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전기영동을 통한 DNA 확인

ㅇ생명과학 실험보고서09 Nov 20181겔 전기영동을 통한 DNA 확인Ⅰ. 실험 일시2018. 11. 9. 금 8:10~11:00 AMⅡ. 실험 목적형질전환 시킨 대장균의 DNA와 PCR을 통해 증폭시킨 DNA를 전기영동을 통해 확인한다.Ⅲ. 이론적 배경1. DNADNA는 인산, 디옥시리보스, 염기로 구성되는 뉴클레오티드의 결합체이다. DNA는 두 가닥의 폴리뉴클레오티드 사슬에서 골격은 당과 인산으로 연결되어 있고, 두 사슬 사이의 염가와 염기는 약한 수소 결합으로 연결되어 있다.2. DNA 전기영동1) 과정한천으로 된 겔에 시료를 넣고 전류를 흘려보낸다. 수소 이온 농도가 중성일 때 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠므로 DNA는 양극 쪽으로 끌려가게 된다. 이때 DNA가 통과하는 겔은 다공성 물질이기 때문에 작은 DNA 절편이 더 빨리 끌려가게 된다. 따라서 적당한 시간 동안 전류를 흘려보내면 DNA 절편은 크기에 따라 분리된다.2) 전기영동에 영향을 주는 요인① DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.② Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.?③ DNA 형태에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음?linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.④ 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.?⑤ 전기장의 방향이 이동속도에 영향을 미친다.⑥ Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.?⑦ 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.Ⅳ. 시약 및 실험 기구시약용량비고증류수49mlTAE buffer1ml50xM6아가로오스0.39ggel loading buffer글리세린+브로모페놀블루DNA maker6mu l1kbEtBr카드추출된 플라스미드PCR돌린 DNA0,10,20,30,바퀴실험기구용량비고전기영동 트레이-7*10 cm고무캡-2개comb-1개알코올램프-원심분리기-1개UV 투영기-겔닥랙-1개비닐장갑-마이크로 피펫100-1000mu L1개0.5~10mu l2개Ⅴ. 실험 과정1. 실험 방법① 삼각플라스크에 50x 버퍼 1ml, 증류수 49ml, 아가로스 가루 0.39g를 넣고 섞는다.② 삼각플라스크 입구를 랩으로 감싸고 작은 구멍을 뚫는다.③ 전자레인지로 끓기 전까지 돌린다.④ DNA 전기영동 트레이의 양쪽을 고무캡으로 막는다.⑤ 아가로스를 트레이에 조심스럽게 붓는다.⑥ 콤브를 (-)쪽에 꽂는다.⑦ 아가로스가 굳을 때 까지 기다리고 콤브를 제거한다.⑧ 증류수 294ml에 50x buffer 6ml를 넣어서 전기영동 버퍼를 제작한다.⑨ 대장균 플라스미드 5mu l에 gel loading buffer 1mu l을 첨가한 후 피펫팅을 통해 섞는다.⑩ 1번 well에는 DNA maker을, 2번에는 0바퀴, 3번에는 10바퀴, 4번에는 20바퀴, 5번에는 30바퀴, 7번에는 김00의 형질전환 된 대장균 플라스미드, 8번에는 이00의 형질전환 된 대장균 플라스미드, 9번에는 오00의 형질전환 된 대장균 플라스미드를 6mu l 씩 넣는다.⑪ 전압을 150V로 걸어주고 20분간 기다리며 관찰한다.⑫ 전기영동 완료 후, 겔과 트레이를 꺼낸다.⑬ 평평한 표면에 겔을 올려놓는다.⑭ 전기영동 버퍼를 몇 방울 떨어뜨려 촉촉하게 한다.⑮ 장갑을 끼고 EtBr 염색카드를 겔 위에 올린다.? 겔 위에 비커를 올려서 하중을 주어 카드와 겔 사이의 공기층을 제거하여 직접 접촉할 수 있도록 한다.? 3~5분 정도 기다린다.? 염색카드를 제거하고 300nm 파장을 이용해서 결과를 관찰한다.[그림 1] 전기영동 겔을 제작한 모습[그림 2] 전기를 공급하는 모습2. 주의사항1) 피펫이 well을 찢지 않도록 주의한다.2) DNA를 well에 조심스럽게 쌓는다.3) 기포는 수면에 가까운 곳에서 뺀다.4) 트레이에서 고무캡을 뺄 때 well이 찢어지지 않게 조심한다.5) DNA well을 (-) 쪽에 위치하도록 한다.6) 염색할 때 카드와 겔 사이에 기포를 완전히 제거하여야 염색이 잘 된다.7) UV 사진을 찍을 때 보안경을 낀다.Ⅵ. 결과전기영동 결과는 다음과 같다.[그림 3] 30분간 전기영동 진행 결과UV를 이용하여 DNA 밴드를 관찰한 결과는 다음과 같다.[그림 4] UV로 관찰한 결과겔닥을 이용하여 DNA 밴드를 관찰한 결과는 다음과 같다.[그림 5] 겔닥을 이용한 관찰결과다음은 결과를 정리한 표이다.DNA makerPCR 0바퀴PCR 10바퀴PCR 20바퀴PCR 30바퀴DNA 밴드가 확인되었다.관찰되지 않음김00 플라스미드이00 플라스미드오00 플라스미드옅게 관찰됨뚜렷하게 관찰됨옅게 관찰됨Ⅶ. 결론 및 고찰1. 결론1) DNA marker는 밴드가 크기별로 잘 관찰되었다.2) PCR을 진행한 DNA는 전기영동 결과 관찰되지 않았는데 이는 PCR 과정에서 오류가 발생하였다고 생각할 수 있다.3) 플라스미드 추출한 것을 관찰한 결과 조원 모두 관찰된 것으로 보아 대장균의 플라스미드가 추출되었다고 생각할 수 있다.4) 조원 중 두 명의 플라스미드는 흐릿하게 관찰되었는데 이는 플라스미드 추출과정에서 수득률이 낮아져서 DNA 양이 적기 때문일 것이다.2. 오차의 원인 및 고찰가. 오차의 원인1) EtBr 염색이 제대로 되지 않았을 수 있다.2) PCR 과정에서 primer나 DNA 중합효소가 잘못되어서 DNA가 제대로 증폭되지 않았거나 DNA 양이 적을 수 있다. 이로 인해 전기영동 결과를 관찰 할 결과 매우 흐릿해서 육안으로 구분이 되지 않았을 것이다. 또한 처음에 PCR을 할 때 사용하였던 DNA 주형가닥이 변성되었거나 제대로 들어가지 않았을 경우도 있다.3) 플라스미드 추출과정에서 pellet이 완전히 풀리지 않았거나 EB buffer을 충분히 첨가하지 못하는 등 다양한 요인들로 인해 수득률이 낮아져서 전기영동 결과 흐릿하게 관찰 되었을 것이다.나. 고찰1) DNA 전기영동시 염색약의 종류와 특징종류특징Ethidium bromide-일반적인 UV illuminator로 관찰가능-가격이 저렴SYBR Green IdsDNA 관찰하기 좋음SYBR Green ⅡRNA와 single strand DNA를 관찰하기 좋음GelStarsingle, double strand에 모두 적용 가능염색 강도: EtBr < SYBR Green I < GelStar?2) DNA 아가로스 전기영동시 TAE 버퍼와 TBE 버퍼의 조성과 장단점TAE buffer조성Tris base: 완충용액 pH 안정화acetic acid: 전하를 흘려주기 위함EDTA: DNA 분해 방지, 전기영동에 필요한 DNA 음전하 유지장점- DNA 회수 실험에 적합하다.- 12kb 이상의 큰 사이즈 DNA 전기영동에 좋다.- 15000bp 이상의 DNA 분리에 촉진에 좋다.단점- 낮은 이온 강도와 buffering capacity로 인하여 장시간 전기영동시 필요에 따라 buffer을 교체해주어야 한다.TBE buffer조성Tris base: 완충용액 pH 안정화boric acid: 온도에 민감, 낮은 온도에서 침전되며 한 번 침전되면 잘 녹지 않음EDTA: DNA 분해 방지, 전기영동에 필요한 DNA 음전하 유지장점-작은 사이즈의 DNA 전기영동에 최적화 되어있다.- 높은 이온 강도와 buffering capacity- 크기가 비슷한 DNA 밴드를 확인하는 경우에 명확한 분리가 가능하다.단점- DNA의 이동성이 감소될 수 있다.3) DNA 전기영동 결과 pGal 염기쌍의 길이가 6751bp임에도 불구하고, 더 짧은 길이에 해당하는 곳에서 밴드가 나타나는 이유는?① 낮은 확률이지만 enzyme site가 더 존재하고 우연의 일치로 잘린 DNA들의 크기가 같아 더 진하게 보일 수 있다.② 과도한 양의 DNA를 loading한 경우, 바로 뒤따라오는 DNA는 없거나 또는 양이 적은 것처럼 보이는 경우가 있다. 앞선 DNA가 EtBr을 독식하여 바로 뒤에는 ErBr free zone이 만들어 질 수 있기 때문이다. 두개의 DNA를 동시에 달린 것과 각각을 달린 것에서 두개를 달린 것의 큰 size DNA가 좀 더 빠르게 이동하는 것처럼 보이는데 이것은 앞선 DNA의 다음에 전하가 부족한 electrolyte free zone이 형성되어 다음에 오는 DNA는 charge의 많고 적음에 상관없이 자유롭게 움직일 수 있는 환경이 만들어 지는 것과 같은 것이다. 하지만 이는 두 DNA의 크기차이가 아주 크지 않을 때 나타날 수 있는 현상이다.

자연과학| 2019.11.16| 5페이지| 2,000원| 조회(388)

PCR, DNA, 전기영동, 겔전기영동, 형질전환 대장균

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배지 제작 및 대장균 배양 평가B괜찮아요

생명과학 실험보고서23 Aug 20181배지 제작 및 대장균 배양본 보고서에서는 LB 배지를 제작하고 대장균을 접종하여 single colony를 만들고 배양하는 과정을 담았다.Ⅰ. 실험 일시2018. 08. 17 배지제작2018. 08. 24 대장균 접종Ⅱ. 실험 목적배지의 조성을 조사하여 LB 고체 배지를 제작한다. 대장균을 접종하여 single colony를 얻어내고 이를 배양한다.Ⅲ. 이론적 배경1. 배지1) 정의배지란 미생물 또는 동, 식물 조직 및 세포의 성장을 지원하기 위해 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하여 고안된 다양한 형태의 물질이다. 기체상으로 얻어지는 것을 제외하고 생존, 발육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기염류, 발육인자 등을 공급한다. 배지는 완전히 멸균한 후에 목적균을 심지 않으면 잡균이 증식될 염려가 있고, 배지를 보존하기 위해서도 반드시 멸균이 필요하다.2) 배지의 종류가. 영양분의 종류(1) 자연배지감자, 토마토, 우유와 같은 자연산물을 이용하여 만든 배지(2) 합성배지여러 화합물을 넣어 만든 배지로 다시 제한배지와 복합배지로 나누어진다. 제한배지는 첨가한 화합물의 종류와 농도를 규명할 수 있는 배지를 말하고, 복합배지는 조성을 알 수 없는 복합 화합물(peptone, yeast extract)이 쓰여 이를 규명할 수 없는 배지를 말한다.나. 사용목적(1) 선택배지특정 미생물을 선택적으로 배양하기 위해 그 미생물만이 이용할 수 있는 영양물질(항상제, 염료, 탄소원)을 포함하여 만든 배지(2) 분별배지특정 미생물을 다른 종류의 미생물과 구별하기 위해 배지에 특수한 생화학적 지시약을 넣어 만든 배지(3) 증식용배지여러 종류의 미생물이 증식하기에 충분한 영양소를 함유한 배지로 균종에 대한 선택성이 없다.(4) 강화배지여러 종류의 미생물이 혼합되어 있을 때 특정한 미생물 종을 다른 미생물들보다 빨리 증식시켜 쉽게 분리 배양할 수 있도록 만든 배지이다. 일반 증식용 배지에서 잘 증식하지 않는 미생물은 배지에 생육 촉진 물질을하는 일회용 여과장치인 시린지 필터를 이용하여 멸균을 진행하고 배지에 첨가한다.2. 농도의 종류1) 퍼센트 농도단위 질량의 용액 속에 녹아 있는 용질의 질량을 백분율로 나타낸 농도단위: %2) 몰농도용액 1L 속에 녹아 있는 용질의 몰수단위 : mol/L, M3) 몰랄농도1000g의 용매에 녹아 있는 용질의 몰수단위 : mol/kg, m4) 노르말농도용액 1L 속에 녹아 있는 용질의 g 당량수단위 : N3. 대장균(E.coli)1) 정의Escherichia coli는 사람이나 동물의 장 속에 사는 세균으로 양쪽 끝이 둥글고 길이 2~4mu m의 간균으로 편모를 가지고 있어 운동성이 있다. 이는 포자를 만들지 않는 장내세균과에 속하는 Gram 음성균이다. 대장에 특히 많이 존재하여 대장균이라고 하는데, 장 밖으로 방출되더라도 짧은 기간 동안 생존이 가능하다. 일반적으로 장 속에서는 병원성을 나타내지 않고 분변오염을 통해 감염되거나 장 이외의 부위에 들어갈 경우 설사, 요로감염증, 복막염 등 여러 가지 질병을 유발한다. 반면 장 속에서 설사를 일으키는 대장균이 있는데 이를 병원성 대장균이라고 한다. 병원성 대장균은 장병원성 대장균, 장관 흡착성 대장균, 장 출혈성 대장균, 장 침입성 대장균, 장독소원성 대장균 이렇게 5 종류가 있다.4. 고압멸균기(Autoclave)1) 정의 및 원리세균의 내생포자를 파괴하여 멸균하기 위해 사용하는 기구이다. 고압멸균은 121℃, 250~1200atm에서 15분 동안 진행된다. 고압멸균기는 먼저 물을 끓이고 수증기를 발생시켜 고압멸균기 내부에 채워 넣는다. 다음에는 멸균기의 내부가 121℃, 15lb psi에 도달할 때까지 포화된 고온의 수증기를 계속 유입한다. 121℃에서 포화된 수증기는 10~12분 내에 소량의 액체에 존재하는 영양세포와 내생포자를 모두 파괴한다.[그림 1] 고압멸균기의 모습2) 사용방법① 전원을 킨다.② 핸들을 돌려 뚜껑을 연다.③ 내부의 열선이 잠길 정도로 증류수를 채운다.④ 멸균하고자 하는 물질이 담긴 용있는 유리창 틈을 통하여 외부로 나가게 하는 역할을 한다. 또한 내부에 있는 헤파 필터는 pre 필터에 의해 1차적으로 여과된 공기를 최종적으로 여과시키는 역할을 한다. 공극의 크기는 0.5~2.0mu m이고 대부분의 먼지들은 이를 통과하지 못하여 무균 상태의 공기만 내부로 유입된다.[그림 2] 클린벤치의 구성2) 헤파필터(HEPA)헤파필터는 클린벤치 내부에 사용되는 필터로 High Efficiency Particulate Air Filter라는 뜻을 가진 고성능 먼지 포집 여과기이다. 등급에 따라 0.3mu m의 입자에 대해 85~99.975% 이상의 포집능력을 가지며 필터의 여과지는 주로 직경 1~10mu m 이하의 유리 섬유로 되어 있다. 헤파필터는 입자의 크기에 따라 섬유조직에 의한 차단, 충돌, 중력에 의한 입자침강, 입자의 브라운 운동, 정전기력에 의한 흡착 등을 이용하여 입자를 포집한다. 99.75% 이상의 미세먼지를 제거하는 필터를 트루 헤파필터라고 부른다.[그림 3] 헤파필터의 구조3) 사용방법① 실험에 필요한 기구들을 클린벤치에 넣고 UV lamp를 킨다.② UV lamp가 꺼지면 fan을 작동시킨다.③ 70% 에탄올로 손을 소독한 후 클린벤치에 들어가서 알코올램프를 킨다.④ 실험을 마친 후 알코올램프를 끄고 70%의 에탄올로 바닥을 소독한다.⑤ 실험대 유리를 닫고 fan을 끈다.⑥ UV lamp를 켜서 내부를 멸균한다.6. 세균의 제거 방법1) 살균가. 정의병원성 미생물을 죽이거나 또는 반드시 죽이지는 못하더라도 활성을 낮추어서 감염력을 억제하는 조작을 말한다. 따라서 소독의 경우는 미생물 포자는 제거되지 않는다.나. 종류(1) 물리적 방법물리적 소독법에는 저온살균법, 자비소독, 자외선소독법 등이 있다.(2) 화학적 방법소독력이 있는 화학물질을 사용하여 세균을 죽이는 방법이다. 주로, 알코올, 페놀류, 알데하이드류, 과산화수소수, 계면활성제, Ethylene Oxide 등을 사용한다.2) 멸균가. 정의물체의 표면 또는 그 내부에 분포하는 모고 일정 시간 동안 건조시키면서 멸균을 하는 방법이다. 배지에 균주 등을 접종할 때 사용하는 백금 이를 멸균할 때는 주로 화염멸균법을 사용한다.습열멸균은 효소 및 구조단백질 등의 필수 단백질의 변성을 유발하고, 핵산을 분해하며 세포막을 파괴하여 미생물을 사멸시킨다. 이를 이용하는 것이 고압멸균기이다.(2) 방사선에 의한 멸균방사선(Radiation)은 에너지가 높아 불안한 물질이 안정된 상태를 찾기 위해 방출하는 에너지의 흐름으로 자외선(UV), X-선, 감마선 등을 적당한 강도와 조사 시간에 따라 미생물의 생장을 제어할 수 있다. 크게 Ionizing 과 Nonionizing 방법으로 나눌 수 있다. Ionizing 방법에는 X-선, 감마선 등이 포함되며 Nonionizing 방법에는 자외선 조사가 포함된다.(3) 가스에 의한 멸균가스는 열에 민감한 기구를 멸균시키는 데에 이용된다. 열에 대한 변성이 없고, 비교적 형태가 보존되기 때문에 미생물에 오염된 기구들을 재사용이 가능하게 한다. 주로 산화에틸렌 가스를 사용하여 DNA 복제와 효소작용을 차단하여 멸균한다.(4) 필터에 의한 멸균Membrane filter(막 여과장치)는 depth filter를 대신하여 여러 용도로 사용된다. 특히, 실험실에서 사용되는 배양액 등의 여러 액체 멸균 목적으로 많이 사용이 되며, Filter의 재질은 cellulose acetate, cellulose nitrate, polycarbonate, polysulfone과 같은 내구성이 좋은 합성물질로 만들어진다. 이들의 재질로 Filter에 구멍을 많이 뚫어서 사용하며, 대개 두께는 0.1 mm정도이고 구멍의 크기는 목적에 따라 다양하다.7. 백금이1) 정의60mm×0.5mm 정도의 백금선 끝을 둥글게 하여 에보나이트 손잡이가 붙은 스테인리스강 혹은 알루미늄 막대에 부착한 기구이다. 미생물 실험에 특히 효모, 호기성 세균의 채취에 자주 사용된다.2) 사용방법① 백금이의 동그란 부분을 화염 멸균한다.② 백금이를 5초정도 식힌다.은 액체상태의 고체배지에 접종해야할 미생물 배양액을 섞어서 함께 굳혀서 접종하는 방법이다.9. 배지를 보관하는 방법미생물배양기에 고체배지를 보관할 때는 뒤집어서 보관해야한다. 뒤집어서 보관하지 않으면 페트리디시 뚜껑에 습기가 생겨 공기 중의 미생물에 의한 오염 확률이 높아진다. 뚜껑에 있는 물방울이 미생물에게 떨어지게 되면 고체배지의 콜로니의 배양과 관찰에 영향을 줄 수 있다. 또한 뒤집지 않으면 배지 내의 수분손실 가능성도 증가한다.Ⅳ. 시약 및 실험 기구시약용량비고Agar(s)1.5g100mL 기준Yeast Extract(s)0.5g100mL 기준Tryptone(s)1g100mL 기준NaCl(s)1g100mL 기준NaOH(l)0.1mL1MGlucose(s)5mL20% stock대장균 원액--증류수100mL-실험기구용량비고부피플라스크50mL1개삼각플라스크500mL1개비커100mL1개알루미늄 포일--약포지-4장약수저-4개전자저울-1개고압멸균기--클린벤치--페트리디시-1개파라필름--70% 에탄올--비닐랩--씻기병-1개백금이-1개주사기5mL1개시린지 필터0.2mu m1개네임펜-1개Ⅴ. 실험 과정1. LB 배지 제조① 전자저울의 수평을 맞추고 전원을 킨다.② 약포지를 올려놓고 영점을 맞춘다.③ 약포지 위에 Agar 1.5g, Yeast Extract 0.5g, Tryptone 1g,NaCl(s) 1g를 각각 올려놓고 측정한다.④ 부피플라스크를 이용하여 삼각플라스크에 물 100mL를 담고 정확한 100mL 눈금을 표시한다.⑤ 삼각플라스크를 비우고 ③의 시약을 빈 삼각플라스크에 넣는다.⑥NaOH(s) 0.1mL를 피펫을 이용하여 삼각플라스크에 넣는다.⑦ ④에서 표시한 100mL 눈금까지 증류수를 채운 후 잘 섞어준다.⑧ 알루미늄 호일을 이용하여 삼각플라스크의 입구를 감싼다.⑨ 고압멸균기에 넣고 멸균시킨 후 꺼낸다.⑩ 사용 30분 전에 클린벤치에 알코올램프, 페트리디시, Glucose 20% stock을 넣고 UV lamp를 켜놓는다.⑪ UV lamp가 꺼지면 클린벤치의다.

자연과학| 2020.09.20| 7페이지| 1,500원| 조회(1,490)

대장균, 배지, 배양, 미생물 배지, LB배지, 미생물 배양, 고체배지, 대장균 배양, 배지제작

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pGal 플라스미드로 대장균 형질전환 하기

생명과학 실험보고서18 Oct 20181pGal 플라스미드로 대장균 형질전환 하기Ⅰ. 실험 일시2018. 10. 19. 금 8:10~11:00 AMⅡ. 실험 목적pGal 플라스미드로 JM109를 형질전환 시키고 X-gal을 이용하여 선별한다.Ⅲ. 이론적 배경1. 형질전환1) 정의형질전환은 외래 DNA 분자가 세포에 도입되어 유전적인 변화가 일어난 것을 의미한다. 세균이 다른 세균의 DNA를 받아들여 자신의 염색체에 삽입하는 것이다. 형질전환은 무성생식을 하는 세균 등의 미생물이 유전적 다양성을 확보할 수 있는 생존 전략이다.2) 방법가) 화학적 방법대장균과 같은 그램 음성 세균의 형질전환에 널리 사용되는 방법은 염화칼슘(CaCl _{2}) 처리법이다. 2가의 양이온은 세포막의 유동성을 높여주고, 세포 표면의 인지질, lipopolysaccharide(LPS)의 음전하를 중화시켜, 음전하를 띈 DNA의 세포 표면 결합 및 통과를 촉진시키는 것으로 알려졌다. 형질전환시에 염화칼슘으로 처리한 세포에 열충격을 주는데, 이는 세포 구멍이나 손상된 세포벽을 통한 DNA의 세포내로의 이동을 촉진하는 효과가 있다.CaCl _{2} 이외에 다른 물질이 사용되기도 하는데, Saccharomyces cerevisiae 등 효모의 경우 lithium acetate와 polyethylene glycol을 사용한다. 한편 Streptomyces와 같이 균사체를 형성하는 미생물의 경우 효소 처리를 통해 세포벽을 제거한 후 spheroplast 형태로 만들어 형질전환을 하기도 한다.나) 전기천공법전기천공법은 세포에 10-20 kv/cm의 일시적인 전기충격을 가해 세포막을 불안정하게 하고 순간적인 구멍이 형성되어 이를 통해 DNA가 들어가도록 하는 방법이다. 일반적으로 화학적 방법보다 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있다.2. 형질도입1) 정의형질도입은 박테리오파지를 매개로 하여 세균 DNA가 다른 세균으로 이동되는 현상이다.2) 방법가) 일반 형질도입[그림 2] 일반 형질도입 과정나) 특이 때 pUC 계열의 플라스미드는 여러 가지 제한효소 인지부위를 가지고 있고beta -galatosidase의 -NH _{2} 말단 부위를 코드하는 유전자 lacZ를 가지고 있다. pUC 벡터를 이용한 클로닝에 사용되는 숙주 박테리아는beta -galatosidase의 -COOH 말단 부위를 코드하는 유전자가 함유되어 있어 pUC가 적당한 숙주내로 도입되면 생체내에서 보상작용에 의하여 활성을 가진beta -galatosidase가 만들어진다. 이를 X-gal을 넣은 배지에 배양하면beta -galatosidase에 의해 X-gal이 분해되어 파란색을 띤다.pUC벡터의 lac Z 유전자 내에 외래 유전자를 삽입하게 되면 lac Z가beta -galatosidase의 -NH _{2}이 제대로 만들어지지 못한다. 즉, 재조합 pUC벡터는 숙주 박테리아에 도입되어도 보상작용을 일으키지 못해 X-gal을 첨가한 배지에서 배양할 때 무색을 띤다. 이를 이용하여 외래 유전자가 포함된 플라스미드가 도입된 대장균을 선별할 수 있다.이러한 선별지표로 사용하는 것이 항생제이다. 대표적으로 엠피실린과 테트라사이클린이 있는데 본 실험에서는 엠피실린을 사용한다. 대장균의 plasmid에 엠피실린 저항성 유전자가 있으면 엠피실린이 포함된 배지에서 자랄 수 있다. 따라서 Amp를 가진 plasmid를 가진 대장균만 따로 선별 할 수 있다.5. 대장균(Escherichia coli)본 실험에서 사용하는 대장균 균주명은 JM109이다. 대장균 안에 들어있는 플라스미드명은 pGal로 유전자 지도는 다음과 같다.6. pGalpGal 플라스미드는beta -galatosidase를 암호화하는 유전자를 가지고 있다. X-gal은beta -galatosidase에 의하여 절단되고 착색된 생성물을 형성할 때 청색으로 나타난다. 숙주 E.coli는beta -galatosidase 유전자를 가지고 있지 않기 때문에 pGal 플라스미드로 형질 전환 된 세포만이beta -galatosidase를 생산할 것이다. .장점피펫으로 용액을 옮기고 믹싱을 한 번에 할 수 있어서 편리하다.단점균일하게 믹싱하는 것이 어렵다. 기포가 쉽게 발생한다. 피펫팁 안에 용액에 들어가서 총 용량에 오차가 발생할 수 있다.8.CaCl _{2}를 넣는 이유플라스미드가 띠고 있는 전하는 (-)띠고 대장균은 (+), (-) 전하를 모두 지니고 있는데CaCl _{2} 를 넣어주게 되면 이온을 통하여 대장균이 (+)전하를 띄게 된다. 그렇게 되면 플라스미드와 대장균이 붙게 되어 형질전환이 잘 일어날 수 있게 된다.9. 위성 콜로니가 나타나는 이유시간이 지남에 따라 작은 흰색 콜로니가 큰 파란색 콜로니 주변에 생길 수 있다. 이때 작은 흰색 콜로니는 엠피실린에 내성이 없고 pGal 플라스미드로 형질 전환되지도 않았다. 이들은 파란색 콜로니에서 생성된 β-lactamase가 확산된 곳에 엠피실린이 불활성되어서 살 수 있는 것이다. 엠피실린의 농도가 낮거나 오랜 시간 배양하게 되면 위성 콜로니의 개수가 증가하게 된다.또 다른 경우 배지의 pH가 7 이하일 때 위성 콜로니가 생성된다. β-lactamase는 pH 7 이하에서 불활성화 되기 때문이다. 대장균의 성장은 배지를 산성화시키므로 엠피실린 배지를 pH 7.4로 유지시키고 과도한 대장균의 성장을 억제하면 위성 콜로니의 발생을 막을 수 있다.10. 실험 과정 중 열충격을 가하고 얼음에 두는 이유얼음에 두는 과정은 incubation이라고 하는데 이때 세포와 DNA를 안정화시키고 역가를 잃어버리는 것을 최소화하는 과정이다. 또한 열충격을 가하는 이유는 42℃에서 형질 전환이 촉매되기 때문이다. 하지만 이 반응은 온도에 민감하여 이때 램프라 핫플레이트를 사용하면 42℃에서 쉽게 어긋나기 때문에 효율이 크게 ㄸ?ㄹ어진다.11. pGLO를 이용한 형질 전환pGLO 형질 전환 시스템은 대장균에 녹색 형광 단백질(GFP)를 합입하여 형질 전환을 일으키는 체계이다. GFP 유전자는 어두운 곳에서 형광을 발하는 Aequorea victoria 해파리에서 유래하였다. 형피} over {배양한`대장균`부피} =형질전환효율Ⅳ. 시약 및 실험 기구시약용량비고대장균 배양 중인 고체 평판 배지대장균 콜로니가 15개 이상 존재배지X-gal/-60mmX-gal/amp/-60mmX-gal/amp/+60mmCaCl _{2}(l)500mu l50mMLB 액체 배지pGal25mu lcontrol buffer25mu lLB 고체 배지 병실험기구용량비고1회용 멸균 백금이2개마이크로 피펫1개유성펜1개항온 수조1개아이스 버켓1개파쇄된 얼음-초시계1개배양기1개멸균된 EP 튜브1.5ml2개멸균된 이쑤시개1개볼텍서1개탁상용 원심분리기1개알코올램프1개점화기1개플로팅 랙1개랙1개파라필름1개미생물 배양기1개전자레인지1개페트리디시60mm3090mm5적외선 온도계Ⅴ. 실험 과정1. 대장균 형질 전환1) 실험방법① 멸균된 EP 튜브 뚜껑에 (+),(-)를 표기한다.② (-)라고 표기한 EP 튜브에 차가운CaCl _{2} 500ul를 넣는다.③ 하루 전날 배양해 놓은 대장균이 있는 배지에서 15개의 싱글콜로니를 선별하여 이쑤시개에 묻히고 볼텍싱한다.[그림 4] 볼텍싱 하는 모습④ (-) EP 튜브에 이쑤시개를 넣고 저어서 대장균을 접종한다.⑤ 차가운CaCl _{2} 250ul를 (+) EP 튜브에 옮긴다.⑥ (+) EP 튜브에는 pGal 10ul를 넣고 (-) EP 튜브에는 control buffer 10ul를 넣는다.[그림 5] pGal과 control buffer를 넣는 모습⑥ (-),(+) EP 튜브를 10분간 얼음 버켓에 꽂아놓는다.⑦ 그 후 (-), (+) EP 튜브를 플로팅 랙에 꽂고 42도인 항온수조에 90초간 넣는다.[그림 6] EP 튜브를 플로팅 랙에 넣은 모습⑧ 다시 (-), (+) EP 튜브를 2분간 얼음 버켓에 꽂는다.⑨ (-), (+) EP 튜브에 LB 액체배지를 250ul씩 넣고 손으로 tapping하며 부드럽게 섞는다.⑩ (-), (+) EP 튜브를 플로팅 랙에 꽂고 37도 항온수조에 30분간 넣는다.⑪ X-gal/-, X-gal/amp/-, 이용할 경우 균형을 맞게 넣어줘서 사용해야 한다. 그렇지 않을 경우 원심분리기가 많이 흔들려 다칠 위험이 있다.5. 항온수조의 온도가 원래 온도보다 높으면 찬 물을 넣어주어 온도를 맞춘다.6. pGal과 control buffer은 세워서 차가운 곳에 보관한다.7. 플로팅 랙을 사용할 경우 EP 튜브 전체가 항온 수조에 노출될 수 있도록 한다.8. EP 튜브 뚜껑에 용액이 묻은 경우 원심 분리기를 사용한다.9. ⑤의 과정에서 (-) EP 튜브에 있는 용액 중 절반을 (+)로 옮길 때 (-) 튜브 안의 용액이 균일하게 유지되도록 주의한다.10. ⑭에서 용액이 배지로 흡수되기 전에 뚜껑을 닫고 뒤집지 않게 주의한다.2. 고체 아가 분주하기1) 실험방법① 고체화된 LB 배지 병을 주무르며 흔들어서 작은 덩어리로 부순다.[그림 8] LB 고체 배지를 부수는 모습② 뚜껑을 살짝 연다.③ 전자레인지로 60초 동안 가열하여 아가를 녹인 후 병을 흔들어 섞는다. 아가가 완전히 녹을 때 까지 30초 간격으로 계속 가열한다.[그림 9] 고체배지를 충분히 녹인 모습④ 배지 병을 흔들면서 60℃가 되도록 식힌다.⑤ 30개의 60mm 페트리디시를 준비하여 20개에는 ‘X-Gal/Amp’이라고 표기하고 나머지 10개에는 ‘X-Gal/Control’이라고 표기한다.⑥ 피펫으로 LB 배지액을 5개의 90mm 페트리디시에 20ml 씩 분주한다.⑦ ④의 식힌 아가에 해동시킨 X-Gal을 첨가하고 뚜껑을 닫고 섞는다.⑧ 피펫으로 ⑦의 용액을 X-Gal/Control라고 쓰여진 페트리디시에 5ml씩 넣는다.⑨ 남은 아가에 엠피실린을 첨가하고 뚜껑을 닫고 섞는다.⑩ 피펫으로 ⑨의 용액을 X-Gal/Amp라고 표시된 페트리디시에 5ml 씩 넣는다.⑪ 뚜껑을 덮고 LB 배지가 굳을 때까지 20분 정도 기다린다.⑫ 상온에 배지를 뒤집어서 보관한다.2) 주의사항1. 가열 전에 LB 배지 병의 뚜껑을 열지 않으면 병이 깨지고 폭발 할 수 있다.2. 고체 아가를 녹일 때 완전히 녹일 수 있도록 한다.3. 이다.

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세포 관찰 및 세포의 크기 측정 평가A+최고예요

생명과학 실험보고서31 Aug 20181세포 관찰 및 세포의 크기 측정본 보고서에서는 잎의 공변 세포, 양파의 표피 세포, 구강 상피 세포로 프레파라트 제작하고 이를 관찰하여 그 크기를 측정하는 과정을 담았다.Ⅰ. 실험 일시2018. 08. 31. 금 8:10~11:00 AMⅡ. 실험 목적잎, 양파의 표피, 구강 세포를 이용하여 프레파라트를 만들고 이를 광학현미경으로 관찰한다. 또, 마이크로미터를 이용하여 세포의 크기를 측정한다.Ⅲ. 이론적 배경1. 광학현미경1) 원리대물렌즈 및 접안렌즈라고 부르는 2조의 렌즈를 조합하여 미소한 물체까지 확대하여 관찰하기 위한 광학기계. 대물렌즈로 확대한 물체의 실상을 접안렌즈로 더욱 확대하여 관찰한다. 본 실험에서 사용한 광학현미경은Light Microscopes for Education Leica DM750 P라는 제품으로 대물렌즈는 10배율, 접안렌즈는 4, 10, 100배율을 사용하였다.[그림 1] 실험에 사용한 광학현미경 [그림 2] 광학 현미경의 구조2) 해상력해상력은 광학기기들이 구분해 낼 수 있는 두 점 사이의 거리를 말한다. 현미경의 해상력은 대물렌즈의 개구수로 정해지며 관찰하는 빛에 영향을 받는다. 또한 단파장의 빛에서 높게 나타난다.해상력= {lambda } over {2NA} (lambda : 사용파장,NA: 대물렌즈의 개구수)3) 개구수대물렌즈를 통과한 빛과 광축이 이루는 최대각과 대물렌즈와 시료 사이의 매질의 굴절률을 이용하여 정의된다. 현미경의 해상력을 결정하는 수로 이 값이 클수록 현미경으로 분별 가능한 최소의 길이가 작아진다. 현미경의 대물렌즈의 바깥 통에 그 수치가 표시되어 있다. 예를 들어 10TIMES 0.25라고 표시되어 있는 것은 배율 10배, 개구수 0.25인 렌즈라는 뜻이다. 개구수가 클수록 상이 밝아지며 분해능이 커져 매우 작은 물체도 볼 수 있다.개구수=nsinu(n: 대물렌즈와 관찰한 시료 사이의 매질의 굴절률,u: 대물렌즈로 들어오는 광선이 광축과 이루는 각의 최댓값)4) immersion oil을 사용하는 이유immersion oil을 사용하는 이유는 고배율 상을 관찰할 때 이미지의 해상도를 증가시키기 위해서이다. oil은 일반 공기보다 굴절률이 크기 때문에 개구수가 커지게 된다. 개구수가 커지면 해상력의 크기가 작아지기 때문에 해상력이 높아진다. 그 결과 보다 선명한 상의 관찰이 가능해진다.2. 염색액1) 종류염색액염색 부위와 색깔아세트산카민핵 염색체, 적색메틸렌블루핵, 세포질, 청색에오신세포질, 적색산성 훅신세포질, 적색사프라닌핵, 적색야누스그린 B미토콘드리아. 녹색김자액혈구, 청색헤마톡실린핵, 보라색[그림 3] 본 실험에서 사용한 염색액의 모습2) 메틸렌블루메틸렌블루용액은 동물세포의 핵을 염색하는데 자주 이용되는 염색액이다. 이는 용매에 녹여 이온화되어C _{16} H _{18} N _{3} S ^{+}와Cl ^{-}를 만든다. 이때 진핵세포의 염색체는 음전하를 띠기 때문에 메틸렌블루의 푸른색을 띠는 양이온이 인산기 주위로 끌려가 핵이 푸르게 염색된다.3) 아세트산카민아세트산카민은 세포를 고정하고 염색하는 데에 쓰이는 붉은색 용액이다. 아세트산카민이 이온화되어 붉은색을 띠는 양이온을 내놓으면 음전하를 띠는 염색체에 끌려가 핵이 붉은색으로 염색된다.3. 잎의 구조잎은 표피조직, 울타리조직, 해면조직, 잎맥, 공변세포, 기공 등으로 구성된다. 표피는 잎을 감싸는 얇은 세포 층으로, 엽록체가 없어 투명하다. 따라서 광합성이 일어나지 않는다. 큐티클층으로 싸여 있어 수분 손실을 막고, 잎 내부를 보호하며, 주로 잎의 뒷면에 분포한다. 공변세포는 표피세포가 변형된 반달 모양으로, 안쪽 세포벽이 바깥쪽 세포벽보다 두껍다. 엽록체가 있어 광합성이 일어난다. 기공은 2개의 공변세포로 이루어진 구멍으로, 잎 뒷면에 주로 분포한다. 증산 작용과 기체 교환이 일어난다. 수증기, 산소, 이산화탄소 등이 드나든다. 울타리 조직은 엽록체가 있는 길쭉한 모양의 세포가 빽빽하게 배열되어 있다. 따라서 광합성이 가장 활발하게 일어난다. 해면 조직은 엽록체가 있는 둥근 모양의 세포가 엉성하게 배열되어 있고, 세포 사이의 공간으로 기체가 이동한다. 광합성이 일어난다. 잎맥은 잎에 분포하는 관다발로, 물관과 체관으로 구성된다. 잎 몸을 지탱하며, 물질의 이동 통로이다.[그림 4] 잎의 구조4. 상피 세포1) 정의동물의 몸 표면이나 내장기관의 내부 표면을 덮고 있는 세포로 상피세포의 가장 큰 역할은 우리 몸을 보호하는 것이다. 상피세포는 한 층 또는 여러 층으로 서로 밀착되어 있으며 이들 세포가 모여 상피조직을 이룬다.2) 구강상피구강상피는 구강점막 표면을 덮고 있는 중층편평상피를 말한다. 구강 내에 존재하는 물리적, 화학적, 미생물학적 자극이나 해로운 물질로부터 점막 하부 조직을 보호한다. 기저층, 가시층, 과립층, 각질층으로 구성되어 있고 본 실험에서 사용한 부분은 각질층에 해당된다. 구강상피세포는 2주면 구강 안의 상피세포가 모두 교체될 정도로 분열속도가 빠르다.5. 표피 세포식물체의 가장 바깥쪽에 위치하는 세포로, 사람의 피부세포에 해당하는 세포이다. 표피세포는 보통 한 층으로 배열되어 표피조직을 이루고 있으며, 식물체 내 물질의 출입을 조절하고, 식물체를 보호하는 역할을 한다. 잎에 있는 표피세포들에는 큐티클이잘 발달해있어 외부로 수분이 증발하는 것을 막고 외부의 침입을 막는다.6. 대물마이크로미터대물마이크로미터는 접안마이크로미터 한 눈금의 길이를 계산하는데 사용하는 눈금이 새겨져 있는 평평한 판이다. 눈금의 간격은 10mu m로 고정되어있다. 대물렌즈의 배율에 따른 접안마이크로미터 한 눈금의 길이를 구하기 위해서 사용한다.[그림 5] 본 실험에서 사용한 대물마이크로미터7. 접안마이크로미터접안마이크로미터는 현미경으로 물체의 길이를 측정할 때 사용한다. 사용 전에 접안마이크로미터를 설치한 후 재물대 위에 대물마이크로미터를 놓고 관찰한다. 이때 정확히 겹치는 두 눈금을 찾고, 그 사이에 들어가는 눈금 수를 세는 방법으로 한 눈금의 길이를 정한다.Ⅳ. 시약 및 실험 기구시약용량비고아세트산카민-2~3방울메틸렌블루-2~3방울생리식염수-2~3방울아세트올세인-2~3방울실험기구용량비고광학현미경1대-커버글라스3개-슬라이드글라스3개-접안마이크로미터1개-대물마이크로미터1개-거름종이1개-소독된 면봉1개-메니큐어1개-양파1개-잎1개-셀로판테이프--Ⅴ. 실험 과정1. 잎의 공변세포 관찰① 관찰하고자 하는 잎을 준비한다.② 관찰하고자 하는 부분에 매니큐어를 펴 바른다.③ 매니큐어가 완전히 마르면 셀로판테이프를 그 위에 붙이고 떼어낸다.④ 떼어낸 테이프를 슬라이드글라스에 붙인다.⑤ 슬라이드글라스를 현미경 재물대에 올려놓는다.⑥ 대물렌즈를 저배율에서 고배율로 바꾸면서 초점을 맞춘 후 관찰한다.⑦ 접안렌즈에 카메라를 대고 촬영한다.[그림 6] 잎 뒷면에 매니큐어를 칠한 모습2. 양파의 표피세포 관찰① 양파의 안쪽 표피를 얇게 떼어낸다.② 표피를 슬라이드글라스에 올린다.③ 벗겨낸 표피 위에 아세트산카민 용액을 떨어뜨린다.④ 표피 위에 커버글라스를 덮는다.⑤ 슬라이드글라스를 재물대 위에 올려놓는다.⑥ 대물렌즈를 저배율에서 고배율로 바꾸면서 초점을 맞춘 후 관찰한다.⑦ 접안렌즈에 카메라를 대고 촬영한다.[그림 7] 양파의 표피로 프레파라트를 제작한 모습3. 구강 상피세포 관찰① 입안을 물로 깨끗이 헹군다.② 소독된 면봉으로 입 안쪽 볼을 긁어낸다.③ 슬라이드 글라스 위에 생리식염수를 떨어뜨린다.④ 면봉의 솜에 묻어 나온 흰 물질을 받침유리 위의 생리식염수에 떨어뜨린다.⑤ 커버 글라스를 생리식염수 위에 덮는다.⑥ 커버 글라스 밖으로 흘러나온 생리식염수에 메틸렌블루 용액을 떨어뜨린 후 반대편에 거름종이를 대고 빨아들인다.⑦ 5분간 기다린다.⑧ 슬라이드글라스를 재물대 위에 올려놓는다.⑥ 대물렌즈를 저배율에서 고배율로 바꾸면서 초점을 맞춘 후 관찰한다.⑦ 접안렌즈에 카메라를 대고 촬영한다.[그림 8] 구강 상피세포로 프레파라트를 제작한 모습4. 구강 상피세포 크기 측정① 접안렌즈의 뚜껑을 열고 접안마이크로미터를 넣는다.② 재물대 위에 대물마이크로미터를 놓는다③ 사용하고자 하는 대물렌즈의 배율을 선택한다.④ 초점을 맞춘다.⑤ 대물마이크로미터의 눈금과 접안마이크로미터의 눈금이 일치하도록 접안마이크로미터를 돌린다.⑥ 겹친 부분의 눈금 수를 센다.⑦ 접안마이크로미터 1눈금의 길이={a} over {b} TIMES 10 mu m (a: 대물마이크로미터의 눈금 수,b: 접안마이크로미터의 눈금 수)를 이용하여 접안마이크로미터 한 눈금의 길이를 측정한다.

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PCR 실험보고서

생명과학 실험보고서26 Oct 20181중합효소 연쇄 반응을 이용한 DNA 증폭Ⅰ. 실험 일시2018. 10. 26. 금 8:10~11:00 AMⅡ. 실험 목적대장균의 DNA를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 진행한 후 분석한다.Ⅲ. 이론적 배경1. PCR(polymerase chain reaction)1) 원리 및 과정중합효소 연쇄반응이라고도 한다. 2개의 primer사이의 DNA부분을 시험관내에서 대량으로 증폭시킬 수 있는 방법이다. PCR의 과정은 목적 DNA의 변성, DNA 프라이머의 부착, 새로운 DNA의 중합의 3단계 과정을 반복한다. 먼저 DNA의 변성 과정에서는 90~96℃로 가열하여 DNA의 이중 나선 구조를 단일 가닥으로 분리시킨다. 두 번째로 프라이머의 부착 과정에서는 DNA 프라이머를 주형 DNA에 결합시키는 과정으로 50~65℃에서 진행된다. 마지막으로 DNA 합성 과정에서는 열에 강한 DNA 중합 효소에 의해 주형 DNA에서 새로운 DNA를 합성한다. 70~74℃에서 시행하고 마지막 cycle에는 약 10분 정도로 시간을 충분히 준다.2) 특징PCR은 원리적으로 시료에 대상이 되는 DNA단편이 1분자만 있어도 검출이 가능하다는 장점이 있다. PCR의 단점은 Taq 중합효소가 DNA의 증폭 중에 빈번하게 오독을 일으키는 것이다. 현재는 이 잘못된 염기의 이입빈도가 낮고, 또한 DNA합성속도가 빠른 내열성 DNA 중폭합효소를 계속적으로 개발하여 20,000염기에 1개의 오독이 생기는 정도로 PCR의 효율이 향상되고 있다.[그림 1] 중합 효소 연쇄 반응 과정[그림 2] 본 실험에서 사용한 PCR 기계4) cycle 수PCR의 경우 n회의 cycle로 이론값은2 ^{n}배이지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저하되는 이유는 다음과 같다.① DNA polymerase의 활성 상실 및 주형 DNA의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족② 증폭단편간의 annealing되는 속도가 빨라져서 primer의 anneal과 경합③ Pyphosphate 축적으 정도로 PCR 에 충분한 열안정성을 가지고 있다.5) gel loading buffergel lodaing buffer은 글리세린과 염색약이 혼합된 것이다. 염색약은 푸른색을 띠는 bromophenol과 청록색을 띠는 xylencyanolIFF으로 되어 있다. 여기서 글리세롤은 DNA를 무겁게 하는 역할을 하고 bromophenol은 전기영동의 진행 상태를 확인할 수 있게 하는 지표이다. bromophenol은 400~500bp DNA와 전개 속도가 비슷하고 xylencyanolIFF은 4Kb의 DNA와 전개 속도가 비슷하기 때문이다. 따라서 gel loading buffer의 기능을 정리하면 다음과 같다.① DNA 전기영동 진행상황을 알려준다. gel loading buffer에는 bromophenol blue (BPB; 파란색)과 xylene cyanol (XC)가 들어 있어서 진행정도에 따라 색이 변한다.② DNA를 가라앉혀서 전기영동시 잘 분리되도록 돕는다. DNA는 밀도가 작아서 쉽게 뜨는 특성을 가지고 있는데 전기영동시 well에 DNA 샘플을 로딩할때는 buffer보다 가라앉아야 한다. 이때 gel loading buffer가 도와준다. gel loading buffer에는 분자량이 큰 sucrose, glycerol, ficoll 등이 함유되어 있다.6)MgCl _{2} PCR 반응에서는 1.5~2.5mM의Mg ^{2+}가 필요하다.Mg ^{2+}는 효소활성, primer의 annealing, 합성된 DNA의 충실성, primer-dimer의 형성 등에 관여한다.Mg ^{2+}의 최적 농도는 dNTP 농도를 고려하여 결정되는데Mg ^{2+}의 농도가 높으면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미친다. 또한 두 가닥 DNA 변성이 어려워지고 Taq polymerase가 저해 받는다.3. PrimerDNA 합성을 위한 출발점 역할을 하는 RNA 또는 DNA의 짧은 가닥을 말한다. 생체 내에서 DNA를 합성할 때는 DNA 주형에 상보적인 뉴클레오타이드를 전기영동에 영향을 주는 요인① DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.② Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.?③ DNA 형태에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음?linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.④ 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.?⑤ 전기장의 방향이 이동속도에 영향을 미친다.⑥ Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.?⑦ 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.Ⅳ. 시약 및 실험 기구시약용량비고DDW41mu L3차 증류수Taq buffer5mu L10xdNTP Each1mu L10mMOppB F primer1mu L20pmole/ mu LOppB B primer1mu L20pmole/ mu LTaq polymerase1mu L4U/ mu Lgel loading buffer5mu L5xPCR 구슬--실험기구용량비고PCR 튜브0.2ml1개0.5mL 튜브0.5ml4개voltexer-1개원심분리기-1개PCR 기계-1개랙-1개마이크로 피펫0.5-10mu L1개10-100mu L1개20-200mu L1개100-1000mu L1개네임펜-1개Ⅴ. 실험 과정1. 실험 방법① PCR(0.2mL)튜브 1개와 0.5mL 튜브 4개를 준비하고 0.5mL 튜브에 0, 10, 20, 30이라고 표기한다.② 0이라고 쓰인 0.5mL 튜브에 primer mix 20mu l, DDW 15mu l와 DNA 주형가닥 5mu l를 넣는다.③ inverting을 이용하여 부드럽게 섞어준다. 이때 연녹색으로 변하는 것을 확인한다.④ PCR 튜브에 ③의 용액 30mu l를 옮긴다.⑤ 0.5mL 튜브에 남은 10mu l에 5mu l의 gel loading buffer(5x)와 10mu l DDW를 넣는다.⑥ PCR 튜브에 PCR 구슬을 넣는다.⑦ voltexing을 이용하여 섞는다.⑧ 원심분리 시킨다.⑨ PCR의 온올램프를 켜두고 실험을 진행하여 오염을 최소화한다.3) ⑧의 원심 분리시키는 과정에서 용기 벽면에 뭍은 용액이 완전히 없어지도록 한다.Ⅵ. 결과전기영동을 아직 진행하지 않았기 때문에 별도의 결과는 없다.Ⅶ. 결론 및 고찰1. 결론전기영동을 진행하지 않아 결론이 존재하지 않는다.2. 오차의 원인 및 고찰1) PCR에서 DNA 중합효소가 열에 안정적이여야 하는 이유보통의 DNA 중합효소는 주로 체온정도의 온도에서 활성화되기 때문에 90℃ 이상의 온도에서 변성된다. 하지만 PCR 과정에서는 DNA를 단일가닥의 DNA로 빨리 풀리게 하기 위해서 높은 온도를 가해주어야 한다. 이때 보통의 DNA 중합효소를 사용하면 한 cycle을 돌릴 때 마다 DNA 중합효소를 다시 넣어주어야 하는 불편함이 있다. 따라서 높은 온도에서 사는 호열성 세균의 중합효소를 이용하여 PCR을 진행한다.2) 하나의 DNA 주형으로 PCR을 진행한다면 4바퀴 진행 후에 DNA는 몇 분자가 만들어지는가? 8바퀴는?PCR을 한 바퀴 진행 할 때마다 이론적으로 DNA 양은 2배로 증폭한다. 따라서 4바퀴 진행 후에는2 ^{4}인 16분자가 만들어질 것이고 8바퀴 진행 후에는2 ^{8}인 256분자가 만들어질 것이다.더 나아가 n회에서 분자량이 가장 작은 dsDNA 분자개수를 점화식을 통해 구하면 다음과 같다.D _{n} =2 ^{n} -2n3) PCR 동안 서로 다른 2개의 primer를 사용하는 이유PCR을 진행하는 동한 F(Forward) primer와 R(Reverse) primer가 사용되는데 이때 F primer는 주형 DNA와 서열이 같고 R primer는 주형 DNA와 상보적인 서열을 가지고 있다. F primer와 R primer가 모두 있어야 DNA의 주형과 비주형 가닥을 모두 증폭할 수 있다.[그림 8] 두 가지의 primer를 표시한 그림4) 주된 PCR 산물 이외의 더 작거나 흐린 밴드가 만들어지는 이유주형 DNA 양이 적거나 DNA primer가 전기영동 상에서 옅게 나타날 수 l time PCRReal-time PCR(Polymerase chain reaction) 은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치로, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 target DNA의 양을 분석하는 장비이다.Real-time PCR은 PCR 증폭 산물의 확인을 위한 전기 영동이 필요 없으며, 증폭이 지수함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여보다 정확한 정량이 가능한 신속성 과 정량성이 뛰어난 방법이다. 실제로, 유전자 발현, gene copy assay, genotyping, 등에서 시료에 있는 target gene에 대한 정확한 양 측정에 이용되는 중요한 도구라고 한다.③ Nested PCRNested PCR이란 의도되지 않은 primer의 binding site의 증폭으로 인하여 product 자체가 오염되는 것을 방지하기 위하여 고안된 PCR 방법이다. 이를 위하여 1회째 산물을 희석하여 template로 사용한다. 또한 2세트의 primer가 사용되는데, 2차 primer는 첫 번째 product를 증폭하기 위한 것이다.④ Inverse PCR기존에 알고 있는 서열이 내부에 있고 양 옆으로 알지 못하는 서열이 있는 경우에 사용되는 PCR의 방법이다. 제한효소로 DNA를 자른 후에 self ligation을 시킨다. 원으로 만들어진 target DNA에 알고 있는 서열에 대한 primer를 붙인 후에 PCR을 통하여 증폭한다.⑤ Asymmetric PCRAsymmetric PCR은 original template DNA의 한 stand를 선호적으로 증폭시키는 방법이다. 즉, 단일 가닥을 얻을 목적으로 시행하는 것이다. Primer를 두 개 사용하는데, 두 primer의 농도를 100:1로 다르게 섞어 사용한다. PCR 초기에 한 쪽의 PCR 초기에 한 쪽의 primer는 소비되어 버리고 과량의 남은 primer에서 단일가닥의 DNA가 생성된다.⑥ Touchdown PCR이 방법은 PCR 실험 법이다.

자연과학| 2019.11.16| 8페이지| 1,000원| 조회(1,119)

PCR, 중합효소연쇄반응, 대장균 DNA

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