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[생물화학공학실험]Enzyme activity assay

실험제목:Enzyme Activity Assay조 :학 번 :이 름 :결과레포트1. Abstract효소는 생체 내에 존재하는 단백질로 이루어진 촉매이다. 반응에 필요한 활성화 에너지를 낮추어 보다 낮은 에너지 상태에서 반응이 쉽게 일어날 수 있도록 도와준다. 이러한 효소는종류와 조건에 따라 반응이 일어나는 효소의 활성도가 다르므로 효소의 활성이 측정될 필요가 있다.. 효소의 활성 측정은 다양한 방법이 존재하지만, 이번 실험에서는 UV spectrophotometer를 통해서 효소의 활성을 측정한다. 실험은 10분이라는 일정 간격 동안 반응을 시키고, 흡광도를 측정한 후 Lambert-beer law를 통하여 농도를 계산하여 효소 활성도를 계산한다.Abs-Time선도는 선형적으로 나와야 실험이 잘 진행되었다고 볼 수 있으며, Fig 6의 그래프의 값이 0.9665인 것을 통해서 실험적 오차가 존재했을 것으로 보았다. 실험적 오차로는 1) Sampling 과정을 통한 용액의 부피 변화, 2) 반응시간, 3) Esterification으로 보았다.2. Experiment1) 기구 및 시약(1) Candida antarctica lipase B solution (CalB)이번 실험에서 사용하는 활성을 측정할 효소로, 지방분해 효소(lipase)의 일종이다. CalB는ester기의 가수분해 반응을 유도하여 지방을 지방산과 Glycerol로 분해한다. CalB는이번실험에서 p-nitrophenyl butyrate를 가수분해하여 노란 빛을 띄는 p-nitrophenol과 butyricacid를 생성한다.Fig 1. Hydrolysis by CalBFig 2. CalB(2) 50mM p-nitrophenyl butyrate (pNPB)p-nitrophenyl butyrate (p-NPB)는 4-nitrophenyl butyrate로도 불리며, 이번 실험에서는lipase인 CalB의 기질로 이용된다. Fig 1과 같은 반응을 통해서 p-nitrophenol을 형성하여 노란빛을50mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)Buffer solution은 완충용액으로, 말 그대로 시료 등의 pH와 같은 조건을 일정하게 유지하기위해 사용된다. Tris-HCl buffer는 Tris buffer에 HCl과의 적절한 비율을 혼합하여 적정 pH를유지하는 물질이다.(4) DDW미생물 실험과 같이 미세한 작용에도 결과에 큰 영향을 끼치는 경우, 일반적인 물에 이온과같은 실험에 영향을 줄 수 있는 부산물 등이 제거된 물이다.(5) 250 laboratory bottle(6) Aluminium foilp-NPB의 경우 빛에 의한 광분해가 일어나므로, 보관 시 알루미늄 호일을 이용하여 빛을차단한다.(7) Shaking incubator(8) Micropipette 5, 1, 10(9) UV spectrophotometer시간에 따른 효소의 활성을 측정하기 위해서, 10분마다 흡광도를 측정하고 측정된 흡광도를통해서 Lambert-Beer 식을 이용하여 농도를 얻어낸다. 이번 실험의 경우 CalB에 의해 Fig 1과같은 가수분해 반응이 일어날 수록 p-nitrophenol의 농도가 증가하여 흡광도의 값이 증가할 것이다.Lambert-beer 법칙은 ① Lambert 법칙과 ② Beer 법칙 두 가지 법칙의 상관관계를 이용해서,흡광도는 용액의 길이와, 용액의 농도와 비례한다는 법칙이다. Fig 3과 Table 1과 같이 나타낼수 있다.흡광도흡광계수시료(큐벳)길이시료의 농도Fig 3. Lambert-beer law Table 1. Lambert-beer law① Lambert 법칙용액의 흡수에 관한 법칙이다. 일정한 두께의 용액의 경우 입사광의 광도()와 투과광의광도()는 일정하다는 법칙으로, 흡광도는 용액의 길이에 비례한다는 법칙이다.② Beer 법칙흡광도는 시료의 농도와 상관관계를 나타낸다는 법칙으로 흡광도는 용액의 농도와 비례한다는법칙이다.(10) Cuvette2) 실험방법(1) 호일을 감싼 bottle12개를 준비하여 각 botle에 54.45mle에 넣어 55ml의 0.5mM p-NPB 용액을 만든다.(3) Bottle에 500배 희석한 효소(CalB)를 20 넣어준다.(4) 반응 전 1ml를 sampling하여 반응의 초기값(0min)을 UV spectrophotometer를 이용하여405nm 파장대의 흡광도를 측정한다.(5) Bottle를 shaking incubator에서 40로 반응시킨다.(6) 10분 간격으로 4번 흡광도를 측정하여, 측정한 data를 바탕으로 Abs/min의 그래프를 그린다.Fig 4. Experiment(7) 아래의 식을 이용하여, 효소의 Specific activity (U/mg)를 계산한다.3. Results & Discussion1) ResultFig 5. Result (Absorbance in 405nm)Table 2. Absorbance, Concentration (in 405nm)시간 (min)010203040흡광도0.0700.1290.1880.3130.435농도 (mM)0.00380.00700.01020.01690.0235Fig 6. Abs-Time(min) diagram 140분 기준 효소활성도인 효소 단위 부피(ml)당 Unit(U)은 다음과 같이 계산된다.-Unit--Enzyme Activity-효소의 활성도를 구하기 위해서는, 효소의 부피를 나눠주어야 한다. 이때, 효수의 부피는 순수한효소의 부피를 나눠주어야 하지만, 이번 사용한 CalB의 경우 Solution 상태로 실제 사용한 효소의부피를 알기 어려우므로 효소의 활성도를 구할 수 없다. 희석되지 않은 효소의 양은 순수 효소의 부피로 가정하여 계산하면 다음 식 와 같이 효소활성도가 계산된다.(단, 500은 효소를 500배 희석시켜준 값이므로, 곱해줘야 한다.)2) Discussion지방분해 효소인 lipase의 일종인 CalB의 효소활성도를 측정하는 실험이다. Fig 1과 같이 p-nitrophenyl butyrate를 CalB를 효소로 하여 가수분해반응을 진행시켜, 노란빛을 띄는 p-nitroph성되고,Fig 4와 같이 노란색이 점점 짙어진다(=흡광도의 값이 커진다). UV spectrophotometer를 통하여 흡광도를 측정하고, 흡수 파장은 노란색의 보색관계인 보라색-남색계열 파장(405nm)을 이용한다.Fig 7. Color Spectrum실험은 10분 간격으로 측정한 흡광도를 Lambert-beer law를 이용하여, p-nitrophenol의 생성량을 구한다. 실험 용액이 들어있는 Bottle은 shaking incubator에서 40로 반응시킨다. 여기서 40는 효소의 활성이 최대가 되는 지점으로 볼 수 있다. 일반적으로 온도가 증가할수록 반응속도는 증가하게 되지만, 생체 촉매인 효소는 단백질로 구성되어 있어서 높은 온도에서는 단백질의 변성이 일어나 효소의 활성이 떨어지게 된다. 효소의 최대 활성 온도는 효소의 변성이 일어나는 온도보다 약간 낮은 온도지점에서 갖는다. CalB의 경우는 40 보다 높은 온도에서 효소의 변성이 일어나므로, 활성이 거의 최대가 되는 지점인 40에서 실험을 진행한다.Fig 8. Enzyme ActivityFig 9. Relative Hydrolytic Activity(Fig 8은 온도에 따른 효소의 활성을 예시로 나타낸 그래프이고,Fig 9는 각기 다른 종류의 CalB의 온도에 따른 수화반응의 활성도를 나타낸 그래프이다.)시간에 따른 흡광도의 그래프는 Fig 6과 같이 거의 선형적으로 증가한다고 볼 수 있고, 의값이 0.9665로 다소 신뢰할 수 있는 데이터로 볼 수 있다. 아래 Fig 10을 확인하면, 0min~20min, 20min~40min의 지점을 연결하면 거의 선형적으로 연결되며, 0min~20min 구간보다,20min~40min 구간이 더 큰 기울기 값을 갖는 것을 확인 할 수 있다. 이를 통해서는 반응의 속도가 실험한 구간에서는 증가한 것으로 확인 할 수 있다.Fig 10. Abs-Time(min) diagram 2실험에서 일어날 수 있는 실험적 오차는 다음과 같이 생각해 볼 수 있다.첫 번째는, S도단위로 일어나, 농도 자체로는 부피의 변화에 영향을 받지 않을 수 있으나, 열용량과 같은 온도변화에 영향을 줄 수 있는 변수들은 extensive property로 부피변화에 따른 영향을 받으므로,부피변화에 따른 반응의 변화는 작지만 어느정도 있을 것으로 판단된다.두 번째는, 반응시간이다. 실험은 10분이라는 일정간격동안의 반응의 정도를 확인하는 실험이다.시간 측정은 스탑워치를 통해서 측정하고, 10분이 되면 shaking incubator에서 용액을 꺼내 흡광도를 측정하는 실험이므로 Abs-Time 그래프는 약간의 오차가 존재할 것이다.세 번째는, 에스터화 반응(Esterification)이다. 실험에서는 pNPB의 가수분해반응이 favorable한 반응이므로, 역반응인 에스터화 반응을 억제시켜야 한다. CalB를 효소로 사용하면 가수분해 반응으로의 반응을 선택적으로 촉진시킬 수 있으나, 에스터화 반응이 0% 진행되는 것은 아니고,반응이 일어나는 Bottle이 모두 동일한 condition이 아니므로 에스터화 반응의 정도는 각각 다를 것이다.4. Conclusion이번 실험은 효소의 활성(Enzyme Activity)을 측정하는 실험이다. 실험은 pNPB 용액 제조 후 효소 투입, 10분 간격으로 흡광도 측정, 흡광도를 통해서 효소의 활성 계산 순으로 진행한다. 시간에 따른 흡광도의 그래프는 Fig 6과 같은 개형을 그리며 이 0.9665로 어느정도 선형에 가까운 것을 확인 할 수 있었고, 시간에 따라 생성되는 p-nitrophenol은 식 과 같이 0.02513U로 계산되었고, 순수한 효소를 이용하였다고 가정하였을 때의 효소 활성도는 식 와 같이 로 계산되었다.실험의 오차로는 1) Sampling 과정을 통한 용액의 부피 변화, 2) 반응시간, 3) Esterification의오차가 있을 것으로 보았고, 이 외의 오차들은 앞서 언급한 3가지 오차들에 비해 거의 영향을 끼치지 않았을 것으로 판단했다.5. Reference- Gray D. Christian 실험노트

공학/기술| 2020.02.07| 8페이지| 1,000원| 조회(217)

enzyme, 화학공학, 생물화학공학, Enzyme activity assa

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[생물화학공학실험]Liquid culture & Expression 평가A+최고예요

실험제목:Liquid culture & Expression조 :학 번 :이 름 :결과레포트1. Abstract특정 단백질을 발현시키기 위해 이전 실험과 같은 Restriction, Ligation과 같은 유전자 조작 과정이 선행적으로 수행된다. 단백질 발현의 확인은 여러 방법들에 의해서 수행될 수 있으며,이러한 과정들은 다소 복잡한 과정이다. 이러한 방법을 개선하기 위해서, 유전자 조작과정에서형광단백질을 암호화 하는 eGFP DNA를 삽입하여 단백질 발현을 가시적으로 확인할 수 있다.실험의 과정은 다음 세 가지로 나눠진다. LB배지 제조, 균 배양(대조군 포함) 후 600nm에서 O.D 측정 (0.6~0.8), IPTG 투입 후 UV transilluminator에서 확인과정이다.실험결과는 Fig 5와 같으며, 녹색형광을 나타낸 것으로 보아, 유전자 조작을 진행한 균이 잘 배양되었음을 확인할 수 있다.2. Experiment1) 기구 및 시약(1) Isopropyl (1000X)Lac operon을 이용하여 단백질 발현을 위해 사용되는 inducer이다. Fig 1과 같이 Lactose와유사한 구조를 가져 억제자와 결합이 가능하다. Lac operon의 경우 Lactose를 분해하는Lactose 분해 단백질인, 가 생성하여 Lactose를 분해한다. 이 경우 IPTG를inducer로 넣어주면 에 의해 분해되지 않고 지속적인 전사를 유도할 수 있다.Fig 1. (a) IPTG, (b) Lactose(2) Ampicillin (1000X)(3) Shaking incubator(4) LB 배지 (Yeast extract, NaCl, Tryptone)LB배지는 박테리아 배양에 이용되는 배지이다. 성분은 Yeast extract, NaCl, Tryptone으로 구성되며, 각각 1:2:1의 비율로 투입한다. Yeast extract는 박테리아가 생장하는데 필요한 영양소가들어 있는 효모 추출물이며, NaCl은 삼투현상에 의해 세포가 터지는 것을 방지하기 위해 투입,Tryp.Table 1. Composition of LBLB배지 조성100ml 기준Tryptone1gYeast Extract0.5gNaCl1g(5) Flask(6) UV spectrophotometer(7) Cuvette(8) UV transilluminator2) 실험방법(1) Table 1과 같은 조성으로 50 LB배지를 2개를 만든다.(2) 만들어진 LB배지를 autoclave로 멸균한다.(autoclave는 고온, 고압에서 멸균하는 장치로, 내부 압력과 온도가 충분히 떨어진 후 뚜껑을열고, 부피가 큰 용기를 사용, 내부의 물을 증류수로 사용하여 진행해야 한다.)(3) 멸균된 LB배지를 꺼내 clean-bench에서 60이하로 식힌 후, ampicillin (1000X)을 각각 50씩넣는다.(4) 미리 배양 된 세포(eGFP DNA 포함) 5을 플라스크 하나에 넣은 후, shaking incubator에서37로 배양한다.Fig 2. Experiment 1(5) 대조군으로 미리 배양 된 세포(eGFP DNA 미포함) ) 5을 나머지 플라스크 넣은 후, shakingincubator에서 37로 배양한다.(6) 배양한 배지 1을 sampling하여 600nm파장대의 흡광도를 측정한다.(흡광도 측정을 통하여 cell growth를 측정하는 경우, 배지가 빛을 흡수하는 것을 최소화해야 정확하게 측정이 가능하다. 일반적으로 600nm에서 배지가 빛을 흡수하지 않고 세포만 빛을 산란하여 cell growth를 다소 정확하게 측정가능하다.Cell growth curve는 세포의 생장을 나타내는 곡선이다. 축은 시간, 축은 세포 수로 log scale로 나타내고, Fig 5 (a)와 같이 크게 4가지로 나눌 수 있다.균이 배지와 같은 환경에 적응하는 시기는 유도기(Lag phase)는 성장에 필요한 성분(ATP, 리보솜 등)들이 충분하지 않는 시기이므로 세포 성장이 거의 미비한 속도로 일어난다.두 번째 단계는 대수성장기(Log phase)로 매우 빠른 속도로 증가하는 단계이고,게 두배로 증가한다.세포 정체기(Stationary phase)는 세포의 분열속도와 사멸속도가 균형을 이루어, 세포의 수가 정체되는 시기를 말한다. 이러한 결과를 보이는 이유 중 하나는 영양공급의 부족이다.사멸기(Death phase)는 세포의 분열속도보다 사멸속도가 더 빨라지게 되고, 그 결과 세포의 수가점차 감소하게 되는 시기를 말한다. 이러한 결과는 영양분의 부족과 독성 노폐물의 축적 등의 이유로 발생한다.Cell growth curve를 6단계로 좀 더 세부적으로 나누면 Fig 5 (b)와 같이 나타나며, 4단계에서 log phase와 growth phase 사이에 Acceleration phase, growth phase와 stationary phase 사이에 decline phase 지점이 추가된다.)Fig 5. Cell growth curve; (a) 4 steps, (b) 6 stepsFig 4. Experiment 2(7) O.D값이 0.6~0.8사이가 되면, 각각의 플라스크에 IPTG (1000X)를 50 넣어준다.(O.D 값이 0.4을 나타내는 지점은 cell growth curve에서 log phase의 시작 지점으로 볼 수 있고, 0.6일 때가 log pahse의 중간지점으로 볼 수 있다. IPTG를 O.D값 0.6~0.8지점에 넣어주는 이유는균의 성장속도가 매우 빠른 지점으로 단백질 합성도 활발히 일어나는 지점이므로 다소 높은 수율을 얻을 수 있기 때문이다. 또한 Lag phase와 Death phase에 주입시 단백질 합성이 잘 일어나는 지점이 아니므로 O.D값이 0.6~0.8지점에 IPTG를 넣어주어야 한다.)(8) 두 개의 플라스크를 25의 shaking incubator에서 induction한다.(9) UV transilluminator를 통해 각각의 액체배지를 비교한다.3. Results & Discussion1) Result실험결과인 Fig 5는 enhanced green fluorescent protein인 eGFP의 발현 control은 대조군으로 eGFP DNA가 미포함 되었기 때문에 5조 실험결과와 달리녹색 형광을 나타내지 않음을 확인할 수 있으며, eGFP DNA를 포함하는 균의 성장이 잘 일어났음을 확인할 수 있다.Fig 5. Result2) Discussion유전자 조작을 진행한 박테리아를 액체배지에 배양한 후 eGFP 단백질 발현을 가시적으로확인하는 실험이다. 단백질 발현에 관한 실험을 진행할 때, 원하고자 하는 특정 단백질의 발현을확인하기는 쉽지 않기 때문에 eGFP DNA를 같이 삽입하여, 단백질 발현의 확인을 녹색 형광의발현을 통하여 가시적으로 확인할 수 있다.단백질 발현은 박테리아에 transformation 과정을 통하여 삽입한 plasmid에 존재하는 operon의 전사과정을 선행한다. Operon은 박테리아와 같은 원핵생물에 존재하는 DNA군으로 조절유전자, 작동유전자, 프로모터, 구조유전자들을 포함되어 있다. 조절유전자에서 형성되는 repressor가 작동유전자에 결합하여 전사효소가 프로모터에 결합하는 것을 저해하고, 전사가 억제된다. Operon의 작동 방식에 따라 크게 두 가지 방식이 존재한다.이번 실험에 진행한 Lac operon은 Fig 6 (a)와 같은 구조를 가지며, 일반적으로 젖당이 아닌 포도당을 주로 에너지원으로 사용하고 젖당이 있을 경우에만 젖당을 에너지원으로 사용하기 때문에 젖당이 없는 경우는 repressor가 작동유전자에 결합한 상태로 있기 때문에, 젖당분해효소인 가 발현되지 않고, 젖당이 있는 경우 repressor에 젖당이 결합하여작동유전자에 결합하지 못해 젖당분해효소가 발현된다.Trp operon은 Lac operon과는 다른 방식으로 전사가 진행된다. Trp operon은 Fig 6 (b)와 같은 구조를 가지며, tryptophan 합성에 관여하는 효소를 암호화하고 있다. Lac operon은 젖당이 repressor와 결합한 경우 작동유전자에 결합이 안되지만, trp operon의 경우 tryptophan이 없는 상황에서 결합하지 못해서 tryptophan 관여 효소가 전사되고, tryptophan이 있는 경우 repressor와 결합하여 작동유전자에 전사가 진행되지 않는다. 즉, trp operon은 lac operon과는 다르게 tryptophan이 없는 경우에만 전사가 진행되고, lac operon은 lactose가 있는 경우만 전사가 진행된다. Trp operon은 tryptophan이 필수적으로 필요하여, tryptophan이 지속적으로 존재할 수 있도록 진행되는 system이고, lac operon은 lactose가 존재할 경우에만 젖당분해효소가 발현될 수 있게 되어 있는 system이다. 또한 앞서 언급하였듯이, operon은 원핵생물에서 일어나는 과정으로 전사와 리보솜에 의한 번역 과정은 진핵생물과는 다르게 동시에 진행된다.Fig 6. (a) Lac operon, (b) Trp operon4. Conclusion이번 실험은 Transformation된 박테리아를 액체배지에서 배양한 후, UV transilluminator에서 형광 단백질의 발현을 통하여 배양된 결과를 확인하는 실험이다. 실험은 간단하게 LB배지 제조,균 배양(대조군 포함) 후 600nm에서 O.D 측정 (0.6~0.8), IPTG 투입 후 UV transilluminator에서 확인과정 순으로 진행된다. Fig 5에서의 5조(실험군)을 Control(대조군)과는 달리 녹색 형광을 나타내었고, 이러한 결과는 녹색 형광 단백질을 암호화하는 eGFP DNA가 있는 plasmid를 포함하고 있는 균이 잘 배양되었음을 확인할 수 있다.5. Reference- 세화편집부. “화학대사전1”. 세화(2001). P421- 이행석 외 2인. “알기 쉬운 분자생물학”. 기전연구사(2006). P78-93- Reece 외 3인. “생명과학 개념과 현상의 이해 7th”.PEARSON(2011). P190-191- Gray D. Christian 외 2인. “ANALYTICAL CHEMISTRY 7th”. WILEY(험노트

공학/기술| 2020.02.07| 6페이지| 1,000원| 조회(145)

화학공학, 생물화학공학, Expression, Liquid Culture

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[생물화학공학실험]Transformation 평가A+최고예요

실험제목:Transformation조 :학 번 :이 름 :결과레포트1. Abstract박테리아에 원하고자 하는 단백질에 해당하는 DNA를 플라스미드를 이용하여 유전자를 전달하는 과정을 말한다. 유전자 전달과정은 방식에 따라서, Conjugation(접합), Trasformation(형질전환), Transduction(형질도입)으로 나눌 수 있다.Conjugation은 박테리아간에 유전자 전달이다. 유전자를 전달하는 박테리아는 Donor,받는 박테리아는 Recipient이고, 보통 F plasmid와 같은 DNA가 전달된다. F plasmid에는플라스미드를 전달하기 위한 성섬모를 암호화 하는 유전자 뿐 아니라 접합과정에 필요한 유전자들이 존재한다. Conjugation이 일어나기 이전 Donor 세포는 F plasmid를 가지고 있고,Recipient 세포는 F plasmid를 가지고 있지 않으므로 F+,F- 세포라고 하고, Conjugation이 일어난 후F-세포는 F+세포가 된다. Hfr(High frequency recombination) 박테리아의 경우 F plasmid를 전달할 때 온전히 전달하지 못하므로 F가 없는 F-상태이다.Transformation은 이번 실험에서 진행하는 유전자 전달과정이다. 박테리아가 DNA를 우연하게혹은 임의로 충격을 가하여 유전자를 전달한다. 실험을 통하여 재조합된 plasmid를 전달하는 경우 일반적으로 Transformation을 통하여 유전자를 전달한다.Transduction은 박테리오파지와 같은 박테리아를 숙주로 하는 바이러스에 의하여 일어나는 유전자 전달현상이다. Fig 1 (c) 와 같이, 바이러스가 갖는 숙주 DNA를 박테리아에 주입하고. 박테리아 내에 숙주 DNA의 translation과정을 거쳐 박테리아를 생산한다.Fig 1. (a) Conjugation, (b) Transformation, (c) TransductionTransformation이 진행된 박테리아의 배양결과는 Fig 2와 같이 나타났으며, 도말이 진행될 때 Fig 3과 같이 도말봉에 의해서 고체배지가 찢어져 박테리아 배양에 다소 큰 영향을 주었을 것이다.2. Experiment1) 기구 및 시약(1) BL21 (E.coli competent cell)(2) Recombinant DNA(3) LB배지 (Yeast extract, NaCl, Tryptone)LB배지는 박테리아 배양에 이용되는 배지이다. 성분은 Yeast extract, NaCl, Tryptone으로 구성되며, 각각 1:2:1의 비율로 투입한다. Yeast extract는 박테리아가 생장하는데 필요한 영양소가들어 있는 효모 추출물이며, NaCl은 삼투현상에 의해 세포가 터지는 것을 방지하기 위해 투입,Tryptone은 질소 공급물로 투입한다.(4) Agarose고체배지를 만들기 위해서 투입한다.(5) 1.5ml microtube(6) Incubator(7) IceIce는 박테리아 배양시, 배지내에서의 세포 안정화를 위해 투입한다.(8) Pipette 10, 100(9) Ampicillin (1000X)Ampicillin은 항생물질로, 이번실험에서는 원하는 DNA를 갖는 박테리아를 선별하기 위해 투입한다. 형질전환된 박테리아는 플라스미드에 Ampicillin resistance gene이 존재하여서 Ampicillin형질전환되지 않은 DNA는 모두 죽게 된다. 또한, Ampicillin은 온도에 민감한 항생제 이므로60℃가 넘는 온도에서는 활성이 매우 떨어져서 제 역할을 할 수가 없으며, 얼리고 녹이는과정을 반복하는 경우에도 이러한 결과가 나타난다. 따라서, Autoclave를 통하여 멸균을시킨 후, Ampicillin을 투여하는 경우 충분히 온도가 떨어진 이후 진행해야한다.Table 1. pET-22b (+)2) 실험방법(1) Table 2와 같은 조성으로 LB고체배지를 만든 후, Autoclave로 멸균한다.Table 2. Composition (1)LB 고체배지 조성100ml 기준Tryptone1gYeast Extract0.5gNaCl1gAgarose1.5g(2) 60이하가 되었을 때, Ampicillin (1000X)을 넣고 petridish에 20ml씩 넣고 식힌다. (총 2개)(3) 재조합 된 DNA를 Table 2와 같은 비율로 1.5ml microtube에 넣는다. (in clean bench)Table 3. Composition (2)조성부피(volume)Recombinant DNA4BL21 competent cell40Total44(4) Pipetting으로 섞은 후, 10분동안 Ice에서 반응 시킨다.(5) 반응시킨 용액을 고체배지에 옮겨 spreader로 고르게 도말하고, 마찬가지로 대조군에해당하는 고체배지에 DNA를 넣지 않는 BL21을 도말한다.(6) 도말이 끝난 배지는 parafilm으로 petridish를 감싸 incubator에서 배양한다. (37, 14-18시간)(7) 각각의 고체배지를 비교한다.3. Results & Discussion1) ResultFig 2. Experiment 12) Discussion이번 실험은 고체배지에 도말을 한 후, 이전실험에서 제조한 plasmid DNA를 Transformation 시킨 박테리아를 배양하는 실험이다. Fig 2의 왼쪽에서부터 차례로 대조군, 실험군 결과이다.이번 실험은 speading도말법을 통해서 도말을 진행했다. 도말봉을 이용하여 도말을 진행하는 과정에서 Fig 3과 같이 고체배지가 찢어져 박테리아 배양에 다소 큰 영향을 주었을 것으로 생각해 볼 수 있다.Fig 3. Experiment 24. Conclusion이번 실험은 Transformation된 박테리아를 고체배지에서 배양하는 실험이다. 실험은 간단하게 LB배지 제조, 도말, 배양 후 결과 확인 순으로 진행된다. Fig 2의 도말된 결과에서 대조군과 비교하였을 때, 박테리아가 어느정도 배양되었음을 확인할 수 있다. 하지만, 도말봉을 통해 도말하는 과정에서 Fig 3과 같이 고체배지가 찢어져서 배양된 결과에 다소 큰 영향을 끼쳤을 것이다.5. Reference- 남상욱 외 3인. “유전공학의 이해 3th”. 라이프사이언스(2016). P94-110- Reece 외 3인. “생명과학 개념과 현상의 이해 7th”.PEARSON(2011). P190-191- 실험노트

공학/기술| 2020.02.07| 5페이지| 1,000원| 조회(305)

화학공학, Transformation, 생물화학공학

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[생물화학공학실험]Restriction of DNA 평가A+최고예요

실험제목:Restriction of DNA조 :학 번 :이 름 :결과레포트1. Abstract특정 단백질을 대량 생산하기 위해 원하고자 하는 DNA를 plasmid DNA에 삽입하는데, 삽입 전에 이루어지는 실험이 Restriction 실험이다. Restirction은 특정 제한효소를 이용하여 제한효소가 특정 염기서열을 인식하여 DNA를 자르는 과정으로, 이번 실험에서는 ‘Nde I, EcoR I, Xho I’ 세 가지 제한효소가 이용되었다.실험은 DDW, DNA, 10X H buffer, enzyme을 용액으로 만든 후, 1시간 동안 반응을 시키고 전기영동을 이용하여 실험결과를 확인하는 과정을 거치며, 실험 결과는 Fig 4에 나타내었다.실험 결과는 세 밴드 이외 밴드를 형성하였고, 희미한 잔상이 나타났고, 이러한 실험 결과는‘(1) Star activity, (2) 제한효소의 오작동, (3) 실험에서 발생한 불순물’ 등의 오차로 인해 발생 하였다고 보았다.2. Experiment1) 기구 및 시약(1) Plasmid(2) 10X H buffer(3) Restriction Enzyme (Nde I, EcoR I, Xho I,)이번 실험에 사용한 제한효소인 Nde I, EcoR I, Xho I는 인식부위 내 또는 그 근방의 특정부위를절단하는 특징을 갖는 Type 2 제한효소으로 sticky end를 형성한다. 각 효소별로 자르는 DNA염기서열은 다음 Fig 1과 같다. Sticky end와 blunt end는 Fig 2와 같은 형태를 갖고, Sticky end의 경우 염기 간 상보적 결합으로 blunt end보다 결합이 용이하다. INCLUDEPICTURE "https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/product9/105/nde-i.eps/_jcr_content/renditions/nde-i-large.jpg" * MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "https://www.sigma EnzymeFig 2. Stick end & Blunt end(4) PCR tube(5) Incubator(6) Electrophoresis apparatus, agarose(7) DNA ladder, DNA loading star(6x)전기 영동의 진행 상태를 시각적으로 표현하기 위하여 염색을 진행하며, DNA loading star를이용하여 염색을 진행한다.(8) 1X TAE buffer(9) UV transilluminator(10) Micropipette 10(11) DDW2) 실험방법(1) Table 1과 같은 조성으로 반응 용액을 만든 후 10 pipette과 섞어준다.Table 1. Composition of SolutionDDW8DNA710X H buffer2Enzyme (Nde I, Xho I, EcoR I)각 1Total20Fig 3. Experiment 1(2) 37에서 1시간동안 반응한다.(3) 전기영동기기에 Agarose gel을 넣고 TAE buffer (1X)를 gel이 잠길 때까지 채운다.(4) Agarose gel의 첫 번째 홈에 DNA ladder 10를 loading한다.(5) Loading star (6X) 2와 10를 섞은 뒤 두 번째 홈에 loading한다.(6) 대조군으로 Loading star (6X) 2와 반응하지 않은 DNA 10를 섞은 뒤 세 번째 홈에 loading한다.(7) 100V의 전압에서 1시간동안 전기영동을 한다.(8) Agarose gel을 꺼내 UV transilluminator 위에 놓고 자외선을 쬐어 restriction한 DNA와Restreiction하지 않은 DNA를 비교한다.3. Results & Discussion1) ResultFig 4. Result2) Discussion실험을 통해서 얻은 결과는 Fig 4 (1)과 같다. 실험에서 이용된 제한효소는 3가지로 Nde I,EcoR I, Xho I 세 가지를 이용하였으며, 정확한 실험을 진행한 경우 제한효소에 의해 잘린 DNA는 ‘Nde에 eGFP 단백질 발현 유전자와, Another gene이 추가된 염기 서열이다.)Fig 5. pET-22b(+) vectorFig 6. Base sequence (1)Nde I, EcoR I, Xho I에 의해 잘린 염기 서열은 Fig 1의 형태이고, ‘Nde I~EcoR I’,‘EcoR I~ Xho I’ 염기서열은 protocol을 이용하여 다음 Fig 7, 8과 같이 얻어낼 수 있다.Fig 7. Nde I~EcoR IFig 8. EcoR I~ Xho IFig 7, 8에서 형광으로 표시되어있는 염기서열이 ‘Nde I~EcoR I’, ‘EcoR I~ Xho I’ 염기서열이며,염기를 세면 각각 758bp, 1767bp 의 사이즈를 가짐을 알 수 있다. ‘Xho I~Nde I’ 사이즈의 경우7993bp에서 ‘Nde I~EcoR I’, ‘EcoR I~ Xho I’의 사이즈인 758bp, 1767bp를 빼서 얻을 수 있으며,5468bp의 사이즈임을 알 수 있다.이전 실험인 PCR의 경우 T7 primer와 T7 terminator primer(Reverse primer)사이를 증폭하는기술로, 증폭된 염기의 경우 protocol을 이용하여 정확한 사이즈를 구할 수 있다. Fig 9와 같이T7 transcription start와 T7 terminator가 존재한다. Promoter의 경우 전사, 복제 시, 합성효소가 붙는 위치인 경우도 존재하지만, 이번 실험의 경우 Fig 10과 같이 promoter에 primer가 결합하여 PCR이 진행된다. T7 promoter가 361-377, T7 terminator가 26-72이고, T7 terminator primer가Fig 10과 같이 결합하므로, 377~68까지 PCR을 통하여 합성되었을 것이다. 또한, 3가지 제한효소를 이용하여 DNA를 제거하고 원하고자하는 유전자를 삽입 하였으므로, Fig 11에서와 같이 129bp 만큼을 제거하고 Fig 6과 같이 eGFP 단백질 발현 유전자(+0.8kbp)와, Another g1)의 형태를 갖는다. DNA ladder인 Fig 4 (2)와 비교하였을 때, 약 0.8kbp, 2kbp, 6kbp의 세 밴드 이외에도 추가적으로 약 7kbp, 10kbp의 밴드도 얻었으며, 전체적으로 희미하게 잔상이 남아있다. 0.8kbp, 2kbp, 6kbp 밴드의 경우 Table 2를 통하여 보았을 때, 각각 ‘Nde I~EcoR’, ‘EcoR I~ Xho I’, ‘Xho I~Nde I’로 판단 가능하며, 전기영동시 Agarose gel에서 물리적으로 이동하는 것이므로 이동의 방해를 받아이론적으로 나올 수 있는 사이즈보다 더 큰 사이즈로 발현되었을 것이다. 추가적으로 전기영동을진행하는 경우 Agarose gel의 그물망 구조를 지나가는 것이므로, Agarose gel 농도에 따라 결과가 영향을 받으며, 농도가 클수록 그물망 구조가 더 촘촘하여 이동에 제한을 받고, 반대로 농도가 낮은 경우는 이동에 덜 제한 받기 되므로 결과에 영향을 준다고 볼 수 있다. 이러한 특성으로 Agarose gel의 농도는 분리하고자 하는 DNA의 사이즈에 따라 다르게 이용하며, 큰 사이즈의 DNA를 분리하는 경우 Agarose gel의 농도를 낮게 이용하며, 작은 사이즈의 DNA를 분리하는 경우 Agarose gel의 농도를 높게 이용한다. Agarose gel 농도와 DNA size의 관계는 다음 Table 3에 나타내었다.전기영동 결과의 희미한 잔상과 추가로 생긴 밴드의 경우 다음 몇 가지 실험적 오차로 생겼다.Table 3. Concentration of Agarose gel (vs DNA size)Percent Agarose Gel (w/v) [%]DNA Size Resolution [bp]0.51000 ~ 300000.7800 ~ 120001.0500 ~ 100001.2400 ~ 70001.5200 ~ 30002.050 ~ 2000첫 번째는, Star activity현상이다. Star activity현상은 제한 효소가 기존의 절단 부위 이외의 다른부위를 절단하는 현상 일어나면, 기존의 염기서열보다 작은 사이즈의 DNA를 얻게되며, 이는Fig 4 (1)의 희미한 라인을 통해서 나타났다고 볼 수 있다.두 번째는, 제한효소의 오작동이다. 효소의 경우 효소와 작용점이 올바르게 맞는 경우만 작동한다. 즉, 효소의 경우 100% 작동하는 것이 아니라고 볼 수 있다. 이번 실험에서 제한효소로3가지 종류의 제한효소가 사용되었다. 이 경우 한 가지 효소만 작용한 경우, 약 8kbp 사이즈의DNA 사이즈를 얻게 될 것이고, 두 가지 효소가 작용한 경우는 정상 작동한 효소 사이의 DNA (실험이 올바르게 진행되었을 때 얻을 수 있는 DNA)와 기존 얻을 수 있는 DNA보다 긴 사이즈의DNA를 얻게 될 것이다. 이러한 경우로 실험에서 전기영동 이미지에서 multiple band를 형성한 것으로 생각 할 수 있다. 또한 제한 효소가 하나도 작동 안한 경우에는 원형 DNA(Nick form)를 가지고 있는 경우, linear DNA 보다 더 큰 저항이 있어 기존 사이즈보다 더 큰 사이즈로 측정되므로 Fig 4 (1)에서 10kbp의 band가 형성되었을 것으로 볼 수 있다.세 번째는, 실험에 발생한 불순물이다. 실험은 적은 양의 DNA를 이용하는 실험이므로 적은 불순물이라도 실험에 크게 영향을 미친다. DNA에 불순물이 붙은 경우, Agarose gel에서 큰 저항을 받게 되므로 기존의 DNA 사이즈보다 더 큰 사이즈로 측정될 것이다.4. ConclusionRestriction of DNA 실험은 간단히 Restriction 용액 제조, 반응, 전기영동 세 가지로 나눠진다.Restriction 용액의 경우 Table 1의 성분과 같이 만들어지고, DDW, DNA, 10X H buffer, enzyme(Nde I, EcoR I, Xho I) 순으로 넣어준다. 반응은 제조된 용액을 37에서 1시간동안 시켜주며,반응한 용액을 전기영동 돌리고 결과를 확인한다.Restriction된 DNA의 결과는 Fig 4와 같이 나왔으며, 0.8kbp, 2kbp, 6트

공학/기술| 2020.02.07| 10페이지| 1,500원| 조회(206)

제한효소, 화학공학, 생물화학공학, Restriction of DNA

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[생물화학공학실험]PCR

실험제목:PCR조 :학 번 :이 름 :결과레포트1. Abstract오늘날 특정 단백질의 합성, 범죄 현장에서의 적은 양의 DNA양을 증폭시켜 감식을 진행하는 등 PCR은 생명공학 분야 외에서도 널리 이용되는 기술이다. PCR은 복제하고자 하는 특정 유전자를 PCR machine의 Denaturation, Annealing, Polymerization의 Cycle을 통하여 DNA를 증폭시키는 기술이다. DNA의 증폭은 DNA의 복제를 통해서 일어나며, DNA 복제 장소에 따라서 In vivo와 In vitro로 나뉜다.In vivo는 동물실험과 같은 살아 있는 생물에 실험을 하는 경우이며, In vitro는 시험관과 같은 통제된 외부환경에서 실험을 하는 경우를 말한다. DNA 복제에서 In vivo는 생물체 내에서 DNA의 2중가닥의 분리와 합성 모두 효소에 의해 일어나므로 다소 낮은 온도에서 진행을 하며, 또한 인체에서 일어나는 DNA 복제의 경우는 DNA보다 다소 불안정한 RNA primer를 이용하기 때문에 DNA가 원형 가닥보다 짧아지는 telomere가 형성되는 현상이 발생한다. 하지만, In vitro는 PCR로 인위적인 온도의 조작으로 DNA 복제를 진행하는 과정으로, 물리적으로 2중가닥을 분리하기 때문에 다소 높은 온도에서 복제가 진행되므로 열에 강한 DNA polymerase를 이용하여 진행하고, 복제하고자 하는 primer를 DNA를 직접 이용하여 합성하기 때문에 telomere를 보이지 않는다 또한 In vivo와는 다르게 DNA의 2중가닥을 모두 분리하여 진행하므로, 지연가닥과 선도가닥의 구분도 없다는 특징이 있다.실험의 과정은 크게 PCR mixture제조, PCR, 전기영동 세 가지 과정에 의해서 진행되었고, Fig 4 의 전기영동 결과를 통하여 PCR을 통하여 복제한 DNA의 사이즈는 2.5kb로 확인되었고, 실험의오차로는 (1) PCR mixture 제조에서의 pipetting 부정확성, (2) Template DNA의 농도로 보았다.2. Experiment1) 기구 및 시약(1) PCR MachinePCR Machine은 DNA를 증폭시키는 기술인 PCR을 진행하기 위해, 온도 사이클을 조절하는기기이다.(2) Micropipette 2, 10, 100(3) PCR tube(4) Plasmid DNAPCR을 이용하여 복제하고자 하는 DNA를 보유하고 있는 plasmid DNA이다. 실험에서 사용한plasmid DNA는, pET-22b(+) vector이며, Fig 1의 염기서열을 갖는다.Fig 1. pET-22b(+) vector(5) Nuclease free waterNuclease free water는 Nuclease가 없는 water를 의미하며, 핵산의 분해를 방지한다.(6) Forward primer, Reverse primerPrimer는 특정 염기서열로 이루어져 있어 DNA전사의 시작을 나타내는 지점이다. Forward-primer는 T7 primer를 이용하였으며, Reverse primer는 T7 terminator primer를 이용하였다,(7) Pfu polymerasePfu polymerase는 PCR에 사용하는 DNA polymerase 중 하나이다. DNA polymerase는 종류에따라 크게 Pfu polymerase와 Taq polymerase로 나뉜다.Pfu polymerase는 Pyroccocus furious라는 100도 이상에서 생장하는 초고온성 생물에서 유래한다. Pfu polymerase의 경우 복제과정에서 교정기능을 갖고 있어 전사과정의 정확도가 높다는장점을 가지고 있으나, 열에 의해 형성되는 dUTP가 Pfu polymerase의 활성을 저해하여 Taqpolymerase보다는 상대적으로 수율이 낮다는 단점이 존재한다. 따라서, DNA 클로닝과 같은정확한 실험을 진행하는 경우에 적합한 polymerase이다.Taq polymerase는 내열성 박테리아인 Thermus aquaticus로부터 유래한다. Pfu polymerase보다정확도는 다소 낮지만, 보다 높은 수율을 갖는다는 특징이 있다. 이 외의 PCR polymerase는Fig 2 에서와 같이 다양한 제품이 존재한다.Fig 2. PCR polymerase(8) Electrophoresis apparatus(9) 1X TAE buffer(10) Electrophoresis agarose(11) 1kbp DNA ladder, 6X Loading star(12) UV transilluminator2) 실험방법(1) PCR mixture를 아래 Table 1과 같이 제조하며, 시약은 Pfu master mix, Nuclease free water,Forward primer, Reverse primer, DNA template 순으로 넣어준다.Table 1. PCR mixturePfu master mix25Nuclease free water12.5Forward primer (T7 primer)10Reverse primer (T7 terminator primer)0.5DNA template2Total 50Fig 3. PCR mixture(2) PCR machine의 온도를 설정하여 PCR을 진행한다. PCR의 온도설정은 다음 Fig 4와 같다.Fig 4. PCR machine setting(3) 전기영동 기기에 Agarose gel을 넣고 1X TAE buffer를 잠길 때까지 채운다.(4) 1kbp DNA ladder와 6X Loading star를 섞어 Agarose gel의 첫 번째 홈에 loading 한다.(5) PCR 샘플과 6X Loading star를 섞은 뒤, 두 번째 홈에 loading 한다.(6) 100V의 전압에서 1시간 동안 전기영동한다.(7) Agarose gel을 꺼내 UV transilluminator 위에 넣고 UV를 쬐어 PCR 결과를 확인한다.3. Results & Discussion1) ResultFig 5. Result전기영동 이미지는 Fig 5의 형태를 보인다. 왼쪽에서부터 DNA ladder, 조에서 진행한 DNA,마지막은 조교님께서 진행한 DNA이다.이번 PCR을 진행한 DNA의 사이즈는 2.5kb로 조에서 진행한 (b)의 경우 형성되지 않았지만,(c)는 PCR이 제대로 진행되었음을 확인할 수 있다.2) Discussion이번실험에서 PCR을 진행한 DNA는 2.5kb로, Fig 5에 (c)의 밴드를 형성해야한다. 하지만, 이번 실험을 통해서 진행한 (b)의 경우 2.5kb가 아닌 약 4kb 사이즈를 나타냄을 알 수 있다. 이러한 결과를 나타낸 이유는 다음과 같은 두 가지 이유를 생각해 볼 수 있다.첫 번째는, PCR mixture 제조에서의 pipetting 부정확성이다. PCR mixture는 Table 1의 성분과 양을 갖는다. Mixture의 성분은 적게는 0.5에서 많게는 25로 50를 제조한다. 따라서, pipetting이 미세하게 실수가 나면 mixture에서의 농도는 크게 바뀌게 되기때문에 PCR mixture 제조에서 오차가 나왔을 확률이 매우 높다. 특히, 기존 사이즈인 2.5kb보다 더 큰 사이즈인 약 4kb는, Miniprep에서의 전기영동 결과인 4kb와 비슷한 크기를 나타낸 것으로 보아 PCR에 개시지점을 나타내는 T7 primer가 올바르게 작용하지 않았거나, DNA 중합 효소인 Pfu polymerase의오류로 생각할 수 있다.두 번째는, Template DNA의 농도이다. Template DNA의 농도의 경우 너무 높거나 낮은 경우 PCR의 결과가 제대로 나오지 않을 수 있다. Miniprep 실험을 하고 바로 PCR을 진행한 것이 아닌7일 정도의 기간을 두고 PCR을 진행하였다. 이러한 결과 약간이나마 Template DNA의 순도와 농도에 대해 약간의 오차가 존재했을 가능성도 있다.하지만, PCR의 경우 pipetting이 중요한 실험이므로 ‘PCR mixture 제조에서의 pipetting 부정확성’인 첫 번째 오차가 주요한 원인일 것으로 판단된다.4. ConclusionPCR 실험은 간단히 PCR mixture제조, PCR, 전기영동 세 가지로 나눠진다. PCR mixture 제조는Table 1에서와 같이 Pfu master mix, Nuclease free water, Forward primer (T7 primer), Reverse primer (T7 terminator primer), DNA template 순으로 제조하며, PCR machine을 이용하여 PCR을Fig 4와 같이 돌린 후, 전기영동을 돌리고 결과를 확인한다.PCR의 결과는 Fig 5와 같이 나왔으며, (c)의 결과를 통해 약 2.5kb의 사이즈를 갖는 것을 확인하였다. 직접 실험한 결과인 (b)의 결과로 보았을 때, 2.5kb가 아닌 약 4kb 사이즈를 나타낸 것으로 보아, (1) PCR mixture 제조에서의 pipetting 부정확성, (2) Template DNA의 농도를 오차로 보았으며, 특히 이번 실험에서는 (1)의 오차가 크게 작용하였을 것으로 판단했다.5. Reference- 강희규 외 8인. “진단분자생물학”. 현문사(2006). P180-196- Reece 외 3인. “생명과학 개념과 현상의 이해 7th”. PEARSON(2011). P210-220- pET-22b(+) vector Protocol Book- 실험노트

공학/기술| 2020.02.07| 6페이지| 1,000원| 조회(281)

PCR, 화학공학, 생물화학공학

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