 원심분리(10000x g) 1분 실시한다.H. 하층액을 버리고 NW buffer 750㎕을 첨가한다. (세척역할)I. 실온에서 5분간 방치한다.J. 원심분리(10000x g) 1분 실시한다.K. 하층액을 버리고 원심분리(10000x g) 1분 실시한다.N. Spin column을 새 1.ubator에서 overnight으로 반응(16~18h)고찰① DNA를 대장균 내로 주입하는 과정이다.DNA의 세포벽과 막은 불안정상태여서 실온에 파괴되므로 얼음위에서 한다.② 도말은 뭉치지 않게 퍼뜨려주는 과정이다.③ 이 실험은 Clean bench라는 세균이 없는 공간에서 한다.실험 방법(8) Pick up- 실험 과정A. 15㎖ 튜브에 LB 배지 2.7㎖ + Ampicillin 2.7㎕을 넣어준다.B. 이쑤시개로 White colony를 선택하여 고체배지에 찍고, LB배지에 접종 후 흔들어줌(넣어주는 과정에서 다른 균이나 이물질이 안들어가게 조심해야한다.)C. 37℃, Shaking incubator에서 200rpm으로 over-night한다. (18~20시간)고찰Ampicillin처리시 X-gal / IPTG처리시Colony 형성불가Colony 형성가능 blue colonyColony 형성가능 white colonyAmpicillin처리 시 항생제를 포함하지 않는 배지는 Colony형성이 불가능하여 세포가 사멸하게 된다.Transformation 효율을 높이더라도 competent cell중에 DNA가 들어간 균이 적다.그러므로 항생제 처리는 필수적인 것이다.하지만 항생제 처리 후에도 원하는 DNA가 삽인된 plasmid와, 원하지 않는 DNA가 삽입된 plasmid가 존재한다.이 둘을 구분하기 위해 LacZ를 이용한 color sclection이다.Lac operon은 E.coli가 lactose를 galactose와 glucose로 분해한ㄴ데 필요한 효소인 β-galactosidase를 만드는 유전자이다.lactose가 없을 때에는 불필요한 유전자인 β-galactosidase는생성되지 않는다. 따라서, LacZ의 MCS에 DNA가 재조합 되지 않는 colony는 LacZ가 제기능을 발휘하여 X-gel을 대사시키므로 푸른색이 되고, DNA가 재조합된 박테리아의 colony는 LacZ가 망가져서 기능을 하지 않아 X-gel이 그대로 남아서 흰색 col다.

자연과학| 2015.12.17| 20페이지| 2,500원| 조회(333)

유전학, 전기영동, Transformation, 금붕어, ligation, Lac..

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