서론생물학자들은 생물을 정확하게 동정하고 분류할 수 있기 노력해 왔다. 전통적으로 표현형, 형태적 특성의 유사성과 상이성에 기초해서 이루어져 왔지만, 이는 표현형 자체의 변이 때문에 쉽지 않다. 생화학적 특성을 이용한 동정 및 분류는 동일 종 내 변이 뿐만 아니라 외부 조건에 따른 변이가 다양하기 때문에 어려움이 있다. 특히 균류의 경우 지구상에서 가장 많은 종 수를 보유하고 있는데 대부분이 순수 배양이 불가능하다. 따라서 배양 과정을 거치지 않고 시료에서 핵산을 직접 추출하여 염기서열을 읽어 생물을 동정하고 분류하는 방법이 이러한 단점을 해결해줄 것으로 제시되었다. Ray Wu의 최초 DNA sequencing 방법에 더해 현재는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법과 NGS(Next Generation Sequencing) 기술의 발전에 힘 입어 생물의 대규모 염기서열을 빠르고 정확하게 얻을 수 있게 되었고 이를 통해 생물을 분류할 수 있게 되었다.균류를 위해서는 16S rRNA 유전자의 염기서열이 가장 널리 이용되고 있다. 16S rRNA 유전자는 우선 모든 원핵 생물에 존재하고, 분자 시계(Molecular Clock)로 작용한다고 알려져 있다. 이는 이 유전자가 세포 기능에 필수적이어서 보존성을 갖기 때문이다. 16S RNA 유전자는 약 1,550bp의 길이를 가지고 있고 변이 부위와 보존 부위가 번갈아 나타난다. 보존 부위를 통해 연관관계가 먼, 생명체 분화 초기의 분류에 이용할 수 있는 반면, 변이 부위는 종 사이의 비교에 이용할 수 있다. (1)본 실험에서는 MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)7 소프트웨어로 16S rRNA와 mtDNA를 이용해 각각 Bacterial phylogenetic tree와 척추동물의 phylogenetic tree를 그리고 분석하 것을 목적으로 하였다.실험 방법 및 재료개인용 PC에 MEGA7을 설치하고, 주어진 Bacterial 16S rRNA gene에 대해 MEGA7 프로그램을 이용하여 phylogenetic tree를 그렸다. 또한 NCBI(National Center for Biotechnology Informatics) 웹사이트에서 12개의 척추동물(Blue whale, Chicken, Chimpanzee, Cow, Crocodile, Eel, Gorilla, Gray seal, Homo-sapiens, Horse, Mouse, Orangutan)에 대한 Mitochondrion complete gene을 다운로드 하여 마찬가지로 phylogenetic tree를 그렸다.실험 결과그림 1. 16S rRNA와 12종의 척추동물의 Mitochondrion complete gene을 이용해서 MEGA7 프로그램으로 neighbor-joining method를 이용해 Phylogenetic Tree를 그린 결과이다.위의 그림처럼 MEGA7를 이용하여 neighbor-joining method를 이용해 16S rRNA와 mtDNA에 대해 각각 phylogenetic tree를 그릴 수 있었다. 가로축의 0.050는 해당 길이에 따라 유전정보가 5%만큼 차이 난다는 것을 의미한다. 또한 각 node에 적혀있는 숫자는 bootstrap value이고 이는 phylogenetic analysis를 시행할 때 node가 재 복제되었을 때 다시 생성되는 % 비율을 의미한다. (2)논의그려진 계통수를 보고 어떤 생물이 가장 진화 된 생물이라고 판단되는가?그림 1-(a)의 계통수에서 node를 중심으로 branch가 나눠지는 것은 16S mRNA의 보존 부위가 변화한 것이므로 상당한 진화가 일어난 것을 의미한다. 또한 같은 node 상에서 branch가 길어지는 것은 변이 부위가 변한 것으로, 길이가 길수록 유전적인 변화가 많다는 것이다. 이를 종합하면, 총 9번의 node를 거쳤으면서 같은 branch 길이를 가진 Escherichia Coli와 Escherichia fergusonii가 가장 진화된 생물일 것이다. 마찬가지의 논리로 그림1-(b)의 계통수에서는 7번의 node를 거치고, 그 중에서 계통수에서 가장 우측으로 떨어진 Homo-sapiens가 가장 진화된 생물일 것이다Mitochondrial eve는 무엇이고 우리가 사용한 mitochondrial complete genome phylogenetic tree를 만드는데 적합한지 알아보자.미토콘드리아에는 독자적인 DNA가 존재한다. mtDNA는 보통 DNA와 달리 재조합 없이 모계로부터만 유전되기 때문에, 이에 대한 유전적 정보를 바탕으로 거슬러 올라가 모든 인간에게 공통적으로 발견되는 mtDNA를 가지는 여성의 연도와 지리적 위치를 대략적으로 추측하였고, 그녀를 Mitochondrial eve라고 부른다.유전자의 배열 순서를 계통학적으로 이용하는 데에 가장 큰 전제는 동물군들간에 거의 차이가 없을 정도로 매우 보존적이어야 한다는 것이다. 그러나 유전 서열을 밝힌 결과에 따르면 종 간에도 매우 심한 유전자 재배열 양상이 나타나는 경우가 있었다. 유전자 배열이 아닌 전체 미토콘드리아 유전체의 염기서열을 근거로 계통을 논할 때에는 미토콘드리아 유전체의 진화 속도가 매우 빠르기 때문에 포화나 긴가지끌림형상과 같은 문제를 주의 깊게 해결해야 하는데 이는 어려운 문제다. (3)LUCA는 무엇인가?LUCA(Last Universal Common Ancestor)은 지구상의 모든 생명체의 공통 조상에 해당하는 생명체 중 가장 최근의 조상 생명체를 뜻한다.LUCY는 무엇인가?LUCY는 320만년 전에 살았던 오스트랄로피테쿠스로 추정되는 여성으로, 1974년 에티오피아 강가에서 발견되었다.NGS는 무엇인가?Next Generation Sequencing(차세대 염기서열 분석)은 유전체의 염기서열의 고속 분석 방법이다. 이는 기존의 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)과 달리 많은 수의 DNA를 병렬적으로 처리하여 고속으로 분석을 가능하게 한다.참고문헌[1] 최호형, 『미생물학』 아카데미서적 : 서울, 59-70 (2004)[2] Madian, Matrinko, Stahi, Clark, 『Brock의 미생물학(13판)』 바이오사이언스 : 서울, 491-500 (2012).[3] Hwang UW, Friedrich M, Tautz D, Park CJ and Kim W : Mitochondrial protein phylogeny joins myriapods with chelicerates. Nature 413: 154-157 (2001).생물학실험 4. Phylogenetic tree
서론배지란 미생물이나 세포를 키우기 위한 액체 또는 고체(젤 상태)의 인공 영양원이다. 모든미생물의 생장에는 C,H,O,N,S,P 원소가 필수적으로 필요한 것과 함께 종마다 다른 종류의 미량 원소가 추가적으로 필요하다. 이 때 적절한 영양원을 갖춘 배지를 이용하여 한 종류의 분리된 특정 미생물만 배양하는 것을 순수배양이라 한다. 미생물의 분리는 고체배지상에서 이루어지는데, 고체배지는 액체배지에 Agar(한천), Gelatin 등의 응고제를 넣어 만들어진다. 특히 Agar은 70%의 Agarose와 30%의 Agaropectin 혼합물로 해초 세포벽의 구성물질에서 얻어지며, Gelatin에 비해 녹는점이 높고 미생물에 의해 잘 분해되지 않는 특성 때문에 고체배지로 쓰이기 적합하다. 분리 배양 방법 중 하나인 ‘Spread Plate Technique’ 은 액체 배양된 미생물을 정확한 비율로 여러 번 희석하여, 희석된 미생물을 고체배지 위에 골고루 spread-plating 한 뒤 배양해 colony들을 얻는 것이다. (1)본 실험에서는 주어진 E. Coli 시료를 최대 1000배로 Serial Dilution(순차적 희석)한 뒤 고체배치에 spread plating한 후 배양한 것을 관찰하였다. 또한 자라난 colony의 개수로부터 원래 시료의 CFU(Colony Forming Unit)을 계산하는 것을 실험의 목적으로 하였다.실험 재료 및 방법무균 작업대에서 3개의 1.5ml tube에 멸균수를 900ul씩 담았다. 그리고 잘 섞인 E. Coli 시료 100ul을 pipetting해서 첫번째 tube에 넣어 1/10 희석 시료를 만들었다. 새롭게 만들어진 희석 시료 100ul을 pipetting해서 두번째 tube에 넣어 1/100 희석 시료를 만들고 같은 방법으로 1/1000 희석 시료를 만들었다. 잘 섞인 1/100, 1/1000 희석 시료를 100ul씩 pipetting해서 멸균된 LB plate 고체 배지에 뿌리고, 서로 다른 일회용 spreader로 plate에 골고루 spread-plating 했다. 다음으로 Spreading한 시료가 마른 후 plate를 뚜껑 위에 덮었다. 완성된 plate를 항온 배양기에 넣어두고 하룻동안 배양한 후, colony 수를 세어 원래 시료의 CFU 농도를 계산했다.실험 결과그림1에서 볼 수 있듯이 희석이 1/10배 됨에 따라 배양균이 형성한 colony 밀도가 낮아진 것을 확인할 수 있었다.그림 2처럼 구획화를 해서 Colony Counting을 한 결과 5개의 구획에 대해 각각 30, 32, 29, 26, 18개 였다. 전체 원의 넓이 대 사각형 구획 하나의 넓이 비는 100 : 3.2 이고, colony 수의 평균은 27 이므로, 총 colony 수는 약 이다. Spread plating한 부피는 100ul이고 희석 배수는 이므로, 원래 시료의 CFU 농도는 (colonies/ml) 이다.그림 3. OpenCFU를 이용하여 colony counting을 한 결과이다.추가적으로 그림 3과 같이 OpenCFU 소프트웨어를 이용하여 colony 개수를 측정하였다. 이때Threshold와 Radius 값을 Auto로상태에서 측정한 colony 개수는 773이었다. 그림을 보면 붉은색원 부분을 소프트웨어가 읽지 못했는데, 이를 모두 포함하면 844에 근접한 결과값을 얻는다.논의희석된 E. Coli 배양균에 대한 spread plating을 통해 원래 시료의 CFU 농도를 계산할 수 있었다. 정확한 비율의 희석이 이루어지는 하에 희석 배수를 더 높인 상태에서 colony의 개수를 측정하면원래 시료의 CFU 농도를 더 정확하게 측정할 수 있을 것이다.생물의 필수 원소들이 생물이 생장하는데 어떻게 쓰이는지 알아보자.생물의 필수 원소 중 생장에 많은 양을 필요로 하는 다량 원소에는 C, H, O, N, S, P가 있다. 이 중 C, H, O, N, S, P는 탄수화물, 지질, 단백질, 핵산의 주요 구성 성분이 된다. 또한 C, H, O는 에너지 공급과 전자전달체 및 유기 분자의 골격을 구성하는 필수적인 원소이다. 또한 미량 원소에는 Mg, Fe, K, Zn, Co, Cu, Mn, Mo, Ni이 있다. 이 중 K는 효소를 활성화 하는 역할을 하고 Ca는 내생포자가 내열성을 갖도록 한다. 또한 Mg는 리보솜과 세포막의 안정화에 기여하고 Fe는 시토크롬과 조효소의 구성물질이다. Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu는 단백질 구조 유지에 필요하며 생체 반응의 촉매 역할을 한다. 필수 원소가 결핍 되면 다른 원소의 양에 관계 없이 생물의 성장이 이루어질 수 없다. [1]CFU(colony-forming unit)의 정의는 무엇이며, 왜 cell의 개수가 아니라 CFU라는 개념을 사용하는지 생각해 보자.미생물학에서 CFU(Colony-Forming Unit)는 plate에 자라난 눈에 보이는 박테리아나 균류의 colony 숫자를 세어, sample의 살아있는 박테리아와 균류의 세포 수를 추정하는 데에 쓰이는 단위이다. Colony는 일반적으로 여러 박테리아가 모여 형성하는 것이 아니라 하나의 박테리아가 성장하고 분열하여 하나의 집락을 형성하므로 집락 수는 곧 생균수로 계산할 수 있다. Cell의 개수를 현미경으로 직접 관찰하는 경우(직접 현미경 측정법, Direct microscopic count), 죽은 세포를 살아있는 것과 구분할 수 없고 크기가 작아 관측하기가 힘들어서 정확도가 낮다. 또한 1ml당 세포가 이하일 때와 같이 세포 밀도가 낮은 시료의 경우 측정할 수 없다. 따라서 미생물이 특정 영양물질과 온도, 시간 하에서 복제를 하여 colony를 형성하는 사실을 이용하여, colony 숫자를 구해 간접적으로 cell의 숫자를 추정한다.[1]대부분의 세균들은 아직 배양이 되지 않고 있다. 미생물 연구에서 왜 순수 배양이 중요할지 생각해 보고, 배양이 어려운 미생물들은 어떻게 배양하거나 연구되는지 알아보자.미생물은 자연계에서 대부분 다른 생물들 상호작용 하며 섞인 상태로 존재한다. 그러나 특정한 미생물의 형태와 구조, 영양요구조건 및 다른 미생물과의 상호관계와 병원성 등 개별 성질을 연구하기 위해서는 우선 필요한 미생물만 따로 분리하여 그 미생물만 배양하는 순수 배양이 필수적이다.배양이 어려운 미생물들은 세균이 분리되어 성장하고 보존하기 위한 적합한 환경을 유지하기가 힘들기 때문이다. 이를 위해 동결건조법이나 토양 보존, 계대배양보존, 동조배양을 이용하기도 한다. [1]배양이 힘든 미생물들은 배양 과정을 거치지 않고 시료에서 핵산을 직접 추출하여 염기서열을 읽어 생물을 동정하고 분류하는 방법(Metagenomics)을 이용하여 연구를 한다. Ray Wu의 최초 DNA sequencing 방법에 더해 현재는 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법과 NGS(Next Generation Sequencing) 기술의 발전에 힘 입어 생물의 대규모 염기서열을 빠르고 정확하게 얻을 수 있게 되었고 이를 통해 생물을 분류할 수 있게 되었다.참고문헌[1] 최호형 ,『미생물학』아카데미서적 : 서울, 23-112 (2004)[2] Madian, Matrinko, Stahi, Clark, 『Brock의 미생물학(13판)』 바이오사이언스 : 서울, 491-500 (2012).생물학실험 3. 미생물 배양
Abstract식물은 배양 환경에 따라 다양한 표현형과 특징을 나타내며 성장한다. 일반적으로 종자나 어린 식물을 연구하기 위해 배지 배양을 이용하고, 여기에 영양소와 호르몬 등 조건을 조절하며 식물의 반응을 관찰한다. 이 뿐만 아니라 온도 조절과 빛의 유무, 적절한 양의 호르몬 등이 종자의 발생과 생장, 개화에 영향을 유도하기도 하고 억제하기도 한다. 이 실험에서는 배양 환경에 따른 식물의 표현형 변화를 관찰하기 위해 식물생리의 대표적인 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용했다. 애기장대 씨앗을 파종 후 광조건과 암조건에서 배양하고, 대조군과 함께 세 가지 호르몬(옥신,지베렐린,앱시스산)에 대해 배양 후 관찰했다.Introduction식물은 배양 조건에 따라 다른 표현형을 나타내며 성장한다. 종자나 어린 식물을 연구하기 위해 배양 환경을 세밀하게 조정할 수 있는 배지 배양을 이용하는데, 일반적으로 식물에 필요한 영양소를 풍부하게 함유하고 있는 ‘MS배지’가 이용된다. 씨앗을 소독 후 배지에 뿌리면 배양실에서 생장하기 이전에 춘화처리를 거친다. 춘화처리란 작물의 개화를 유도하기 위해 일정시기 동안 일정 온도(주로 저온)처리를 하는 것이다. 춘화처리를 필요로 하는 식물에게 이를 시행하지 않으면 개화가 지연되거나 영양기에 머물게 된다. 한편, 빛의 유무가 배양 유식물의 성장에 영향을 미친다. 식물체는 피토크롬(Phytochrome)이라는 광흡수색소를 갖고있는데 이는 상호 전환이 가능한 유사한 두 가지 형태로 존재한다. 형은 적색광을 흡수하면 형으로 전환되고, 그 역과정은 원적색광을 흡수하거나 적색광이 없으면 일어난다. 피토크롬은 식물 생장 패턴이 흡수하는 빛의 파장에 따라 달라지는 광형태성(Photomorphogenesis)에 주요한 역할을 하고, 발아 조절 기능과 광주기인식 기능을 한다. 이는 광조건과 암조건실험에 따른 성장패턴 차이를 확인해서 알 수 있다. 한편 식물호르몬 또한 식물 생장에 중요한 역할을 한다. 식물호르몬은 식물체내에서 합성되며 조직에 극소량 작용하여 그 효과를 내는 화학물질이다. 동물호르몬과는 다르게 합성 및 분비되는 조직이 특정 조직으로 국한되지 않고 식물체 전반에 폭 넓은 영향을 미치는 것이 특징이다. 대표적인 식물호르몬으로는 옥신(Auxin), 지베렐린(Gibberelin), 앱시스산(Abscisic acid) 등이 있다. 옥신은 식물의 생장 조절 물질의 하나로 성장, 발근을 촉진하고 낙과를 방지하며 착과를 조절한다. 지베렐린은 식물 전체의 신장을 촉진하고 개화와 열매 성장을 촉진한다. 앱시스산은 환경저항성과 병원저항성에 관여를 하는 호르몬이다. (1)애기장대(Arabidopsis thaliana)는 조그만 개화식물로서 식물생리 및 유전학의 모델 식물로 널리 사용되고 있다. 애기장대는 Brassicaceae과에 속하며 근친종으로는 배추같은 것을 들 수 있다. 애기장대는 잡초이며 농업적인 중요성은 가지고 있지 않지만 유전학과 분자생물학적 연구에 매우 중요한 식물이다. 애기장대의 중요한 특징으로는 우선 생활사가 짧아 파종으로부터 6주면 종자를 얻을 수 있고, 제한된 공간에서 비교적 많은 식물을 키울 수 있다. (2)본 실험에서는 소독한 애기장대 씨앗을 광조건과 암조건, 각기 다른 호르몬 조건의 배지에서 배양하여 유식물체를 관찰했다. 이를 위해 먼저 애기장대 야생형 유식물과 성체 애기장대를 관찰하여 관찰 기준을 확인했다.Materials & Method1주차에 애기장대 야생형 유식물과 성체 애기장대의 표현형을 관찰했다. 2주차에는 씨앗을 소독하고 준비된 배지에 파종을 하였다. 먼저 씨앗이 담긴 1.5ml e-tube에 파이펫을 이용하여 70% EtOH 1ml를 넣었다. 5분간 hard inverting을 하는 동안 클린 벤치 안에서 필터페이퍼에 95% EtOH를 뿌려놓았다. 파이펫으로 씨앗은 남긴 채 솔루션만 제거하고, 70.5% EtOH+Triton X100 0.08%를 넣고 10분간 hard inverting 했다. 다시 솔루션만 제거하고 95% EtOH 1ml를 넣고 1분간 inverting했다. 소독된 씨앗을 파이펫으로 빨아들여, 필터페이퍼 위에 뿌려 놓고 건조했다. 작은 팁을 이용해서 배지에 건조된 씨앗을 일렬로 뿌리고 Sealing과 Foiling을 했다. 그 후 각 플레이트를 에서 춘화처리 후 배양기(에서 생장시켰다. 암조건과 광조건에서 배양했고 식물호르몬에 대해서는 대조군과 지베렐린, 앱시스산, 옥신에 대해 각 한 개씩 배양한 후 3주, 4주차에 걸쳐 식물체를 관찰했다.Result그림 1에서 확인할 수 있듯이 성체 애기장대의 꽃, 줄기, 뿌리를 관찰 후 촬영했고, 수술, 암술머리, 씨앗, 꽃받침, 줄기, 잎을 현미경으로 X10에서 관찰했다. 그림 2에서 확인할 수 있듯이 유식물의 잎과 뿌리를 현미경으로 X10에서 관찰했다.대조군옥신지베렐린ABAHypocotyl length0.17450.14760.19950Root length2.0760.40621.4080.1405Especial phenotype표 SEQ 표 * ARABIC 1. 세가지 호르몬 조건과 대조군을 배지에서 배양한 유식물의 하배축과 뿌리 길이,특이 표현형을 표로 정리한 결과이다. 표의 숫자는 1cm을 1로 했을 때 상대적인 길이이다.길이 측정 시 ImageJ 프로그램을 이용하였다.그림 3에서 확인할 수 있듯이 광조건에서 자란 유식물은 뿌리가 짧고 떡잎이 자랐다. 반면에 암조건에서 자란 유식물은 뿌리가 길게 자랐다. 그림 4에서는 현미경으로 X40에서 이를 관찰했는데 광조건에서 떡잎이 두개 자랐고, 암조건에서는 떡잎이 없는 것을 확인했다.Discussion본 실험에서 애기장대를 식물의 모델 개체로 활용했다. 애기장대는 모델 생물로서 가장 중요한 특성이라고 할 수 있는 빠른 생장주기를 갖고 있다. 발아가 된 이후 씨앗을 만들 때 까지 약 6주가 소요되며, 비교적 짧은 시간 동안 성장 과정을 관찰할 수 있다. 또한 정도의 온도를 맞춰주고 일정한 빛을 비춰 주면 충분히 잘 자라기 때문에 기르기 또한 용이하기 때문에 실험에서 모델 개체로 사용하기에 적합했다. 애기장대는 Brassicaceae과에 속하며 근친종으로는 배추같은 것을 들 수 있다. 애기장대는 잡초이며 농업적인 중요성은 가지고 있지 않지만 유전학과 분자생물학적 연구에 매우 중요한 식물이다. (2)2주차 실험 시에 애기장대 씨앗에 소독과 춘화처리를 하였다. 씨앗 소독을 한 이유는 박테리아, 곰팡이, 바이러스 등이 씨앗 표면에 부착해 있거나 씨앗 내부에 침입하여 발아를 막는 경우를 방지하기 위해서이다. 소독에 사용한 EtOH은 삼투능력이 커서 세균 표면의 막을 잘 뚫고 들어간다. 막을 뚫고 들어간 EtOH는 단백질을 응고시켜 세균을 죽인다. 또한 Triton-X100은 세포를 용해시켜 단백질과 소기관들을 추출해내어 소독작용을 한다.(3)호르몬을 처리한 유식물들을 관찰한 결과 우선 옥신을 처리한 애기장대의 shoot 성장이 대조군 적었다. 이는 옥신이 낮은 농도인 일 때 세포 생장을 촉진하는 반면 이상의 농도에서는 에틸렌 합성을 유도하여 뿌리의 신장을 억제하기 때문이다.(1) 따라서 이번 실험에서는 이상 농도를 가진 옥신 무균 배지를 사용했다고 볼 수 있다. 또한 원뿌리보다 곁뿌리의 성장이 잘 이루어진 것과 부정근이 생성된 것을 확인했다. 이는 옥신을 처리했을 때 나타나는 주요 특징으로, 비슷한 양의 영양분을 곁뿌리와 부정근 형성에 이용했기에 옥신을 처리한 애기장대의 원뿌리가 대조군 보다 짧았다. 지베렐린은 줄기신장과 종자 발아를 모두 촉진하는 역할을 한다. 실험 결과 대조군과 비교해 뿌리 길이는 큰 차이가 없었고 하배축 길이 신장이 있는 것을 확인할 수 있었다. 앱시스산은 종아의 휴먼을 유도하고 발아를 억제하는 역할을 한다. 실험 결과 앱시스산 배지의 애기장대는 하배축 신장이 없었고 뿌리 신장 또한 거의 일어나지 않은 것을 확인했다. 발아를 하지 않은 다른 씨앗들의 경우 춘화처리 시간이 짧았거나 소독과정에서 문제가 발생했을 것이라고 추측된다. (1)Reference[1] Campbell, N,A. Biology(tenth edition) Pearson education: NJ, 870-888(2016)[2] Smith A. M, et al. Plant Biology(first edition) Garland Science: NY, 345-380(2010)[3] Koley, D., Bard, A.J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc Natl Acad Sci USA 107, 16783-16787(2010)생물학실험 – 식물 배양 및 식물호르몬
Introduction생물은 매우 다양한 종류의 세포로 구성 된 조직체이다. 이들 세포가 유기적으로 연결되고, 제 기능을 수행할 때 생물은 하나의 온전한 개체로서 생존할 수 있다. 다세포 생물의 경우, 하나의 수정란(zygote)으로부터 완전히 기능하는 개체(adult)가 되기까지 점진적으로 많은 변화를 거치는데 이러한 과정을 발생(development)이라고 한다. 닭의 배 발생 시 나타나는 많은 과정들은 다른 양막류에 속하는 척추동물, 특히 포유류의 경우와 많은 유사성을 보인다. 포유류의 배는 실험과 연구에 필요한 충분한 수를 확보하기 어려운 반면 닭의 배는 재료를 구하기가 비교적 용이하며, 또 원하는 발생 단계를 비교적 쉽게 얻을 수 있기 대문에 배 발생의 초기 과정을 관찰하기에 적합하다.달걀을 부화시키기 위해서는 부화기를 이용해 적절한 환경 조건을 맞춰주어야 한다. 부화는 약 21일정도 소요되며 일반적으로 부화 19일 동안인 발육 시기에 온도는 37.5~37.7°C, 습도는 50-60%를 맞춰주어야 한다. 또한 부화기간 중 적어도 14일간은 반드시 달걀을 뒤집어 주는 전란을 4-5시간마다 1회씩 하루에 4-5회 정도 실시해야 한다. 이는 달걀 내부에 병아리가 발생하는데 필요한 영양분을 골고루 공급하기 위해서이다. 전란을 하지 않으면 기형으로 태어나거나 중지란이 될 가능성이 높다. 또한 전란을 통해 달걀 내부에 고른 온도를 유지하게 되고, 배자가 계란 껍질 안쪽에 붙어있는 하얀 막인 난각막에 붙어서 죽는 경우를 방지해 준다.(1)호르몬은 심장과 같은 기관에 신경전달물질로 작용해서 영향을 미칠 수 있다. 대표적인 호르몬인 에프네프린(아드레날린)은 부신 수질에서 분비되는 호르몬이자 교감신경의 주요 신경전달물질이다. 호르몬으로서는 혈당을 조절하는데 관여하며 신경전달 물질로서는 몸의 fight-or-flight 반응(근 혈관확장, 소화억제, 심장박동 촉진 등)을 유도한다. 아세틸콜린은 부교감신경의 말단에서 분비되는 신경전달물질로 혈압강하, 심장박동억제, 장관수축, 골격근수축 등 에피네프린과 반대 작용을 한다.(2)본 실험에서는 7일차 배아를 달걀로부터 꺼내어 심장박동수를 측정했다. 또한 에프네프린과 아세틸콜린을 처리한 후 심장박동수가 어떻게 변화하는 지를 관찰하고 비교했다.Materials & Method7일차 수정란을 뾰족한 부분이 위로 향하게 하여 세운 상태에서 위쪽에 핀셋으로 구멍을 낸 다음 핀셋으로 조심스럽게 껍데기를 뜯어냈다. 하얀 막은 막 아래에 있는 배아에 손상이 가지 않도록 조심히 걷어냈다. 배아 및 난황이 망가지지 않도록 주의하며 petri dish 안에 내용물을 천천히 쏟아냈다. 이 때 내용물이 밖으로 새지 않도록 주의했다. 분리된 배의 심장박동 수를 실온 상태에서 10초간 측정했고 이를 3회 반복해서 평균 값을 구했다. 다음으로 0.1% 에피네프린 용액을 피펫을 이용해 심장에 몇 방울 떨어뜨리고 15초 동안 방치해서 효과가 나타나게 한 다음 심박동수를 이전과 같은 방법으로 측정했다. 배가 붙어있는 여과지를 새로운 식염수가 담긴 petri dish로 옮긴 후 0.1% 아세틸콜린 용액을 심장에 몇 방울 떨어뜨리고 약 1분 동안 방치한 후 아세틸콜린의 효과가 나타나게 한 다음, 마찬가지로 박동수를 측정했다. 위의 실험을 여섯 조에 대해서 실시 했다. 실험 후 사용한 달걀은 껍데기는 검은 봉투에 담아 냉동고에 처리하고, 내용물을 1L 비커에 모아 화장실 변기에 버렸다. 다 쓴 petri dish는 검은 봉투에 그대로 버렸다.Result대조군처리1차/10초2차/10초3차/10초평균 박동수/10초평균 박동수/1분대조군2613-19.5117에피네프린1910161590표 SEQ 표 * ARABIC 1. 첫번째 달걀에 대한 대조군과 에피네프린을 처리했을 때 측정 결과이다.대조군처리1차/10초2차/10초3차/10초평균 박동수/10초평균 박동수/1분대조군1414-1484아세틸콜린98-8.551표 SEQ 표 * ARABIC 2 두번째 달걀에 대한 대조군과 아세틸콜린을 처리했을 때 측정 결과이다.대조군처리1차/10초2차/10초3차/10초평균 박동수/10초평균 박동수/1분대조군17458.752아세틸콜린6323.722표 SEQ 표 * ARABIC 3 세번째 달걀에 대한 대조군과 아세틸콜린을 처리했을 때 측정 결과이다.대조군처리1차/10초2차/10초3차/10초평균 박동수/10초평균 박동수/1분대조군2120사망20.5123표 SEQ 표 * ARABIC 4 네번째 달걀에 대한 실험이다. 3차 대조군 측정 시 사망했다.대조군처리1차/10초2차/10초3차/10초평균 박동수/10초평균 박동수/1분대조군444 → 사망424표 SEQ 표 * ARABIC 5 다섯번째 달걀에 대한 실험이다. 3차 대조군 측정 후 사망했다.달걀 6개에 대해 실험을 하였지만 배아를 꺼내는 과정에서 사망하거나 꺼낸 뒤 혹은 얼마가지 않아 사망한 배아가 3개였다. 첫번째 닭은 평균 박동수가 대조군 117회/분에서 에피네프린 처리 후 90회/분으로 감소했다. 두번째와 세번째 달걀은 평균 박동수가 각각 대조군 84회/분, 52회/분이고 아세틸콜린을 처리 후에는 51회/분, 22회/분으로 측정되었다. 네번째와 다섯번째 달걀은 대조군 측정 시 평균 박동수가 각각 20.5회, 4회였고 곧 사망했다.Discussion에피네프린은 심장 박동수를 증가시키는 작용을 하고 아세틸콜린은 심장 박동수를 감소시키는 작용을 하는 호르몬으로 알려져 있다. 첫번째 달걀은 에프네프린을 처리했음에도 불구하고 평균 박동수가 감소했는데, 이는 대조군 1차 측정 수가 다른 값들에 비해 큰 것에 기인한다. 측정 과정에서 오류가 있었을 것이라고 예상된다. 대조군 1차 측정을 제외하고 2차 측정 값만을 이용하면 분당 평균박동수는 대조군이 78회, 에피네프린 처리 후가 90회로 증가한다. 두번째와 세번째 달걀에 대해서는 모두 분당 평균 박동수가 감소했고 이는 아세틸콜린에 의한 영향이라고 볼 수 있다.난황(Yolk)은 달걀을 깨면 나오는 노른자위에 해당하는 것인데, 새나 물고기 같은 난생 동물의 알에 포함되어 있는 영양 물질로서 배가 성장하는 동안 영양을 공급한다. 난황은 생물의 초기 생장에 필요한 영양분을 공급하는 만큼 단백질과 지방, 탄수화물, 무기질, 비타민을 모두 포함하고 있으며 동물에 따라서 단백질이 주가 될 수도, 지방이나 탄수화물이 많을 수도 있다. 계란의 부화기간 중 적어도 14일간은 반드시 달걀을 뒤집어 주는 전란을 4-5시간마다 1회씩 하루에 4-5회 정도 실시해야 하는데, 이는 달걀 내부에 병아리가 발생하는데 필요한 영양분인 난황을 내부에 골고루 분포하게 하여 적절히 공급하기 위해서이다. 전란을 하지 않으면 기형으로 태어나거나 달걀이 중지란이 될 가능성이 높다. 또한 전란을 통해 달걀 내부에 고른 온도를 유지할 수 있고, 배자가 계란 껍질 안쪽에 붙어있는 하얀 막인 난각막에 붙어서 죽는 경우를 방지해 주기 때문에 발생과정에서 아주 중요하다.(1)유정란은 암탉과 수탉의 짝짓기로 나온 달걀이며 무정란은 수탉 없이 암탉 혼자서 만드는 달걀이다. 무정란은 배반의 중심부에 진한 백색의 점을 갖고 있고 그 주위에 엷은 백색의 물질이 있다. 외곽 둥근선이 명확하지 않아 불규칙한 무약을 하고 있다. 또한 수정되지 않았기 때문에 세포분열을 하지 못한다. 반면에 유정란은 배반의 중심부가 뚜렷하지 않고, 중심부 주위에 백색의 링이 나타난다. 배반 중심부의 원형질에서는 배아의 발육을 위한 세포분열이 왕성히 진행된다.배아의 신경계의 발생이 충분히 되었다고 가정을 할 때, 간뇌 시상 하부에는 체온 조절 중추가 있어서 추울 때는 발열량을 늘리거나 열발산량을 줄여 체온을 상승시키며, 반대로 더울 때는 발열량을 줄이고 열발산량을 늘려 체온을 낮추는 조절을 한다. 추울 때는 간뇌 시상 하부의 체온 조절 중추의 작용으로 뇌하수체와 교감 신경이 자극된다. 교감 신경은 부신 수질에서 아드레날린의 분비를 촉진시키고, 뇌하수체에서는 갑상샘 자극 호르몬(TSH)과 부신 피질 자극 호르몬(ACTH)의 분비가 증가하여 각 호르몬은 갑상샘에서의 티록신의 분비와 부신 피질에서의 당질 코르티코이드의 분비를 촉진시킨다. 이들 세 호르몬은 간과 근육에서의 물질대사 및 심장 박동을 촉진시켜 발열량을 늘린다. 그러므로 온도를 감소시킬 경우 배아의 신경계와 내분비계가 정상적으로 발달하였다면 심장박동수는 증가할 것으로 추측된다. (2)도파민은 카테콜아민 계열의 유기 화합물로, 다양한 동물들의 중추 신경계에서 발견되는 호르몬이자 신경전달물질이다. 도파민은 중뇌의 흑질과 복피개세포(VTA)를 포함한 뇌의 여러 영역에서 생산되고, 뇌에서 도파민 수용체로 알려진 D1~D5와 그 변종을 활성화 시켜서 뇌신경 세포들 간에 신호를 전달한다. 호르몬이 작용하기 위해서는 해당 호르몬에 대한 수용체가 작용세포에 존재해야 한다. 그러나 심장에는 도파민 수용체가 없기 때문에 심장에 도파민을 처리하더라도 별다른 변화가 일어나지 않을 것이라고 예상된다.(2)Reference[1] Gilbert, S.F. 『발생 생물학(10판)』, 라이프사이언스: 서울, 219~246(2015)[2] Campbell, N.A. Biology(tenth edition) Pearson education: NJ, 928-947(2016)생물학실험 – 모듈 3 – 닭 발생
Introduction동물체는 기관과 기관계들이 정교하게 조화를 이루어 환경에 잘 적응되도록 진화되어왔다. 척추동물은 모든 동물문 중에서 가장 진화된 것으로서, 몸은 좌우 대칭이며 머리 ·몸통 ·꼬리의 3부분으로 구분된다. 발생 초기에는 몸의 중축에 반드시 척색이 생기며, 나중에 그 주위에 연골성 조직으로 된 척추골(vertebrate)이 생긴다. 척추동물은 원구류, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류 등으로 분류되는데, 척추 동물문 중 가장 고등한 포유류 중 하나인 생쥐(Mus musculus)는 포유류 몸체의 구조를 보기위해 생물 실험에서 흔히 사용된다.생쥐의 내부구조는 횡경막에 의해 흉강과 복강으로 나뉜다. 흉강은 심장과 폐를 포함하며 복강은 위, 소장, 대장, 간, 비장, 신장 등의 기관을 포함하고 있다.식도를 따라 가장 먼저 마주치는 기관은 소화기관 중 하나인 위이다. 위의 구조는 입구 부분인 전위, 중앙의 대부분인 위 기저부분, 장쪽의 볼록한 만곡인 큰 만곡, 간쪽의 오목한 만곡인 작은 만곡으로 구분되고, 유문을 통해 십이지장에 연결된다. 위에는 위샘이라는 외분비샘이 존재하는데, 단백질을 소화하는 펩시노겐과 염산이 분비된다. 또한 위벽은 산성과 단백질 분해효소의 작용을 방어하기 위해 뮤신이라는 점액질로 코팅되어 보호된다. (1)소장은 소화기관이며 십이지장, 공장, 회장으로 이루어져 있다. 생쥐의 소장 전체 길이는 코 끝부터 항문까지 길이인 몸길이의 6배가량 된다. 십이지장 내면 점막에는 수많은 주름과 그 표면에 융모가 있는데, 융모 사이로 장선이 열려있어 이곳으로 장액을 분비한다. 또한 간에서 만들어진 쓸개즙, 이자에서 나오는 이자액 등과 혼합되어 소화를 활발히 한다. 장액에는 말타아제, 락타아제, 펩티다아제 효소가 있고 쓸개즙에는 리파아제의 작용을 돕는 물질이 있으며, 이자액에는 아밀라아제, 리파아제, 트립신이 있다.대장은 맹장, 결장, 직장으로 나눌 수 있다. 대장의 주요 역할은 소화 불가능한 음식물 찌꺼기로부터 수분과 비타민의 일부, 쓸개즙비유할 수 있다. 먼저 간은 흡수된 영양소를 신체의 요구에 맞추어 필요한 물질이나 영양소로 가공 처리하고 저장한다. 포도당을 글리코겐(glycogen) 형태로 저장하고 있다가 필요하면 다시 분해해서 내보내고, 아미노산으로부터 포도당을 합성하기도 한다. 신체 내부의 대부분 세포는 에너지가 필요한 상황에서 포도당을 흡수하려 하는데, 간은 반대로 포도당을 방출하여 신체에 에너지를 공급한다는 점과 그 크기에 있어서 아주 중요한 기관이라고 볼 수 있다. 또한 간은 체내의 중요 단백질과 화합물을 합성한다. 혈액 응고에 관여하는 단백질인 알부민이 대표적이다. 간은 체내에 유해한 물질이 흡수되거나 생성된 경우, 이 물질을 무해한 것으로 변화시킨다. 단백질이 분해될 때 생성되는 유독 물질인 암모니아는 간에서 독성이 없거나 상대적으로 적은 요소 및 요산으로 변환된다. 게다가 간은 호르몬 균형을 유지하고, 혈액의 저장고 역할을 하여 체내 혈액량을 조절한다. 마지막으로 간에는 쿠퍼 세포(Kupffer cell)라는 식균작용을 하는 세포들이 있어서 간으로 들어온 세균을 잡아먹어서 방어역할을 한다. 간 아래에는 담낭(쓸개)이라는 작은 내장이 있는데. 이곳에서 지질의 유화로 소화를 돕는 알칼리성의 혼합물인 담즙(쓸개즙)을 생산한다.(2)(4)비장(지라)은 림프기관 중 가장 큰 림프기관으로 위비장인대에 묻혀 위의 큰 만곡부 외측에 부착되어 있다. 지라는 체내의 세균이나 항원을 제거하는 면역 기능을 담당하며, 노화된 적혈구, 혈소판을 포함하는 여러 혈액 세포들 및 면역글로불린이 결합된 세포들을 제거한다. 또한 적혈구와 림프구를 만들고 저장하였다가 필요할 때 내보내는 저장고 역할을 한다. 단핵 세포의 절반을 저장함으로써 신체에 상처를 입는 부위가 발생하면 상처 부위로 단핵 세포가 이동하여 상처의 치유를 돕도록 한다.(2)신장(콩팥)은 강낭콩 모양의 형태이고, 지방조직에 묻혀서 복막안 좌,우에 하나씩 존재하고 다른 복강 내장과는 달리 고정되어 있지 않다. 단위조직은 네프론이라 하고, 네프론은 개복이 용이하도록 핀을 이용해서 생쥐의 사지를 판에 고정했다. 70% 에탄올로 복부를 소독한 후 뱃가죽을 핀셋으로 잡아당겨서 얇은 가위로 절개했다. 칼 집 낸 부위에 가위의 둥근 날이 장기 쪽으로 가도록 끝을 넣어 턱밑까지 절개했다. 털이 장기에 묻지 않도록 핀셋으로 외피를 양쪽으로 벗겨서 핀으로 고정했다. 동일한 방법으로 내막을 잘라서 핀으로 고정한 후 관찰했다. 장기 분리는 복장장기 분리 후 흉강장기 분리 순으로 했다. 먼저 장을 분리하기 위해 대장의 항문 쪽 끝을 잘라 낸 뒤 핀셋으로 잡고 일정한 힘으로 천천히 잡아당겨서 위까지 한번에 떼어냈다. 위 위쪽으로 식도를 함께 관찰하였다. 다음으로 신장과 부신을 떼어냈다. 간을 떼어내고 비장을 떼어낸 후 수컷 생쥐의 생식기관을 분리해냈다.복부 장기를 모두 적출 후 흉강 장기를 분리했다. 횡경막과 갈비뼈가 연결되는 부위를 잘라내고 갈비뼈의 양 끝을 앞다리 아래쪽까지 조심히 잘라내어 위쪽으로 젖혔다. 갈비뼈에 붙어있는 폐가 손상이 가지 않도록 떼어냈고, 다음으로 심장과 흉선을 분리해 냈다.Result(a) 생쥐의 항문으로부터 생식돌기까지의거리가 긴 것으로 보아 수컷이었다.(b) 생쥐 개복 후 초기 관찰 모습이다.그림 SEQ 그림 * ARABIC 1. 생쥐를 안락사 시킨 후 생식돌기와 항문 사이의 거리를 통해 수컷인 것을 확인했고,개복 후 장기 분리 전에 흉강과 복강의 위치와 복강의 장기들의 위치를 확인했다.(a) 소화기를 분리한 모습이다. 왼쪽 아래대장, 맹장, 소장, 위로 소화기가 길게이어져 있었다.(b)간을 분리한 모습이다. 흑갈색을띄고 있고 여려 개의 엽으로 구성된 것을 확인 했다. 내장 기관 중크기가 가장 컸다.(c) 비장을 분리한 모습이다.긴 막대 모양의 구조였다.(d) 신장과 부신을 분리해 낸 모습이다.작은 강낭콩 모양에 신장 윗 부분에부신이 부착되어 있는 형태였다.(e) 생식 기관을 분리해 낸 모습이다. 생식기와 방광이 연결된구조를 확인할 수 있었다.그림 SEQ 그림 * ARABIC 2. 생쥐의 )에서 항문과 생식돌기의 거리가 긴 것으로 보아 수컷인 것을 확인했고, 장기 분리 전 각 장기의 위치를 개복 후 확인했다. 그림 2는 생쥐의 복강 내 장기들을 분리하여 각각 촬영한 결과이다. (a)~(e) 순서대로 소화기(대장, 맹장, 소장, 위, 식도), 간, 비장, 신장과 부신, 생식기관이다. 간은 흑갈색을 띄고 있고 여러 엽으로 구성되어 있으며 내장 기관 중 크기가 가장 컸다. 비장은 막대 모양의 구조였다. 신장은 작은 강낭콩 모양을 띄고 있고 윗 부분에 부신이 부착되어 있는 구조였다. 생식기관은 정소와 방광 등이 서로 연결되어 있었다. 그림 3은 생쥐의 흉강 내 장기들을 분리하여 각각 촬영한 결과이다. (a)~(c) 순서대로 심장, 폐, 흉선이다. 심장은 암적색의 콩알 크기였다. 폐는 좌우 두개 구조였고 선홍색을 띄고 있었다. 흉선은 분리과정에서 중앙 부분이 절제되었지만 구조를 확인하는 데 문제는 없었다.Discussion본 실험의 실험 동물인 생쥐를 실험 모델로 사용하기에 앞서 동물 실험을 하는 데 있어서 유의해야 하는 3R 원칙을 준수할 필요가 있었다. 동물 실험의 3R원칙이란 Replacement(대체), Reduction(감소), Refinement(개선)의 줄임말이다. 이는 무분별한 동물실험을 억제하고 실험동물의 복지향상과 과학적 이용 및 윤리적인 취급을 도모하기 위해 동물보호법의 원칙이고 모든 동물실험은 이 원칙을 준수해야 한다. ‘대체’는 동물실험을 수행하지 않고도 연구의 목적을 달성할 수 있는 방법이 있다면 이것으로 동물 실험을 대체해야 한다는 원칙이다. 본 실험은 생쥐의 해부와 장기확인이 목적이었으므로 동물 실험을 대체할 수 없었다. 다음으로 ‘감소’란 가능한한 실험에 사용하는 동물의 수를 줄여야 한다는 원칙이다. 본 실험에서는 각 조당 1개의 생쥐를 사용했으므로 이를 준수했다고 볼 수 있다. 마지막으로 ‘개선’이란 동물실험 시 동물에게 가해시는 비인도적인 처치(통증과 스트레스)를 최소화 시켜야 한다는 원칙이다. 본 실험에서는 를 이용한효소의 작용을 돕는 많은 수의 박테리아를 수용하고 있기 때문이다. 인간은 잡식 동물이고 육식을 많이 하기 때문에 초식동물인 생쥐보다 상대적으로 다른 장기에 비해 작은 맹장을 갖고 있다.인간의 간은 2엽으로 구성되어 있고 우엽의 크기가 좌엽보다 큰 것과 달리, 생쥐의 간은 4엽으로 구성되어 있고 생쥐의 위를 완전히 덮을 만큼 크기가 커서 특별히 발달된 기관임을 확인할 수 있었다. 간의 주요 기능은 체외에서 유입되거나 체내에서 생성된 각종 물질들을 가공하여 신체에 중요한 물질들을 합성 및 공급하는 것이다. 생쥐는 인간과 달리 항상 움직임이 바쁘고 크기에 비해 많은 양의 에너지를 소비할 것이고 이 때문에 간의 크기도 클 것이라고 추측된다. 또한 간은 해로울 물질을 해독하는 작용을 하는데 생쥐는 인간에 비해 오랫동안 세균과 유해한 물질에 많이 노출되는 상황에서 생존해 왔다. 이를 위해 다른 장기에 비해 특별히 큰 크기의 간을 갖고 있는 것으로 추측된다.생쥐는 실험용 동물로 사용하기에 용이하다. 우선 생쥐는 다양한 계통에 세대가 짧고 우수한 번식능력을 지니며 사육 관리도 다른 실험동물보다 용이하다. 또한 크기가 작기 때문에 좁은 실험실 안에서도 실험대상으로 삼을 수 있고 실험자에게 해를 끼칠 우려도 적다. 약물을 투여하거나 정상세포 및 암세포를 이식한다고 해도 체구가 작아서 여타 동물들에 비해 빠른 반응을 보여준다. 마지막으로 폐기하기도 용이하다.하지만 생쥐는 사람과 다르다는 어쩔 수 없는 한계가 존재한다. 입덧 방지제로 쓰인 탈리도마이드가 동물실험에서는 부작용이 전혀 발견되지 않았지만 임산부가 복용을 한 결과 기형아기가 수 만명 태어나면서 끔찍한 결과를 낳았다. 쥐 또한 사람과 가장 유사한 동물이 아니기 때문에 쥐에 대한 실험 결과가 인간에 대해 적용한 결과와 상당히 다를 수 있다는 단점을 갖고 있다.Reference[1] Campbell, N.A. Biology(tenth edition) Pearson education: NJ, 850-888(2016)[2] She찰