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화공기사 기출 필답형(서술, 단답) 단원별 정리 합격 족보 평가A+최고예요

화공기사 필답형(서술형, 단답형) 문제 정리유체역학※ pump1. 액체 수송시 쓰이는 대표적인 pump 3가지원심펌프, 회전펌프, 왕복펌프2. 펌프 작동시 이상현상(정의, 방지법)-수격 현상정의 : 유체가 흐르는 관의 밸브를 급격히 개폐하는 경우 관내의 유속이 급변하여 진동과 높은 충격음을 일으키는 현상방지법 : 밸브를 천천히 개폐시키고 유속을 낮춘다. 그리고 되도록 관경이 큰 배관을 사용한다.-맥동 현상정의 : 펌프에 부착된 진공계와 압력계의 지침이 흔들리고 동시에 토출 유량이 변화하는 현상방지법 : 맥동 시의 양수량 이상으로 증가시키고 회전차의 회전수를 변화시킨다. 또한 펌프 토출구 측에 공기실 또는 맥동방지기를 설치한다.-공동 현상정의 : 펌프의 흡입 압력이 액체의 증기압보다 낮은 경우 액체 속에서 기체가 ㅃㆍ져나와 공동을 이루면서 소음, 진동이 발생하고, 펌프의 작동이 정지되는 현상방지법 : 펌프의 설치 높이를 낮추어 흡입 양정을 ㅉㆍㄼ게하고 펌프의 회전 속도를 줄여 흡입비속도를 작게한다. 또한 양흡입 펌프와 2대 이상의 펌프를 사용한다.-에어바인딩정의 : 처음 원심펌프를 가동시킬 때 펌프 속에 공기에 의하여 수두의 감소가 일어나 펌프가 정지하는 현상방지법 : 운전하기 전 적당한 방법으로 액을 채워 펌프 속 공기를 뺀다. 또는 자동 유출 펌프를 사용한다.3. 펌프 설계시 고려할 사항 3가지이송하려는 액체의 성질, 액체의 유량, 펌프의 성능4. 화학공정에서 널리 쓰이는 펌프로 임펠러의 회전에 의해 유체를 밀어내는 것으로 맥동이 없고 닫는 부분이 없기 때문에 진흙과 펄프의 수송에도 가능하다. 이 펌프의 명칭은?원심펌프4. 왕복 펌프의 종류 두 가지를 쓰고 용도를 쓰시오-피스톤펌프 : 고압의 배출압력이 필요할 때 사용-격막펌프 : 적은 용량의 펌프나 약제 주입의 정량 펌프 등에 사용-플런저 펌프 : 피스톤 펌프보다 고압의 배출압력이 필요할 때 사용5. 임펠러의 회전으로 액체가 회전운동을 일으켜 액체 압력을 증가시켜 양수하는 펌프로, 고형물이 포함된 탁한 액체 상부각보다 하부각을 적게하는 이유 2가지① 압력회복을 크게 하기 위해서② 경계층의 분리를 막고 마찰이 최소가 되게 하기 위해서3. vena contracta는 무엇인지 설명유체가 넓은 유로에서 오리피스 판처럼 급격하게 작은 수문을 지날 때 유체의 단면이 유체의 관성 때문에 수문으니 단면보다 작은 단면으로 수축해서 유출하는 현상을 가리킨다.4. 차압식 유량계의 원리와 종류 3가지차압식 유량계는 유체가 흐름으로써 생기는 압력차를 측정하여 베르누이 법칙을 이용하여 유량을 계산한다. 종류로는 오리피스미터, 벤츄리미터, 피토관 유량계가 있다.5. 유량계의 원리가 무엇인지 설명1) 면적식 유량계 : 시직으로 설치된 관내에 여러 가지 형태의 플로트를 넣고 관의 아래쪽으로부터 유체를 흐르게한다. 플로트에 가해지는 유체의 힘과 플로트의 질량에 의한 중력이 균형되는 위치에서 플로트가 정지하게 되면 이 플로트의 정지 위치로부터 유량을 측정한다. 그 종류로는 로타미터가 있다.2) 용적식 유량계 : 일정 용적의 계량실을 가지며, 여기에 측정 유체를 유입하여 통과 체적을 측정한다. 대표적으로 오벌(oval) 유량계가 있다.※ 기타1. 밀도를 측정하는 기기 3가지를 쓰시오비중계, 비중병, 비중천칭2. 층류와 난류를 간단히 설명층류 : 유체가 비교적 완만한 상태이며 수평방향을 유지하는 평균화된 균일의 흐름난류 : 유체가 무질서하게 와류를 형성하며 빠르게 이동하는 흐름3. 벽난류와 자유 난류에 대해 설명벽난류 : 흐르는 유체가 고체 경계와 접촉했을 때 생성되는 난류자유난류 : 각자 다른 속도로 흐르는 두 층이 접촉했을 때 생성되는 난류4. P&ID에서 표시해야할 것 5가지관의 직경, 관의 재질, schedule number, 밸브의 위치, 펌프 및 기기의 위치5. 유체가 관속을 흐를 때 흐름의 형식이 층류와 난류 중 어느 경우일 때 마찰계수가 크겠는가?층류6. 배관이음 중 50A 이하에 사용되는 강관 이음의 명칭을 쓰시오.유니온7. 65A 이상의 관에서 쓰이는 강관 이음의 명칭플랜지8. BLA ^{2} {vec{V}} + rho {vec{g}}나비에 스토크스 방정식은 점성을 가진 유체의 운동에 대한 비선형 편미분 방정식이다.15. P&ID 와 PFD 설명P&ID : PFD보다 공정을 더 상세히 나타낸 도면으로 계측장치와 배관의 스펙까지 자세히 나나낸다.PFD :공정의 흐름을 전반적으로 파악하기 위해 작성하는 것으로 주 배관과 주요기기를 나타내고 그 흐름을 도식화 하여 간결히 나타낸다.16. 비압축성 유체의 정의유체가 흐를 때 온도와 압력의 변화에도 일정한 밀도를 유지하는 유체열전달※ 기타1. 경계층의 정의유체의 운동이 고체의 영향을 받으며 흐르는 유체의 영역※ 무차원수1. Prandtl 수를 식으로 나타내고 식에 사용된 각 변수의 의미를 쓰시오 또한,N _{pr}>1이 무엇을 의미하는지 설명하시오1) prandtl 수의 식과 식에 사용된 각 변수의 의미N _{pr} `=` {C _{p} mu } over {k} `=` {운동량`확산} over {열에너지`확산}#C _{p} `:`비열[kcal/kg` CENTIGRADE ]``` mu `:점도[kg/m`s]```k`:`열전도계수[kcal/m`s` CENTIGRADE ]2)N _{pr}>1의 의미운동량이 열에너지 보다 더 빠르게 확산됨을 의미한다.2. Biot No.와 Nusselt No.의 식과 의미1)N _{Bi} = {hL _{c}} over {k} = {대류`열전달} over {전도`열전달}h~:대류`열전달`계수#k~:`열전도`계수#L _{c} :특성길이#D``:관의`직경2)N _{NUu} = {hD} over {k} = {대류`열전달} over {전도`열전달}N _{NUu} image1이라면 대류 효과가 매우 약하거나 없다는 것을 의미한다.3. Schmidt 수는 무엇과 무엇의 비로 정의되는가?N _{Sc} = {nu} over {D} = {mu} over {rhoD} = {동점성률} over {확산계수}##nu:동점성계수#mu:점성계수#rho:유체의`밀도#D:확산계수※ 전도 대류 복사1체의 뜻흡수능이 1인 물체로 입사하는 복사선을 완전히 흡수하는 물체, 물체에 난 작은 구멍, 태양, 블랙홀 등이 흑체에 해당되며 흑체가 내는 복사를 흑체복사라고 한다.주어진 온도에서 복사능이 최대가 된다.※ 응축과 비등1. 적상 응축을 촉진시켜 전열을 좋게 할 수 있는 방법 3가지① 동관에 크롬 도금을 한다.② 벽면에 기름을 바른다.③ 증기 중에 소량의 유분을 가한다.;2. 막상응축과 적상응축에 대하여 설명하라- 막상응축 : 응축된 액이 피막상으로 벽면에 붙어 중력에 의하여 흘러내리는 응축이다. 약아 피막상으로 표면에 붙어 있으므로 점도에 영향을 많이 받으며, 전열 속도는 적상 응축의 1/10 정도이다.- 적상응축 : 액이 작은 물방울 형태로 표면에서 미끄러져 내려오는 응축이다. 표면에서 작은 열저항을 가지므로 막상 응축보다 열전달 속도가 10배 빠르다.3. 다음은 물의 비등곡선이다.A-B : 자연대류 영역B-C : 핵비등 영역C-D : 전이비등 영역D-E : 막비등 영역열효율이 제일 좋은 구간 : B-CC점 : 번아웃 점C점에서의 열유속 : 한계(임계) 열유속C점에서의 온도차 : 한계(임계) 온도차D점 : 라이덴프로스트점※ 증발1. 증발 조작시 이상현상(정의, 방지법)- 비말동반정의 : 용액의 비등시 생성되는 증기 중에 작은 액체 방울이 섞여 증기와 더불어 증발관 밖으로 배출되는 현상방지법① 침강법 : 증발관 상부에 큰 공간을 만들어 증기의 상승속도를 낮추어 비말을 침강시킨다.② 분리법 : 증기의 유로에 방해판을 설치하여 급격한 방향 변환으로 인해 비말을 분리시킨다.③ 원심 분리법 : 증기에 회전운동을 주어 원심력을 이용하여 비말을 분리시킨다.- 거품정의 : 용액에 용해고형물이나 부유물, 유지분 등의 불순물로 인해 거품이 발생하는 현상으로 이로 인해 증기와 액의 분리가 어렵고 용액이 전부 거품으로 없어지는 현상이 발생한다.방지법 : 용액에 녹아있는 불순물을 제거한다. 거품축에 수증기를 분출하여 거품을 파괴한다. 계면활성제, 실리콘 수지등을 첨가한다.- 관석정 하고 그 사이를 100등분하여 결정한다. 다음 각각의 경우에 대해 온도 scale을 결정하기 위한 고정점으로의 사용이 가능한지 여부를 쓰고 그 이류를 설명하시오- 정지된 호수에서의 물의 온도 : 불가능하다. 정지된 상태의 호수에서 물의 온도는 일정하지 않기 때문이다.- 760 mmHg 기압 하에서 드라이아이스의 기화점 : 불가능하다. 드라이아이스는 1기압 하에서 승화되기 때문이다.- 대기 중 얼음의 온도 : 불가능하다. 물과 마찬가지로 대기 중 얼음의 온도는 일정하지 않기 때문이다.- 납의 정상 녹는점 : 가능하다. 납의 정상 녹는점을 일정하기 때문이다.2. 열전대 타입별 재료를 2가지 씩 쓰시오R-(백금,로튬)J-(철.콘스탄탄)K-(크로멜,알루멜)E-(크로멜,콘스탄탄)T-(구리,콘스탄탄)3. 서로 다른 2종의 금속 또는 합금선으로 폐회로를 만들어 회로의 두 접점의 온도차로 (열전기력)을 일으키고 그 전위차를 측정하여 두 접점의 온도차를 알 수 있는 온도계는 (열전대온도계)이다.4. 가시영역 임의의 파장에 대하여 휘도를 관측하여 wien의 법칙을 사용하여 온도를 측정하는 온도계? 광고온계5. 열전대 온도계의 원리두 종류 금속의 양쪽을 접촉하면 한쪽은 높은 온도 다른 한쪽은 낮은 온도로 유지하면서 온도 차이에 의하여 기전력이 발생한다. 이 때 나타나는 기전력을 측정하여 온도를 측정한다.6. 광고온계에 대해 설명방사온도계의 한 종류로 측정물의 휘도를 표준램프의 휘도와 비교하여 wien 법칙을 사용하여 온도를 측정하는 것으로 700℃를 넘는 고온체에 주로 사용한다.물질전달※ 증류1. 공비 증류의 정의, 그 예시공비혼합물을 형성하는 제3 성분을 첨가하여 새로운 공비혼합물의 끓는점이 원 용액의 끓는점보다 충분히 낮아지도록 한 다음 증류하는 조작이다. 그 예시로는 벤젠 첨가에 의한 알코올의 탈수 증류가 있다.2. 평형증류에 대해 설명평형 증류는 플래쉬 증류라고도 하며 원액을 연속적으로 공급하여 발생 증기와 잔류액과 평형을 유지하면서 증류하는 조작이다. 원액이 연속적으로한다.

환경/안전/설비기사| 2020.07.18| 18페이지| 3,500원| 조회(459)

화공기사, 정리, 기출, 모두, 서술, 필답형, 단답, 단원별

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결과5_Liquid_culture A+ 결과레포트

결과레포트실 험 제 목 :Liqiud culture & Expression조 :학 번 :이 름 :1. Abstract이번 실험은 eGFP DNA를 포함하고 있는 유전자가 포함된 세포를 액체 배지에 배양하고 IPTG를 첨가하여 특정 유전자를 발현시켜 그것을 확인해보는 실험이었다. eGFP DNA를 포함한 배지를 shaking incubator에서 37℃로 배양한 후 세포의 수가 급격하게 증가하는 시기인 대수기에 IPTG를 넣어주었고 이 때의 O.D값이 0.6~0.8이다. IPTG를 넣어준 후에 세포 성장에 최적화된 온도인 25℃에서 shaking incubator에서 induction 해주었다. 그 후에 UV transilluminator를 이용하여 대조군(eGFP를 포함x)과 비교해보았을 때 모든 조에서 각각 eGFP DNA를 포함하고 있기 때문에 녹색 형광빛을 나타냈음을 확인하였다.2. Experiment(1) 아래 Table 1의 조성으로 LB배지를 2개를 만든 후 Autoclave로 멸균한다.주의 사항 : Autoclave는 고온, 고압에서 다루므로 주의하여 사용해야한다. 마친 후 압력이 떨어지기 전까지 뚜껑을 열지 않아야하고 Autoclave를 사용하여 멸균할 액체는 액체의 부피보다 큰 용기를 사용하여 멸균해야한다. 또한 Autoclave 중 액체가 넘쳐 흘렀다면 반드시 내부를 꼭 세척해야한다. Auto의 수증기 발생을 위한 물은 꼭 증류수를 사용하도록 한다.Table 1. LB배지 조성100ml 기준Tryptone1gYeast Extract0.5gNaCl1g(2) Clean-bench에서 60℃ 이하의 온도에서 Ampicillin (1000×)을 각각 50μl씩 넣는다.주의 사항 : Ampicillin은 온도에 민감한 β-Lactam 고리를 가지고 있어 온도에 민감한 물질이다. 따라서 60℃ 이하에서 실험을 진행해야한다. 온도가 너무 높으면 Ampicillin이 변성되어 활성이 떨어지고, 너무 낮으면 Plate를 제조할 때 배지가 굳을 가능성이 있기 때문에 적당한 온도인 60℃에서 실험을 진행해야한다.℃(3) 미리 배양된 세포(eGFP DNA 포함) 5ml을 플라스크 하나에 넣은 후, shaking incubator에서 37℃로 30분 이상 배양한다.주의 사항 : 실험은 실험결과에 영향을 미칠 수 있으므로 항상 Clean bench에서 진행하여야한다. 또한 에탄올을 사용하여 Clean bench에서 사용하는 것들을 모두 소독한다.또한, 액체 배지가 있는 플라스크의 뚜껑을 꼭 닫아 주어야한다. 뚜껑은 실리콘 재질로 되어 작은 구멍들이 뚫려있어 배양할 때에 공기가 통하게 하여 산소를 공급해주어 균이 성장할 수 있게 해준다.Figure 1. 미리 배양된 세포(eGFP DNA 포함) 플라스크에 넣는 과정Figure 2. shaking incubator에서 배양하는 과정 37℃는 E.coli가 가장 활성화 되는 온도이다.(4) 대조군을 얻기 위해 다른 액체배지 플라스크에는 미리 배양된 세포(eGFP DNA를 포함×) 5ml를 넣어준 후 Shaking incubator에서 37℃로 배양한다.(5) 약 30분이 지난 후 배양된 배지 1ml를 sampling하여 UV spectrophotometer을 통해 600nm 파장대의 흡광도를 측정한다.주의 사항 : 이 때 cuvette이 오염되지 않도록 주의한다. 또한 UV spectrophotometer의 0점을 맞추기 위해 아무것도 넣어주지 않은 LB배지를 사용한다. 600nm 파장은 세포가 얼마나 성장했는지 알 수 있는 파장이다.Figure 4. UV spectrophotometer로 측정하는 과정Figure 3. cuvette 넣는 과정(6) O.D값이 0.6~0.8사이가 되면, 각각의 플라스크에 IPTG(1000×)을 50μl 넣어준다.Figure 5. ITPG 넣어주는 과정(7) 두 개의 플라스크를 25℃의 shaking incubator에서 induction을 한다.주의 사항 : 25℃로 설정한 이유는 효소 촉매 반응이 활성화 되는 온도, 즉 세포 성장에 최적화된 온도이며, eGFP의 발현을 증가시키기 때문이다.(8) UV transilluminator를 통해 각각의 액체배지를 비교한다.3. ResultFigure 5. 실험결과LB배지에 배양된 균을 UV transilluminator를 통해 figure 5의 결과를 살펴보았을 때 모든 조에서 eGFP 유전자 발현을 했음을 알 수 있다. 또한 대조군과 비교해 보았을 때 모든 조에서 대조군과 비교하였을 때 확실하게 형광색을 발현하였는데 이것은 eGFP 유전자가 녹색형광색을 발현하기 때문이다. 따라서 모든 조에서 실험이 잘 진행되었음을 확인하였다.4. Discussion(4) Cell Growth curve- 세포 성장 곡선이란?미생물의 성장 곡선은 배양 시간의 경과에 따른 생균수 또는 총균수의 변화를 조사하여 그래프로 나타낸 것이다. 보통 회분식으로 배양되는 세균의 성장 곡선은 다음의 네 단계로 구분된다.① 유도기(lag Phase) : 미생물이 새로운 환경에 적응하는 단계로 미생물 수의 증가는 거의 없으며, 세포 구성물질, 효소, 핵상 등의 합성이 증가한다.② 대수기(exponential phase) : 세포가 기하 급수적으로 증가하는 시기로 세포의 생리 활성도 높고 최대 속도로 분열하여 미생물 수는 대수적으로 증가한다. 즉, 증식속도가 사멸속도보다 빠른 시기이며 세대시간(미생물이 한 번 분열하는데 소요되는 시간) 측정은 일반적으로 대수기에서 측정한다.? 정지기(stationary phase) : 새로운 세포의 증가 속도와 사멸 속도가 같게 되는 시기로 실질적으로 살아있는 미생물 수는 일정하다. 즉, 증식 속도와 사멸속도가 같아지는 시기 이며 이는, 영양물질의 고갈과 대사산물의 축적에 의해 증식이 저해받기 때문이다.④ 사멸기(death phase) : 영양물질의 고갈과 대사 산물의 축적이 진행되어 증식 속도보다 사멸속도가 빠른 시기이다. 즉, 살아 있는 미생물 수의 수는 감소하고 자기 용해가 일어나는 시기이다.Figure 6. Cell growth curve- 실험에서 Cell Growth curve우리 실험에서는 세포를 시험관에 키운 다음 특별한 빛 (파장 600nm)를 투과하여 나온 혼탁도 (turbidity)의 계수를 이용하여 미생물 세포 수의 그 대략적인 값을 알 수 있는 방법이 있다. 여기서 위의 Figure 6 그래프에서 세포가 기하급수적으로 증가하는 시기로 세포의 생리 활성도 높고 최대 속도로 분열하여 미생물 수는 대수적으로 증가하는 시기인 대수기에 IPTG를 넣어 주어야한다. 이 때의 O.D 값이 0.6~0.8이다.(4) Lac Operon- Operon 이란?오페론은 효소 합성에 관련된 DNA로 DNA 전사를 조절하는 것으로 알려진 일련의 유전자 군이다. 독자적인 프로모터를 가지고 있으며 억제자(repressor)를 암호화하며 항상 발현되는 조절 유전자, 프로모터 내 혹은 프로모터와 구조유전자의 사이에 위치하여 RNA 중합효소가 유전자에 접근하는 것을 조절하는 작동 유전자, RNA 중합효소가 인식하여 부착하는 DNA 서열인 프로모터, 효소의 유전정보를 암호화하고 있는 유전자인 구조 유전자들을 포함한 효소 합성에 관여하는 일련의 DNA로 구성되어 있다.조절유전자가 작동하여 억제유전자가 생성되면 그것이 작동유전자의 작동을 제어한다. 따라서 촉진유전자 및 구조유전자의 기능은 발현되지 않는다. 그러나 어떤 유도물질이 억제유전자에 작용하면 그것은 비활성화 된다. 따라서 작동유전자가 작동하고 그것이 촉진유전자에 작용하여 구조유전자의 기능이 발현되어 여러 가지 효소가 만들어진다.Figure 7. Operon- 실험에서 Lac Operon위의 Operon의 메커니즘을 설명하기에 가장 좋은 예인 lac operon으로 예를 들어보자. 우리가 실험에서 사용하는 E.coli는 보통 포도당을 섭취하며 살지만 섭취할 포도당이 없을 경우에 lactose를 섭취한다. E.coli는 lactose을 섭취하기 위해서 젖당분해효소, 젖당수송단백질, 젖당아세틸기전달효소가 필요하다. 여기서 효소와 단백질을 경우에 따라 만들 수 있도록 조절하는 것이 lac operon이다. 따라서 E.coli가 lactose의 섭취가 필요한 경우에 lac operon에 있는 억제 인자와 유도 인자가 결합함으로써 억제 인자가 operon으로부터 떨어지고 mRNA가 전사된다. 그와 반대로 lactose의 섭취가 필요 없는 경우에는 억제인자가 다시 operator와 결합하여 전사가 멈추게 된다.이번 실험에서는 이러한 메커니즘을 활용하여 E.coli에 IPTG라는 유도인자를 가했다. 이 IPTG는 억제인자와 결합함으로써 억제 인자는 비활성화 되므로 작동유전자가 작동하여 operon을 작동시키고 eGFP DNA를 전사하여 녹색형광을 발현하는 단백질을 만들게 한다. 또한 E.coli가 IPTG를 섭취하거나 분해할 수 없기 때문에 E.coli 안에서 처음 농도 그대로 남아 eGFP 유전자 발현을 계속 진행시킨다. 따라서 실험에서 녹색형광을 확실하게 확인할 수 있다.

공학/기술| 2020.07.06| 8페이지| 2,000원| 조회(165)

A+, 오페론, IPTG, 결과레포트, EGFP, 생물화학공학및실험, Liqiud ..

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예비6_Enzyme activity assay A+ 예비레포트

예비레포트실험제목 :Enzyme activity assay조 :2 조학 번 :2015114053이 름 :강예찬1. 실험 목적효소의 정의 및 효소의 활성에 대해 이해하고 생성물의 농도를 UV spectrophotometer를 이용하여 측정해 본다.2. 바탕 이론(1) 효소- 효소란?효소란 단백질의 일종으로 반응을 일으키는 촉매제 역할을 한다. 효소는 화학 촉매제의 일종이지만 몇 가지 관점에서 볼 때 차이가 있다. 화학 촉매에 의한 반응은 대부분 높은 온도와 압력, 매우 높거나 낮은 pH 상태에서 일어나지만 효소에 의한 촉매 반응은 100℃ 이하의 온도, 낮은 압력, 중성에 가까운 pH 상태에서 일어난다. 또한 효소는 화학 촉매제보다 기질과 생성물에 대한 특이성이 높다. 그러므로 효소에 의한 반응은 거의 부산물을 만들지 않는다.효소의 이름은 끝에 -ase의 접미사가 붙는다. 아밀로스(amylose)의 분 해효소인 아밀라제(amylase)와 같이 작용하는 기질 이름 위에 붙는 경우와 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)처럼 촉매가 작용하는 반응명칭 뒤에 붙는 경우가 있다.- 효소의 작용효소는 기질과 결합하여 효소-기질 복합체(enzyme-substrate complex)를 형성함으로써 반응의 활성화 에너지(activation energy)를 낮추는 촉매 역할을 한다. 어떤 물질들이 모여서 화학반응을 하려면 이 물질들이 서로 결합하거나 충돌할 만큼 에너지를 가져야 하는데, 이런 상태가 되는 데 필요한 에너지를 그 물질의 활성화 에너지라 한다. 효소는 이런 활성화 에너지를 낮추어 줌으로써 생물체 내의 화학반응을 촉진시킨다.Figure 1에서 볼 수 있듯이 효소에 의해 촉매되지 않은 반응은 활성화 에너지(Ea)가 많이 필요하지만, 효소에 의해 촉매된 반응은 활성화 에너지(Ea')가 더 적게 필요하다. 두 가지 반응 모두 반응하기 전의 에너지와 반응이 끝난 후의 에너지는 같다. 즉, 두 반응 모두 반응 전과 반응 후의 에너지 차이는 같다. 다만 효소시작하기 위해 필요한 활성화 에너지를 낮추어 줌으로써 반응이 좀더 쉽고 빨리 일어날 수 있도록 도와주는 역할을 한다.Figure 1. 효소에 의해 촉매작용을 받은 반응과 받지 않은 반응의 활성화 에너지 비교(2) 효소의 활성- 효소의 활성이란?효소에 의하여 이루어지는 촉매작용으로서, 효소 1분자에 대하여 1분간 변화한 기질의 분자수(분자활성도)로 표현한 것을 말한다. 즉, 효소의 촉매성능을 나타내는 지표이다. 효소의 순도를 나타내는 척도인 비활성 값으로 나타낸다.- 효소 활성 단위효소가 최적조건하에서, 온도는 30℃에서 1분 당 1μmol의 기질을 생성물로 변환시키는데 필요한 효소의 양을 1 단위(1 IU = 1μmol·min-1)라 한다. 또 신국제단위로서 katal(kat)도 이용되고 있으며 1 kat는 1초에 1mol의 기질을 변환하는 효소활성량을 말하며 1 kat = 6 x 107IU이다. 효소의 농도는 1㎖ 중의 효소를 단위수로 표시한다. SI 단위는 katal이지만, 단위가 너무 커서 일반적으로 사용되는 값은 효소 단위(U)이다.1U= {1 mu mol} over {1min} = {TRIANGLE C(mM)} over {TRIANGLE t(min)} TIMES V(ml)#TRIANGLE C`=`몰농도차( {mmol} over {L} = {mu mol} over {ml} )V`:`전체반응`부피TRIANGLE t`:`반응시간- 비활성여러 가지 단백질 중에서 효소를 분리하기 위해서는 효소의 비활성으로 측정하며, 혼합물에서 효소의 순도를 측정할 때 사용한다. 총 단백질 1mg 당 주어진 조건하에서 주어진 시간 내에 효소에 의해 형성된 생성물의 마이크로 몰(μmol)을 의미한다.1U/mg _{enzyme} ( {1 mu mol} over {1min BULLET mg} )= {TRIANGLE C(mM) TIMES V(ml)} over {TRIANGLE t(min) TIMES m(mg)}#TRIANGLE C`=`몰농도차( {mmol} over {L} = {mu ver {ml} )V`:`전체반응`부피TRIANGLE t`:`반응시간m`:`효소질량(2) 효소 분석- 효소 분석이란?효소가 촉매로 사용되는 화학적 변형을 관찰할 수 있게 하는 실험과정으로 모든 효소 분석법은 기질의 소비량 혹은 시간 경과에 따른 제품 생산량을 측정한다. 또한 기질과 생성물의 농도를 측정하는 여러 가지 다른 방법이 존재하여 많은 효소를 여러 가지 방법으로 분석이 가능하다. 효소분석의 종류에는 우리가 실험에서 사용할 방법인 분광 광도법을 포함하여, 형광법, 전극 방법, 극좌표 법, 크로마토그래피 법 등이 있다.- 분광 광도법단색광을 시료물질에 투사하여 그 시료가 흡수한 빛의 정도를 측정하는 방법을 분광 측정이라고 한다. 측정 장치로 분광광도계를 사용하는데 일반적으로 빛이 물체에 닿으면 그 빛은 물체의 표면에서 반사되거나 물체의 표면에서 조금 내부로 들어간 후 반사, 또는 물체에 흡수되거나 물체를 통과하는 빛으로 나누어지는데 물체에 의하여 흡수되는 빛의 양은 그 농도에 따라 다르다. 그러므로 이와 같은 빛의 흡수현상을 이용하면 시료용액 중의 빛을 흡수하는 화학물질의 양을 정량할 수 있다. 이를 시료, 또는 적당한 시약을 넣어 발색시킨 용액의 흡광도법이라고하는데 주로 자외선 및 가시광선 영역에서 빛의 흡수를 이용한다.Figure 2. 분광 광도법(3) Lambert ?Beer의 법칙Lambert-Beer의 법칙은 어떤 화합물의 용액 내를 빛이 통과할 때, 빛의 투과율, 빛이 용액을 통과하는 거리, 용액의 농도 사이에 성립하는 법칙을 말한다. 단색광에 대해서 주어진 물질의 흡광도는 농도가 일정하다면 빛이 통과한 시료 층의 길이에 비례한다는 것이 Lambert의 법칙이고 단색광에 대해서 주어진 물질의 흡광도는 빛이 통과한 거리가 일정하다면 농도에 비례한다는 것을 Beer의 법칙이라고 한다. 이 두 가지를 합친 것이 Lambert-beer 법칙이다. 식을 알아보면 용액의 두께가 d인 용액에서 입사광선의 세기를I _{0}, 투과광선의 세기를I, 투과도를 T라I} over {I _{0}} =T```` 이 식을 역수를 취하고 양변에 로그를 취하면 아래와 같다.`log( {I _{0}} over {I} )=`-logT`=`E``` 여기서 E는 흡광도이다. T는 일반적으로 % 단위로 읽어지는 일이 많다.-log` {T%} over {100} `=`E`````````````````````` THEREFORE `2-logT%=E그런데 Beer 법칙에서`E=KC(K=상수,C=용액의`농도)이다.곧 용액의 두께가 일정하면 흡광도 용액의 농도에 비례한다. 따라서 위의 식을 정리하면 아래와 같다.``2-`logT%`=`KC`즉,A(avsorbance)`=`K TIMES C`이다.위의A(avsorbance)`=`K TIMES C`의 관계를 Beer's law라고 한다. 하지만 시료의 흡광도는 위에서 설명한 시료중의 흡광 물질의 농도에 의해서만 결정되지 않는다. 즉 그림에서 보는 바와 같이 큐벳의 직경 또는 폭에 따라서 흡광도는 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성에 따라서도 달라지는데 이것을 몰 흡수계수라고 하며 ε로 표시한다. 그러므로 Beer's law는 다음과 같이 쓸 수 있다.OD(A)`=` epsilon bc`=`-ln( {I} over {I _{0}} )A`=`흡광도`,`` epsilon =`물질고유의`흡광계수,`b=`큐벳의`폭,`c=`흡광물질의`농도이번 실험에서C=` {A} over {epsilon b} 이므로 이 값을1U/mg _{enzyme} ( {1 mu mol} over {1min BULLET mg} )= {TRIANGLE C(mM) TIMES V(ml)} over {TRIANGLE t(min) TIMES m(mg)}#의 식에서TRIANGLE C에 대입하여 실험에 적용한다.Lambert-beer 법칙이 잘 맞지 않은 경우도 존재할 수 있다. 예를 들어 진한 용액에서는 용질 분자들간의 여향에 의해 몰흡광 계수가 변하며, 더 높은 경우 용질이 용매가 되고 전혀 다른 흡광계수를 가지게 된다. 또한 Lambert-b은 단일 파장의 빛에 적용되며 대부분 물질의 묽은 용액에서 잘 적용되므로 이번 실험에서는 DDW로 시료를 묽혀서 사용해야한다.Figure 3. Lambert- beer 법칙(4) Hydrolysis & Esterification- Hydrolysis가수분해를 의미하며 자연계의 화학반응 중에 물 분자가 작용하여 일어나는 분해반응의 총칭이다. 단위체들은 기존의 결합을 끊고 물 분자와 결합을 이루면서 중합체의 분리가 일어나게 되며 일반적으로 생명체 내에서는 이러한 분해과정의 촉매로 여러 가수분해효소를 사용한다.- Esterification에스터화반응은 산과 알코올이 반응하여 에스터를 형성하는 반응을 말한다. 이반응은 알코올의 수소 원자가 카복실산의 아실기로 치환되는 형태이다.Figure 4. Hydrolysis & Esterification- 실험에서 Hydrolysis & Esterification이번 실험에서 사용될 lipase는 에스터기에 수화반응을 유도하여 지방산과 글리세롤로 분해할 수 있는 효소이고, 반대 반응인 에스터화 반응에도 관여하는 효소이다. lipase에 candida antarctica lipase B(CalB) 효소를 이용하여 p-Nitrophenol의 생성을 UV로 관찰한다.3. 기구 및 시약(1) 시약- Candida antarctica lipase B(Cal-B)지방기의 에스터기에 수화반응을 유도하여 지방산과 글리세롤로 분해 할 수 있는 지방가수분해효소인 lipase의 한 종류이며 높은 선택성과 높은 촉매 활성을 가지기 때문에 향료, 계면활성제, 바이오 디젤 등 다양한 반응에서 촉매로 사용된다.Figure 5. Cal-B- p-nitrohenyl butyrate(p-NPB)NO2로 지환된 페놀성 에스테르 화합물로 이번 실험에서는 lipase 효소의 기질로서 사용한다. 또한 p-NPB는 가수분해되어 p-nitrophenol을 생성하며 노랗게 변한다. p-nPB는 눈에 자극을 일으킬 수 있으므로 조심해야하며 효소 없이도 광분해가 일어나므로 빛의한다.

공학/기술| 2020.07.06| 11페이지| 2,000원| 조회(219)

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결과레포트실 험 제 목 :PCR(Polymerase Chain Reaction)조 :학 번 :이 름 :1. Abstract이번 실험은 실험을 위해 사용할 Plasmid DNA를 제한효소를 이용하여 절단한 후 전기영동을 통해 절단된 DNA의 크기를 분석해보는 실험이었다. 제한 효소로는 XhoI, NdeI, EcoRI 3가지가 DNA를 절단하기 위해 사용되었다. 3가지 제한효소는 모두 Sticky end를 가진다.이론적으로 볼 때 1가지 제한효소를 넣은 1,2,3조에서는 8kbp에 가까운 값이 나와야하며 2가지 제한 효소를 넣은 4조에서는 EcoR I & Xho I를 넣었으므로 1.7kbp, 6.3(5.5+0.8)kbp 5조는 Eco R I & Nde I를 넣었으므로 0.8kbp, 7.2(1.7+5.5)kbp 6조의 경우에는 Xho I & Nde I를 넣었으므로 5.5kbp, 2.5(0.8+1.7)kbp의 결과가 나와야한다. 마지막으로 3가지 제한 효소를 넣은 DNA는 0.8kbp 크기에 해당되는 eGFP, 1.7kbp 크기에 해당되는 another gene, 5.5kbp 크기에 해당되는 vector 이렇게 3개로 분리되어야한다. 하지만 잘 된 실험도 있었지만 이런 이론적 결과와는 다른 값을 보이는 실험도 있었는데 이에 대한 이유를 고찰해보았다.2. Experiment(1) 아래의 레시피대로 반응용액을 만들었다. 완성된 반응용액 부피가 아주 미량이기 때문에 벽에 맺힌 용액들이 있어 피펫팅과 함께 미니 원심분리기를 이용하여 잘 섞어 주었다. 또한 우리 조는 제한 효소를 Xho I 한 가지만 넣었기 때문에 전체 20μl을 맞춰 주기 위해 DDW를 9μl 넣었주었다.주의 사항 : 이 때 시약은 아래의 표에 나와 있는 순서대로 차례로 넣었으며 아주 미량이기 때문에 피펫팅에 유의하여야 한다. 또한 이번 실험은 특히 제한 효소를 넣을 때 피펫을 최대한 계면에서 진행했다. 그 이유는 이번 실험에서는 tube에 제한 효소가 묻어있게 되면 큰 오차를 발생시킬 수도 있기 때문이다.->Enzyme)Total 20μlDDW9 μlDNA8 μl10X H buffer2 μlEnzyme1 μlFigure 1. 반응용액 제조(2) (2) 과정부터는 조교님께서 진행해 주셨다. 37℃에서 한 시간 동안 반응시킨다.(3) 전기영동기기에 Agarose gel을 넣고 TAE buffer(1×)를 gel이 잠길 때까지 채운다.(4) Loading star(6×) 2μl와 반응한 DNA 10μl를 섞은 뒤 두 번째 홈에 loading한다.(5) 대조군으로 Loading star(6×) 2μl와 반응하지 않은 DNA 10μl를 섞은 뒤 세 번째 홈에 loading한다.(6) 100V의 전압으로 1시간동안 전기영동을 진행한다.(7) Agarose gel을 꺼내 UV transilluminator를 이용한 후 Restriction이 진행된 DNA와 대조군을 비교한다.3. ResultFigure 2. 실험 결과실험을 진행할 때 1,2,3조의 경우에는 EcoR I, Xho I, Nde I 제한효소를 각각 하나씩 넣어주었다. 4조는 Eco R I & Xho I 2개, 5조는 Eco R I & Nde I 2개를 넣었고 6조의 경우에는 Xho I & Nde I 2개를 넣었다. 조교님들은 Eco R I & Xho I & Nde I를 모두 넣어 주었다. 이는 Table 2에 정리해 두었다.제한효소의 원리를 이론적으로 이해하여 생각해보면 1, 2, 3조는 전기영동 띠가 1개, 4,5,6조는 2개, 조교님이 진행한 실험은 3개가 보여야한다. 하지만 Figure 의 전기영동 결과를 보면 1,2,3조는 띠가 1개, 6조는 2개로 생각한대로 나왔지만 4조는 3개, 5조는 1개가 나와 이론값과는 벗어난 결과가 나왔다. 또한 조교님이 진행하신 실험에서는 조교 1에서는 어렴풋이 3개의 띠가 보이지만 조교 2, 조교 3은 띠가 2개 밖에 보이지 않는다.또한 DNA ladder과 실험을 마친 후에 전기영동 결과를 비교하여 보았을 때 이번 실험에서 Plasmid DNA의 크기는 본래의 크기인 5p 크기에 해당되는 eGFP, 1.7kbp 크기에 해당되는 another gene, 5.5kbp 크기에 해당되는 vector 이렇게 3개로 분리가 되어야 된다. 이를 그린 그림이 Figure 3이다.하지만 이번 실험에서는 제한 효소를 1개씩 넣은 1,2,3조는 6.0~8.0kbp의 결과가 나왔다. 제한 효소를 2개씩 넣은 4,5,6조는 각각의 결과가 달랐다. 4조는 6.0~8.0kbp, 5.0~6.0kbp, 1.6~2.0 kbp에서 띠가 나타났으며 5조는 6.0~8.0kbp에서 한 개의 띠가 나타났고 6조는 5.0~6.0kbp, 2.0~3.0kbp 두 개의 띠가 나타났다. 조교님이 진행하신 실험에 경우는 3개의 제한 효소를 넣었는데 조교 1에서는 5.0~6.0kbp, 1.6~2.0kbp, 0.5~1.0 kbp에서 띠가 나타났고 조교 2에서는 5.0~6.0kbp, 1.6~2.0 kbp에서 띠가 나타났으며 조교 3도 조교 2와 같은 결과가 나왔다. 이 결과를 Table 3에 정리해 두었다.Table 2. 각 조마다 넣은 제한 효소1조2조3조4조5조6조조교 1조교 2조교 3EcoR I√√√√√√Xho I√√√√√√Nde I√√√√√√Table 3. 각 조마다 나온 전기영동 결과1조2조3조4조5조6조조교 1조교 2조교 36.0kbp~8.0kbp√√√√√5.0kbp~6.0 kbp√√√√√2.0kbp~3.0kbp√1.6bkp~2.0kbp√√√√0.5kbp~1.0kbp√Figure 3. 제한 효소를 넣은 Plasmid vector4. Discussion(1) Star activity- Star activity 란?Star activity은 제한 효소가 그것의 최적 반응 조건하에서 상당히 다른 경우에 일어나는 것으로 효소 본래의 특정 절단 부위 외의 DNA를 절단하는 활성으로 이는 효소 매개의 DNA 절단 부위의 특이성이 완화되거나 변하는 것이다. 보통의 경우 비정상적으로 인식부위를 인식해서 DNA를 절단하기도 하고, 때때로 특이성을 완전히 잃기도 한다. '스타'란 Poli가 낮을수록 Star activity가 일어날 가능성이 높다.- 실험에서의 Star activityStar activity 유발 요인으로는 과도한 효소첨가, 낮은 salt 농도, 5% 이상의 glycerol 농도, 높은 pH, 비권장 온도, 기질DNA, 시간, 온도 등이 있다. 따라서 실험에서 Star activity를 방지할 방법을 살펴보자.가장 먼저 효소의 양이다. 실험에서 사용하는 효소의 양은 1μl로 매우 적은 양이다. 따라서 Tube에 효소를 넣어 줄 때 잘 혼합되도록 최대한 계면에서 진행하여야한다.또한 시간과 온도도 Star activity를 고려했을 때 중요한 요소이므로 37℃에서 1시간 반응을 잘 지키도록 해야 한다.마지막으로 10X H buffer(10x는 10배 농축되었단 의미이다.)를 2μl 넣어줌으로써 전체 20μl에 대해 1/10으로 희석해줌으로써 1x H buffer를 만들어 주는 것 또한 중요한 요소이다.(2) 바이러스의 방어 기작제한 효소는 특정 염기서열만을 인식하여 절단한다. 이렇게 박테리아가 제한 효소를 가지는 이유는 외부 DNA를 절단하기 위해서이며, 특히 바이러스 DNA에 대한 방어기작이다. 하지만 자신의 것도 절단할 수 있게 되는데 자신의 DNA를 절단하는 것을 보호하는 기작이 바로 메틸화이다. 메틸화 효소는 제한 효소의 자리와 인식부위가 같은데 자신의 DNA를 메틸화함으로써 외부 DNA와 식별한다. 이러한 시작을 DNA adenine methylation에 의한 메틸화 반응이라고 한다.(3) Sticky end와 Blunt end- Sticky end와 Blunt end란?제한 효소에 의해 절단된 DNA 부위는 생긴 모양에 따라 sticky end, blunt end로 나눌 수 있다. DNA를 제한 효소로 자르거나 물리적인 충격에 의해 DNA가 조각났을 때 한쪽 가닥이 다른 가닥보다 튀어 나온 경우를 sticky end라고 하고 반대로 DNA를 제한 효소 처리 시 끝에 튀어나온 부분 없이 두 가닥의 길이가 동일할 때 그 blunt end에 비해 높은 효율을 가지고 있다. blunt end는 상보적인 끈끈한 끝보다 낮은 효율로 결합하고 일반적으로 다른 DNA 단편들과는 결합하지 않는다.Figure 4. Sticky ends와 Blunt ends- 이번 실험에서의 Sticky end와 Blunt end이번 실험에서 사용한 제한효소 모두 sticky end를 형성한다. blunt end 같은 경우에는 절단된 두 DNA가 붙을 수 있기 때문에 사용하지 않는다. 아래의 그림처럼 Nde Ⅰ는 DNA 이중나선에서 CATATG 염기서열을 만날 때만 sticky end를 형성하며 Xho ⅠDNA 이중나선에서 CTCGAG 염기서열을 만날 때만 sticky end를 형성한다. 또한 EcoR Ⅰ는 DNA 이중나선에서 GAATTC 염기서열을 만날 때만 sticky end를 형성한다.Figure 5. 각각의 제한 효소의 염기서열Figure 6. Nde Ⅰ의 절단 부위Figure 5. EcoR Ⅰ의 절단 부위Figure 7. Xho Ⅰ의 전달 부위(3) 결과값 고찰- 제한 효소 1개를 넣은 실험먼저 1,2,3조의 결과를 확인해보자. 모두 8.0kbp에 가까운 값이 나왔다. 이는 한 개의 제한 효소가 각각의 Plasmid를 잘라 linear한 형태로 풀어짐에 따라 본래의 크기인 8kbp의 크기를 띄는 것을 추측하였다. miniprep 실험에서처럼 Supercolied 구조였다면 절반크기에 해당되는 값이 전기영동에서 확인이 되었을 것이다.- 제한 효소 2개를 넣은 실험두 번째로 제한효소를 2개씩 넣은 4,5,6조의 결과를 볼 때 4조는 6.0~8.0kbp, 5.0~6.0kbp, 1.6~2.0 kbp에서 띠가 나타났으며 5조는 6.0~8.0kbp에서 한 개의 띠가 나타났고 6조는 5.0~6.0kbp, 2.0~3.0kbp 두 개의 띠가 나타났다. 이론적으로 살펴볼 때 4조에서는 EcoR I & Xho I를 넣었으므로 1.7kbp, 6.3(5.5+0.8)kbp 5조는 Eco R I & Nde I를 넣었으므로 0다.

공학/기술| 2020.07.06| 8페이지| 2,000원| 조회(215)

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결과레포트실 험 제 목 :PCR(Polymerase Chain Reaction)조 :학 번 :이 름 :1. Abstract이번 실험은 PCR 과정인 DNA의 변성, Primer의 결합, DNA의 신장을 이해한 것을 바탕으로 DNA를 PCR 과정을 통해 증폭시키고 전기 영동을 통해 결과를 확인해보는 실험이었다. 이번 실험에서는 pfu master mix, Nuclease free water, Forward primer, Reverse primer, DNA template를 레시피대로 넣어 PCR mixture을 만든 후에 PCR과 전기영동 과정을 진행하였고 결과를 확인하였다. 그 결과 원래의 예상했던 결과인 2.851kbp와 다소 차이가 있는 4kbp의 결과가 나왔다. 이 값을 통해 결과 값이 나온 이유를 고찰해보았다.2. Experiment(1) 아래의 레시피대로 PCR mixture를 만들었다. 이 때 시약은 넣은 순서대로 차례로 넣었으며 아주 미량이기 때문에 피펫팅에 유의하여야 한다. 따라서 완성된 PCR mixture는 부피가 아주 미량이기 때문에 벽에 맺힌 용액들이 있어 피펫팅과 함께 미니 원심분리기를 이용하여 잘 섞어 주었다.Table 1. PCR mixture 레시피Total 50μlpfu master mix25 μlNuclease free water12.5 μlForward primer (T7)10 μlReverse primer (T7)0.5 μlDNA template2 μlFigure 1. Forward primer, Reverse primerFigure 2. PCR mixture(2) PCR Thermocycler의 온도를 아래의 표와 같이 설정하여 PCR을 진행하였다. 이때, 처음 94℃ 3min 과정은 supercoiled DNA를 풀어주기 위함이다. 꼬여있는 DNA를 풀어주지 않으면 Annealing과 중합반응에서 self-priming이 생겨 잘못된 결과가 나올 수 있기 때문이다.. 아래의 과정들부터는 조교님께서 진행하여 결과를 알려주셨다.Table 2. 진행 온도 및 시간 설정진행 온도 및 시간 설정94℃3min94℃(Denaturation)30sec52℃(Annealing)30sec72℃(Polymerization)1min x 1172℃5minFigure 4. PCR 기기Figure 3. PCR 기기 온도 설정(3) 전기영동기기에 Agarose gel을 넣고 1X TAE buffer를 잠길 때까지 채운다.(4) 1kbp DNA ladder와 6X Loading star를 섞어 첫 번째 홈에 loading한다.(5) PCR sample과 6X loading star를 섞어 두 번째 홈에 loading한다.(6) 100V의 전압으로 1시간동안 전기영동한다.(7) Agarose gel을 꺼내 UV transilluminator를 이용한 후 DNA의 크기를 확인한다.3. ResultDNA ladder과 PCR 후에 전기 영동 결과를 비교하여 보았다. 그 결과 선이 잘 보이진 않지만 미세한 선을 통해 확인해보면 약 4kbp의 크기를 나타내었다. 이는 지난번 실험인 miniprep과 비슷한 결과이다.반면에 조교님들이 따로 진행이번 실험에서 DNA가 정상적으로 복제됐다면 조교님께서 따로 진행한 결과인 Figure 2와 같이 예상한 결과인 2.851kbp가 나왔을 것이다.4. Discussion(1) PCR 과정PCR은 크게 DNA의 변성, Primer의 결합, DNA의 신장의 순으로 일어난다. 이 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 20~40회) DNA의 원하는 부분을 증폭시키는 것이 PCR의 원리이다. 원하는 부분을 제대로 증폭시켰는지 확인하기 위해서 PCR산물의 크기를 비교할 수 있는 겔 전기영동을 이용하는 것이 일반적이다. PCR 산물의 크기는 DNA ladder라 불리는 것과의 비교를 통해 대략적으로 알 수 있다.- DNA의 변성(Denaturation)먼저 DNA 변성은 92℃~95℃로 가열하여 주형 DNA(이중 가닥 DNA)를 단일가닥 DNA로 분리 시키는 과정이다. 높은 온도일수록 단일가닥 DNA로 잘 분리가 되지만 DNA 중합효소는 온도가 아주 높은 상태에서는 변성되어 사용하지 못하게 될 수 있으므로 보통 92℃~95℃로 한다. 첫 cycle에서는 DNA가 완전히 분리 될 때까지 충분한 시간을 가지며 온도를 유지하는게 좋다. 또한 열을 가하게 되면 염기 간의 결합이 수소결합이 끊어진다.- Primer의 결합(Annealing)온도를 50℃~65℃로 낮춰 primer가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖고 있는 주형 DNA 가닥에 결합하는 단계이다. 변성온도에서 프라이머가 단일 주형 DNA 가닥의 특정 위치에 수소결합을 한다. 변성온도는 이중가닥 DNA가 단일가닥 DNA로 50%정도 바뀔 때의 온도이다. 변성온도는 DNA의 길이 염기 조성에 따라 다르게 나타나며 이 값이 높을수록 강하게 결합된다는 것을 의미한다. 이번 실험에서의 변성온도는 52℃정도이다. 사용하는 두 개의 prime(reverse primer, forward primer)의 온도는 비슷해야한다. 변성 온도는 실험치를 바탕으로 한 아래와 같은 계산식을 통해 구할 수 있다.T _{m} =4 CENTIGRADE TIMES (G+C의`수)+2 CENTIGRADE TIMES (A+T의`수) ->염기서열 13 이하T _{m} =64.9 CENTIGRADE + {41(G+C의`수-16.4)} over {A+T+G+C} -> 염기서열 14~25이 과정에서 온도는 PCR에서 중요한 요인인데 그 이유는 온도가 너무 높으면 Primer와 Template DNA 간의 결합이 이루어지지 않고 분리된 상태로 남아 있으며 온도가 너무 낮으면 Primer가 상보적 부위에만 결합하는 것이 아닌 비상보적 부위에도 결합하기 때문이다.염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나는 반면에 A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G-C 결합이 A-T결합보다 강하다. 따라서 G+C 비율에 따라 결합 Primer 쌍을 이용하는 것이 바람직하다. 보통 30초가량 지속되는데 이 단계에서 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작된다.- DNA 신장(DNA extension)온도를 70℃~74℃로 다시 높여 DNA 중합효소에 의해 Primer를 연장하여 새로운 DNA 가닥을 만드는 과정이다. 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응효소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수 도 있다. 염기서열의 신장은 5’->3’ 방향을 진행된다.(2) 체 내 PCR과 실험에서의 PCR의 차이이번 실험에서 진행하는 DNA 복제는 체 내에서도 일어나는 과정이다. 이를 in vivo라고 부르며 실험실 환경에서 진행되는 복제는 in vitro라고 한다. 체내에서 일어나는 PCR과 실험에서 진행되는 PCR은 차이가 있다.in vitro는 이번 실험에서 진행되었듯이 높은 온도를 줌으로써 DNA의 변성을 일으키며 Annealing 과정에서는 DNA Primer, Polymerization 과정에서는 pfu나 taq polymerase를 이용한다.반면에 in vivo는 체내 온도인 37℃에서 DNA 변성 과정에서는 Helicase라는 DNA 분리효소를 통해 변성이 일어나며 ATP 화학에너지를 통해 이중가닥을 풀어주는 원리이며, Helicase의 종류도 다양하다. Annealing 과정에서는 RNA Primer, Polymerization 과정에서는 DNA polymerase를 이용한다. 이를 아래의 표와 같이 정리해두었다.in vitroin vivoDNA 변성열Helicasae온도94℃→52℃→72℃37℃AnnealingDNA primerRNA primerPolymerizationpfu(or taq) polymeraseDNA polymerase주기반복적인 cycle 수세포주기in vitro에서 열을 다르게 하는 이유는 각 효소에서의 활성온도가 각각 다르기 때문이다. 또한 . Annealing 과정에서는 DNA Primer, Polymerization 과정에서는 pfu나 taq polymerase를 이용한다고 했는데 이번 실험에서 taq polymerase가 아닌 pfu polymerase를 사용한 이유는 taq는 뉴클레오 타이드 사슬의 말단으로부터 하나씩 뉴클레오 타이드를 절단하는 효소인 exonulease 활성을 가지고 있지 않아 교정기능이 없기 때문에 오류를 수정할 수 없기 때문이다. 또한 95℃가 넘어가면 쉽게 불활성이 되어 오류가 일어나는 경우가 많다. pfu의 경우 taq보다 속도가 느리긴 하지만 혹, 복제 중의 올바른 염기쌍을 형성하지 못한 경우 교정 작업을 하며 열에 잘 견딜 수 있다. 따라서 더 정확한 복제가 일어날 수 있다.(3) 결과값 고찰결과 값으로 2.851kbp가 나와야하는 이유는 다음과 같다. 우리가 이번에 증폭시킨 DNA는 pET-22b(+)이다. Figure 5에서 보면 우리가 사용한 T7 promotor는 361bp-377bp, T7 terminator는 26bp-72bp이다. 하지만 이는 순수한 pET-22b(+)가 아닌 pET-22b(+) 5.5kb에 증폭시킬 부분 2.5kb를 재조합시킨 DNA이기 때문에, 26-377의 길이를 우리가 사용한 2.5kbp에 더해주어야 한다.따라서 2.5kbp+(0.377-0.026)kbp=2.851kbp이므로 우리가 원하는 결과값은 2.851kbp이다.Figure 5. pET-22b(+)하지만 이번 실험에서 정상적으로 DNA가 복제된 결과 값과 비교해 보면 4kbp로 예상한 결과값과는 차이가 컸다. 그 이유를 살펴보자.

공학/기술| 2020.07.06| 7페이지| 2,000원| 조회(330)

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