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전문분야 자연과학의/약학

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세포 독성 평가에 관한 레포트

실험 제목 : 세포 독성 평가실험 목적 : MTT, LDH assay를 통해 화학 물질의 농도에 따른 세포 독성을 평가한다.실험 과정#1. chemical treat기존에 배양된 세포(Raw 264.7 cells = mouse macrophage cells)의 medium을 제거한 후 새로운 medium으로 교체한다.plate 위에 처리하고자 하는 시료의 농도를 적고 각 농도에 해당하는 시료를 벽을 이용하여 조심스럽게 넣어줍니다.조심스럽게 플레이트를 흔들어 섞어줍니다.인큐베이터에서 24시간 동안 배양시킵니다.#2. MTT assay : 살아있는 세포의 생존률을 측정하는 시험.MTT시약 0.05 g을 혈청 medium 30 ml에 녹여줍니다.인큐베이터에서 배양시킨 배지를 꺼내 LDH 실험을 위해 세포배양액을 옆 well로 옮겨줍니다. (세포가 떨어지지 않도록 조심)각 well당 500 µl씩 시약을 넣습니다. 이 때 세포가 떨어져 나오지 않도록 천천히 시약을 분주합니다.분주가 끝난 후 인큐베이터에서 15분간 반응을 진행합니다.세포 사이에 보라색의 포마존이 형성되면 세포 상층액을 제거합니다.포마존을 녹여주기 위해 각 well당 DMSO 100 µL씩 넣어줍니다.흡광도 측정을 위해 96 well 로 옮겨줍니다.550nm (500~600nm)로 파장을 설정한 후 loading한 플레이트 영역을 지정한 후 흡광도를 측정합니다.#3. LDH assay : 죽은 세포로부터 세포 밖으로 방출되는 LDH의 양 측정MTT이전 미리 옮겨 놓은 세포배양액을 96 well plate에 50 µl씩 분주합니다.파란색 병 용액 75 µl, 빨간색 병 용액 3 ml을 섞어 LDH 용액을 제조합니다.용액을 각 well당 50 µl씩 분주합니다 (빛에 민감하므로 빛을 최소화하여 진행)인큐베이터에서 20분간 반응시킨 후 LDH 측정을 위해 450nm에서 흡광도를 측정한다.실험 결과#1. MTT assayMTT : 살아있는 세포의 생존률을 측정하는 시험. 측정값이 높을수록 살아있는 세포수가 많다.NA0.950.8730.8921 uM0.8870.840.79210 uM0.780.7540.76325 uM0.6220.6780.6850 uM0.5530.6080.601100 uM0.4670.450.427550nm에서의 흡광도값평균값 - % of control시료(uM)% of control0100192.781084.602572.935064.9010049.50시료(uM)평균값00.90510.840100.766250.66500.5871000.448% of control 값을 이용한 그래프#2. LDH assayLDH : 죽은 세포로부터 세포 밖으로 방출되는 LDH의 양 측정. 값이 작을수록 생존 세포의 수가 많다.450nm에서의 흡광도값NA0.280.2720.291 uM0.3040.290.28910 uM0.3260.3380.31625 uM0.3720.3920.38250 uM0.5050.4950.493100 uM0.5970.6670.599-평균값과 % of control평균값% of control00.2810.00010.2942.182100.3277.344250.38216.179500.49834.6461000.62154.3372000.907100.000- 평균값을 이용한 그래프-% of control을 이용한 그래프discussion: 이번 실험은 특정 시료에 대한 세포 독성 평가를 위하여 DTT, LDH 실험을 진행하였다.먼저 첫번째로 진행한 DTT실험은 24시간 인큐베이터에서 배양한 Raw 264.7 cells = mouse macrophage cells를 이용하여 진행하였으며, 이 실험은 살아있는 세포를 550nm에서 흡광을 통해 값을 측정하였다. 실험 중간에 포마존을 녹여주기 위해 DMSO라는 물질을 사용하였습니다. 총 3회의 실험 결과값을 얻었으며 이에 대한 평균값을 얻고 % of control 값을 얻은 결과 추정되는 그래프의 함수는 y = -0.4623x + 91.784를 얻었고, 이를 이용하여 세포 독성 평가를 하자면, 90.4 µl 부근에서 세포의 50%가 사망하는 농도값 (LD50)임을 알 수 있었고, 180.8 µl 존재 시 세포가 살 수 없는 환경이 만들어짐을 알 수 있었다.두번째로 진행한 LDH실험 또한 DTT실험과 마찬가지로 24시간 인큐베이터에서 배양한 Raw 264.7 cells = mouse macrophage cells를 이용하여 진행하였으며, 이 실험은 죽은 세포를 450nm에서 흡광을 통해 값을 측정하였다. 실험 과정은 세포 배양액에 LDH 시약을 넣어준 후 곧바로 형광을 측정하는 과정으로 진행하였다. 마찬가지로 총 3회의 실험 결과값을 얻었으며, 이에 대한 평균값을 얻고 % of control 값을 얻기 전에 의미있는 100%사망 농도값을 얻어야 하므로 평균값을 이용하여 추정한 함수는 y = 0.0034x + 0.2939의 값을 얻었으며, 앞서 MTT에서 얻은 100%의 사망 농도값은 180.4 µl였으므로, 이를 대입하면 이 때의 흡광도값은 0.907이다. 이를 이용하여 (0.281일 때 0%, 0.907 일 때 100%) % of control 함수값 (추세선)을 구한 결과 y = 0.4949x + 3.3795의 값을 얻었으며, 이를 이용하였을 때 세포의 50%가 사망하는 농도값(LD50)은 94.2 µl임을 알 수 있었다.두 값이 약간의 차이가 발생하였지만, 이는 LDH에 대한 정확한 100% 사망 농도를 알지 못한 채 첫번째 실험에 대한 추정값을 이용하여 구하여 좀 더 부정확한 결과값이 나오지 않았나 라는 생각을 함과 동시에, 그럼에도 불구하고 비슷한 결과값을 얻었다. (약 4%의 오차)Reference약학이론실습7 동영상 Hyperlink "https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=91571&ksr=1&FindText=LDH" https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=91571&ksr=1&FindText=LDH Hyperlink "https://m.blog.naver.com/jinp7/221093359004" https://m.blog.naver.com/jinp7/221093359004

자연과학| 2021.01.13| 5페이지| 1,000원| 조회(562)

독성학, 독성평가, 세포독성 평가

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western blot 에 관한 레포트

Western blotWestern blot 활용의 한계거짓 또는 주관적인 결과로 넘어 가기 쉽다.민감성과 특이성에 대한 발전에도 불구하고 얼룩 등의 문제점은 여전히 잘못된 결과를 만들어 낼 수 있다. 특히 항체가 의도하지 않은 단백질과 반응하게 되면 잘못된 결과가 나타나게 된다. 이것은 HIV 검사를 받는 환자가 결핵이나 기생충 감염을 경험할 때 자주 발생하여 잘못된 결과를 얻을 수 있어 치명적이게 된다. 다른 한편으로, 더 큰 단백질이 막으로 적절히 옮길 수 있는 충분한 시간이 주어지지 않으면 위음성이 쉽게 발생할 수 있습니다. 부적절한 blotting 및 처리로 인해 왜곡되거나 흐려지거나 여러 밴드가 생성되어 테스트 결과가 기술자의 해석에 의존하게 된다.고비용 및 기술적 요구 필요Western blot의 비용은 태그 항체, 숙련된 분석가 및 실험실 장비에 대한 대규모 개인 지출의 복합체이다. 섬세한 과정인 western blotting은 시료의 성분을 적절히 확인하기 위해 매 단계마다 극한의 정밀도가 필요하다. 시약 농도 또는 잠복기의 사소한 오류는 전체 공정에서 치명적인 오류를 범할 수 있다. 마지막으로, 화학 발광, 형광, 방사성 또는 레이저 검출 시스템과 같은 검출 및 이미징에 필요한 장비는 평균 미생물학 단위에 비해 비싼 편에 속하여 쉽게 실험에 접근하기 어렵게 만든다.결론각 과정에 따른 소요 시간이 많이 걸려 실험을 하는 동안 다른 실험을 하는 등 western blot에 집중하기 어려우며, 실험자의 경험에 따라 실험 결과의 큰 차이가 나타난다 또한 주관적인 결과에 의존할 수 있다. 뿐만 아니라 실험 조건 (단백질 분리, 완충액, 분리유형, 겔 농도) 차이에 따라서도 실험 결과의 큰 차이가 나타난다.Western blot 원리 및 protocolWestern blot이란 주어진 조직 추출물 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 분석 기술이다. 전기영동을 이용하여 폴리펩티드의 길이 또는 단백질의 3D 구조에 따라 천연 또는 변성 단백질을phosafe에는 4좋류의 phosphatase 억제제를 함유하고 있어 추가적인 장점을 가지고 있다.SDS의 역할 : loading 하고자 하는 단백질 sample을 SDS buffer와 섞어준다. 그렇게 되면 단백질이 풀어지며, 고유의 전하를 잃어버리고 SDS에 의해 (-)전하를 띄게 된다. 이렇게 펼쳐진 단백질은 acrylamide가 이루는 그물구조를 통과하게 된다.SDS PAGE단백질을 분자량에 따라 분리하는 단계.Polyacrylamide gel의 종류단백질의 polyacrylamide gel 전기영동에는 다양한 종류가 있다. 형태로 구분하면 Disk형, lab(수직)형, 수평형 등이 있는데 전기영동에 따라 구분해서 사용한다. 방법에서는 분자량 사이즈로 나누는 SDS polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE), 등전점으로 나누는 등전점 전기영동(IEF), 2가지 원리(예를 들어 상기의 분자량 사이즈와 등전점)를 2차원으로 전개하는 2차원 전기영동 등이 있다.SDS-PAGE에서 단백질이 분리되는 원리처음 단백질 solution은 음이온화 detergent인 SDS가 첨가된 후에 2차 구조와 non-disulfide bond에 의한 4차 구조가 denature된다. 또한 단백질의 질량에 따라 일정 비율로 각 단백질이 (-) charge를 띄게 된다. SDS가 없이는 분자량이 비슷한 다른 단백질들이 protein folding의 차이로 인해서 다르게 이동하는데, folding 방식의 차이에 따라 어떤 단백질들은 gel에서 다른 단백질보다 더 빠르게 이동할 수 있다. SDS를 첨가함으로 이러한 문제점들을 해결하고 선형으로 단백질을 만들어 분자량(1차 구조 또는 아미노산 수)의 크기에 따라 분리할 수 있게 된다.SDS가 단백질에 결합하는 비율은 대략 1.4g SDS에 1.0g 단백질이다. 이 비율은 대략 전체 질량에 비례한다. 대부분 단백질은 이에 따라 오직 단백질의 size만 gel 내 이동거리와 관련되어 gel 속을 움직이게 된다. Trac.Buffer단백질 polyacrylamide gel 전기영동에서는 Phosphate buffer나 Tris buffer가 많이 사용된다. SDS-PAGE의 Weber-Osborn법은 Phosphate buffer, Laemmli법에서는 Tris buffer계열이 사용되므로 모두 알칼리성 조건이다. Laemmli법은 gel에 Tris-HCl을, 전기영동용 buffer로 Tris-Glycine을 사용하여 Cl-과 glycinate 이온의 이동도의 차이를 이용하여 시료를 농축하고 있어 샤프한 밴드를 얻을 수 있는 장점이 있다. 따라서 전기영동용 buffer에 pH를 맞추려고 HCl을 첨가하거나 일단 사용한 전기영동용 buffer을 다시 사용하면 이온계에 이상이 발생하여 전기영동결과에 영향을 주는 경우가 있기 때문에피하는 것이 좋다. 또 조제나 희석할 경우 농도를 잘못 맞추면 전기영동 패턴이 흐트러지거나 전기영동시간이 매우 길어질 수 있다.Stacking gel과 running(resolving) gel의 역할불연속 buffer system은 이온 농도차를 만들어 전기영동의 1차 단계에서 모든 단백질이 하나의 예리한 band를 만들게 해준다. 이것은 큰 pore를 갖고 있는 gel matrix가 focusing 또는 stacking gel에서 단백질 이동을 방해하지 않기 때문이다. (-) ion이 stack 되어 있는 단백질들을 넘어서 1차 buffer를 넘어가면, 이온 농도차가 사라지고 단백질들은 일제히 resolving 구간으로 넘어가서 단백질 분리가 시작된다.Stacking gel- Large pore의 polyacrylamide gel(4%)이다. Tris buffer는 pH 6.8을 사용하며 전기영동 buffer보다 2 pH unit이 적은 값을 사용한다. 이 환경은 Kohlrausch reaction을 제공한다. 결과적으로 단백질은 몇 겹으로 뭉치게 되어 Starting zone에 19um 정도로 수분간 쌓이게 된다. 이 gel은 resolving gel펀지) gel과 membrane 사이에 기포가 형성되지 않았는지 주의한 후 단단히 고정한다. 이후 샌드위치 구조는 전기장이 작용하는 전송 buffer에 잠긴다. 이 때 음전하를 띤 단백질이 약전하를 띤 전극으로 이동하며 transfer된다.Membrane : Nitrocellulose, PVDF 2가지 유형 사용 가능하다.PVDF membrane : 메탄올에 몇 분 동안 담근 후 5분 동안 ice cold transfer buffer를 이용한다. 이 때 버퍼 내에서 몇 분 동안 평형을 유지해야 한다. 만약 평형을 유지하지 않는다면 이동 중에 gel이 줄어들 수 있다.완충액 : 20% methanol이 포함된 1X Tris-glycine을 사용한다.Transfer가 완료되었다면 air pocket 없이 균일한 전달을 보장하는 것이 좋다. 이는 Redalert western blot stain을 사용하여 쉽게 수행 가능하다.*Membrane의 종류와 장단점종류장점단점Nitrocellulose-단백질 염색이나 면역 화학적 특징화에 대한 적당한 지지 역할을 한다.-가격이 경제적이다.- 단백질의 결합력이 상대적으로 약하다.-재질이 약해서 오래 보관하기 어렵다.NylonNitrocellulose 보다 물리적으로 더 강하고, 단백질의 부착 능력이 우수하다.-back ground가 높아 원하는 단백질을 detection 하기 어렵다.polyvinylidenedifluoride (PVDF)-상대적으로 화학적 저항성과 기계적 힘에 있어서 우수하다.-단백질과의 결합력이 강하다.-Specific한 결합으로 깨끗한 band가 형성된다.-가격이 Nitrocellulose에 비해 비싸다.-Hydrophobic 하여 transfer를 하기 위해 methanol로 미리 적셔 hydrophillic 하게 변화시켜야 한다.Antibodies and accessory reagents항체를 이용하여 원하는 단백질을 확인하기 위한 단계우선 막을 차단한다. 막을 차단하게 되면 비특이적 결합을 방지할 항체나 항원의 존재를 검색하기 위해 정성적으로 이용될 수 있다. 대신 알려진 농도의 항체나 항원을 기초로 하는 표준곡선이 준비되면, 표준곡선으로부터 미지의 시료농도를 알아낼 수 있다.뿐만 아니라 단백질을 확인하는 여러 실험에서 항원 항체 반응을 통한 형광반응을 통해 확인하게 된다.응집반응 (agglutination reaction)항체(응집소)과 항원(응집원)이 서로 결합하는 반응이며 항원-항체 반응의 일종으로 볼 수 있다.이를 이용한 대표적인 확인 반응으로는 혈액형 확인 반응이 있다. 응집원 A와 응집소 α, 응집원 B와 응집소 β가 만나면 응집한다. 수혈은 적혈구를 주는 행위로, 수혈을 하면 혈액을 받는 사람의 몸속으로 응집원이 들어가게 된다. 이때 혈액을 받는 사람의 응집소와 수혈액의 응집원이 만나 응집 반응을 일으키지 않도록 해야 한다. 만약 응집 반응이 일어나면 혈관이 막혀 사망할 수 있으므로 대량의 피를 수혈할 때는 같은 혈액형에게 수혈을 해야 한다. O형은 응집원이 없으므로 누구에게나 소량 수혈할 수 있으며 AB형은 응집소가 없으므로 누구에게나 소량 수혈 받을 수 있다.세균 확인반응세균은 일종의 항원으로서 또한 항체와 반응하여 항원 항체 반응을 진행한다.세균 확인반응의 예로 살모넬라 식중독균 검출용 키트가 있다. 이는 살모넬라균이 존재할 시 살모넬라 항체와 결합하고, 이는 금입자가 포함되어 있어 금입자를 통해 살모넬라균의 유무를 판단하여 식중독에 감염된 것인지 아닌지 판단할 수 있다.이뿐만 아니라 세균에 의한 특정 질환임을 확인하기 위해서는 이러한 방법을 사용하게 된다.*referencehttps://www.antibodies-online.com/resources/17/1224/western-blotting-immunoblot-gel-electrophoresis-for-proteins/https://ko.science19.com/advantages-and-disadvantages-of-western-blot-9960 Hyperlink "https 키트

자연과학| 2021.01.13| 7페이지| 1,000원| 조회(672)

단백질 정량, Western blot, 웨스턴 블롯

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transfer, membrane staining, cutting에 관한 레포트

Transfer, Membrane staining / Cutting실험 목적: 전기영동을 통해 전개된 단백질들중 CYP2E1의 발현량을 알아본다.실험 과정#1. Transfer: running으로 전개된 단백질들을 membrane에 옮기는 과정.제대로 옮기기 위해서는 위와 같은 순서로 배열을 해주어야 단백질들이 새어나가지 않습니다.이 순서를 sandwich라고 부릅니다.◆실험도구: 전기영동장치, transfer buffer, filter paper, nitrocellulose membrane, tank, tray, sponge, cassette, 핀셋, gel 전용 칼, running이 종료된 gelTransfer buffer를 tray에 부어줍니다Cassette의 검정부분이 바닥에 닿게 tray에 넣어줍니다.검정 cassette위에 sponge를 넣어줍니다. (sponge는 transbuffer에 담긴 상태로 보관되므로 그대로 사용합니다.)Filter paper를 transfer buffer에 묻힌 후 sponge위에 올립니다.Running이 끝난 tank에서 gel만 분리합니다.Stacking gel을 제거하기 위해 gel 전용 칼로 분리를 합니다. (stacking gel은 sample을 같은 위치에서 시작하는 역할을 하므로 running에서만 필요한 부분입니다. 그러므로 transfer에서는 stacking gel을 제거합니다)gel에서 투명한 실선이 stacking과 separating의 경계입니다. 이 실선을 잘라서 버립니다.Gel은 buffer가 없고, 시간이 지체되면수축합니다. 과도한 수축은 단백질의 transfer에 영향을 미치므로 빠르게 제거합니다.Gel은 쉽게 찢어지며, 위쪽은 단백질일 전개되어 있어 건드리면 안됩니다. 찢어짐을 방지하기 위해 transfer buffer를 모든 면에 묻혀줍니다.Running이 끝난 gel을 filter paper위에 올립니다.Nitrocellulose membrane을 transfer buffer에 묻힙니다.Transfer buffer가 묻은 nitrocellulose membrane을 gel의 단백질들이 덮이도록 놓아줍니다.Filter paper를 transfer buffer에 묻힌 후 nitrocellulose membrane 위에 놓아줍니다.Gel 전용 칼을 이용해 gel과 membrane 사이에 생긴 기포를 밀어내 제거합니다. 기포가 존재하면 그 공간은 transfer가 진행되지 않습니다Filter paper 위에 sponge를 넣어줍니다.검정 cassette 내용물을 고정하면서 흰색 cassette와 합칩니다.Cassette의 검정 부분이 tank의 검정부분에 오도록 넣어줍니다. Cassette를 반대로 넣을 경우 단백질들이 유실되어 transfer가 되지 않습니다.transfer과정 중 열 방지를 위해 ice를 넣습니다tank에 transfer buffer를 가득 채웁니다.Tank의 색과 전기영동장치 색을 맞추어 조립합니다.80V로 설정합니다.Tank를 얼음이 담긴 용기에 넣어줍니다.Run을 눌러 transfer를 시작합니다Tank에서 기포가 나오는 것을 확인하고 2시간 동안 transfer를 진행합니다#2. Staining & cutting◆실험도구: Transfer가 끝난 gel, tray, amido black, pbst, 3차 증류수, 가위, 핀셋Tank의 뚜껑을 제거합니다.Tray에 3차 증류수를 부어줍니다.빈 접시에 amido black을 membrane이 잠길 수 있도록 부어줍니다.Transfer가 끝난 cassette를 tank에서 분리합니다.검정 cassette가 아래로 가도록 한 후 분리합니다Filter paper를 제거합니다.Nitrocellulose membrane을 amido black에 넣어줍니다.Transfer된 단백질들이 염색될 수 있도록 가볍게 흔들어줍니다.Amido black에 담긴 Nitrocellulose membrane을 3차증류수가 있는 tray로 옮깁니다.Nitrocellulose membrane이 3차 증류수에 잠기도록 합니다. (파란색으로 염색된 부분이 단백질입니다. Amido black은 단백질의 loading, 전개된 상태 확인 및 transfer의 상태를 확인하는 역할을 합니다.)3차증류수로 한번 더 헹궈줍니다.40~55 사이를 남겨둔다. (여기서는 70,.130, 100, 55, 40, 35 부분을 남겼습니다.) (분자량은 52kDa이므로 모든 부분이 필요하지 않습니다 따라서 일정 부분을 잘라냅니다.)Cutting이 끝난 membrane을 PBST에 넣어줍니다.세척을 위해 Membrane이 담긴 용기를 교반기로 옮깁니다. 그 후 항원-항체반응에 필요할 항체를 기재합니다.교반기를 이용해 10분동안 섞어줍니다. (60~100rpm)PBST를 버리고 다시 과정을 반복합니다. (amido black만 제거하는 과정)실험 결과Transfer 과정 중 sandwich를 역순으로 제조 시 발생하는 결과 및 원인을 설명할 것.: sandwich를 역순으로 제조 시 단백질이 전부 새어나가는 결과를 얻을 수 있습니다.원인 : 전극을 반대로 흘려주는 경우. 샌드위치를 순서대로 제조했더라도 완전히 역순으로 구성된 구조와 같게 된다.Coomassie brilliant blue와 amido black을 비교할 것Staining에는 reversible과 irreversible이 있다. Coomassie계열 염색시약은 후자에 속하며 amido black은 전자에 속합니다. Transfer가 잘되었는지 확인하기 위해 membrane을 염색한다면 reversible staining방법을 사용해야 한다.: Coomassie brilliant blue : 전기 영동 시 단백질을 눈으로 볼 수 있게 하기 위한 염색약. 단백질의 Arg, Lys, aromatic ring이 있는 아미노산 잔기들 (Tyr, Trp, Phe), His등과 결합하여 색을 나타낸다.결합 종류는 반데르발스 결합을 하며, arg에 반응하는 양이 aromatic ring을 가진 아미노산 잔기보다 8배 높다.Amido black : 전기 영동 시 단백질을 눈으로 볼 수 있게 하기 위한 염색약. 단백질을 검은색을 염색시킨다. 단백질 뿐 아니라 정전하를 가진 고분자와 결합할 수 있다. 아세트산 용액을 사용하며, 이것은 단백질 내의 염기성 아미노산의 몰수와 색소의 결합량과 좋은 상관관계를 나타낸다.Transfer가 끝난 단백질 중, 정량하고자 하는 것이 45kDa일 때의 cutting 방법을 기술할 것: 정량하고자 하는 것이 45kDa라면 45kDa위아래 포함되는 지표단백질 부위 사이를 Cutting해내어 원하는 부위만 얻어냅니다. (이 실험에서는 40과 55kDa) Hyperlink "https://biotechnology.tistory.com/34" https://biotechnology.tistory.com/34 Hyperlink "https://www.ibric.org/myboard/print.php?id=38718&Board=exp_qna&MyNavi=" https://www.ibric.org/myboard/print.php?id=38718&Board=exp_qna&MyNavi=

자연과학| 2021.01.13| 5페이지| 1,000원| 조회(130)

전기영동, 염색, staining, 운반, Transfer, Cutting, 커팅

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ROS (항산화)에 관한 레포트

항산화 평가를 위한 ROS Assay실험 제목: 항산화 평가를 위한 ROS Assay실험 과정실험에 사용한 세포 : cell line Beas B2 (사람유래 기관지 세포) 이용#1. chemical treatChemical 처리 전 medium change 선행 (기존 세포 배양액의 세포 노폐물 등을 제거하고 신선한 영양소의 배지로 바꿔주는 과정)Change 후 인큐베이터에 넣고 cell starvation 3시간 진행 (37’c with 5% CO2 Incubator)플레이트 위에 각각에 해당하는 information을 적는다케미컬 처리는 항산화 효소에 대한 Resveratrol의 영향을 가해주기 위해 Resveratrol를 10, 50, 100µmol 처리해준다. 이 때 control군과 LPS처리군에는 시료 처리한 그룹과 동일한 자극을 주기위해 시료와 동일한 volume과 medium을 처리해줍니다.Resveratrol의 항산화에 대한 영양 평가 실험이 제대로 진행되었는지 확인하기 위해 ROS의 Inhibitor인 낭(?)을 처리하여 파시토 컨트롤(?)로 사용합니다.Incubation for 6 hrResveratrol 처리 6시간 후 컨트롤 그룹을 제외한 모든 그룹의 각 well 당 LPS를 10mg/ml의 농도로 24시간 동안 처리해줍니다. 이 때 마찬가지로 control 그룹은 케미컬 처리군과 동일한 작업을 진행하기 위해 medium을 LPS volume과 동일하게 처리해줍니다.#2. ROS assay (DCFH-DA treat)LPS 처리 12시간 후 ROS를 측정하기 위해 DCFDA 2µM을 HBSS medium에 희석시켜 줍니다. (HBSS medium은 medium 제거 후 동일한 조건의 세포내 pH및 삼투압을 유지시켜 세포의 생존 및 컨디션에 대한 자극을 최소화시켜주는 medium)DCFH-DA treat의 희석이 끝났으면 플레이트의 시료가 처리된 medium을 제거하고 희석해놓은 DCFH-DA를 각 well당 2µg/ml로 처리해줍니다. 이 때 DCFH-DA는 Light sensitive한 물질로 직사광선을 피해 어두운 조건에서 실험을 진행합니다.DCFH-DA의 처리 후 incubator에서 30분 동안 세포의 안정함이 DCFH-DA의 반응을 시켜줍니다.반응이 끝난 플레이트는 Exotation값 485로, emission값 528로 fluoroscence값을 설정하여 마이크로플레이트를 이용해 흡광값을 측정합니다. 현미경을 통한 육안으로도 관찰이 가능합니다.실험 결과Fluoroscence 결과Fluoroscence 수치12345A120122124NAB257255251LPSC222220226LPS+RSV 10 μMD212216224LPS+RSV 50 μME195209210LPS+RSV 100 μMF171179186LPS+NAC 1 mM1. 형광값(엑셀파일)은 control(대조군) 대비 fold값으로 계산하여 평균값과 표준편차값을 계산하여 그래프로 그리기Fold 값123평균값표준편차값NA11110LPS2.1422.0902.0242.0850.0836LPS+RSV 10 μM1.8501.8031.8231.8250.0334LPS+RSV 50 μM1.7671.7701.8061.7810.0307LPS+RSV 100 μM1.6251.7131.6941.6770.0655LPS+NAC 1mM1.4251.4671.5001.4640.05322. Beas 2B 세포에서 LPS로 유도한 ROS에 대한 Resveratrol의 억제효과에 대한 Discussion: 이번 실험은 LPS에 의해 유도된 ROS에 대한 Resveratrol의 억제 효과에 대한 항산화 억제 assay를 진행하였다. 우선 LPS만 처리한 양성 대조군의 경우 음성 대조군에 비해 확연히 형광이 증가했다는 것을 알 수 있습니다. 여기서 형광 측정을 하기 위해 DCFH-DA 형광물질을 이용하였으며, 이것이 ROS에 의해 반응하여 DCF가 될 경우에 형광이 측정되는 원리를 이용하였습니다. 여기에 Resveratrol을 10, 50, 100 µM 농도별로 총 3번 처리하여 실험 결과를 얻었습니다. 결과적으로 Resveratrol을 처리한 경우 양성대조군에 비해 형광값이 약해졌다는 것을 확인할 수 있었으며, 농도를 증가시킴에 따라 점점 더 형광값이 약해졌다는 것을 확인할 수 있었습니다. 물론 항산화제인 NAC보다는 효과가 적다고 볼 수 있는 결과이지만, 이는 동일한 농도에서 실험하지 않았으므로, 이번 실험만으로는 판단할 수 없습니다. 실험 결과를 좀 더 해석해보면, Resveratrol을 초기 10 µM 사용했을 때에는 눈에 띄는 감소값이 보였지만, 이후 50 µM, 100 µM를 투여하였을 때는 감소량이 미미하다는 것을 볼 수 있습니다. 하지만 감소하긴 하므로, 좀 더 고농도를 투여 시 좀 더 효과를 볼 수 있을 것으로 예측됩니다. 수치가 아닌 형광 사진을 보면 조금 다르게 해석할 수 있는데, 형광사진을 봐도 결국 수치값으로 판단한 것과 동일하게, resveratrol을 이용할 경우 ROS활성이 감소한다는 것을 알 수 있고, 농도를 높일수록 강한 ROS 억제 작용을 한다는 결과를 얻을 수 있습니다. 하지만 사진상으로 봤을 때는 10 µM를 투여하였을 때의 형광 세기는 약간 감소한 반면 50 µM을 투여하였을 때 대부분의 형광이 사라졌으며, 100 µM을 투여하였을 때는 거의 대부분의 형광이 사라졌으며, NAC와 비슷한 정도의 효과를 나타낸 결과로 보여집니다.

자연과학| 2021.01.13| 3페이지| 1,000원| 조회(244)

생명공학, 산화, ROS, 항산화효소, ROS assay

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Gel making, running, staining에 관한 레포트

Gel making, Running, Gel staining실험 목표: 각 gel의 특성, 시약의 특성을 파악하고, 전기영동을 이용한 SDS PAGE를 이용하여 단백질을 분리하는 방법을 알아본다.실험 방법#1. Gel 만들기실험도구 : comb, cast, thin glass plates, glass plates유리판, cast, comb를 물과 메탄올로 차례대로 닦아 준비해줍니다.바닥이 평평한 곳에서 유리판을 cast에 끼우고, 바닥이 균일한지 확인합니다. (gel이 새지 않도록 cast를 잘 끼워줍니다.)50ml tube에 separating gel과 staking gel을 만들기D.W.를 Stacking gel과 separating gel tube에 정해진 양만큼 넣습니다.Staking gel에 0.25 Tris(pH 6.8)을 넣고, separating gel에는 0.75 Tris(pH 8.8)를 넣습니다. 30% Acrly/vis도 정해진 양으로 넣어줍니다. 10%SDS도 정해진 양으로 넣어줍니다. (SDS는 거품을 만들기 때문에 잘 저어줍니다)10% APS를 넣어줍니다.TEMED는 gel을 굳히는 촉매제이기 때문에 separating gel에만 먼저 넣어줍니다.TEMED까지 넣어준 Separating gel을 조심스레 섞어준 후 분주기의 실린더 부분을 이용해 유리판 사이 공간에 부어줍니다. (gel이 cast의 녹색선 아래까지 오도록 붓기)Gel의 양쪽 모서리 벽을 따라 D.W.를 200µL씩 천천히 흘려주어 gel을 평평하게 만듭니다.Gel과 물의 밀도 차이로 섞이지 않고, 물이 gel을 눌러주는 역할을 합니다.Gel이 굳으면 물을 털어 버리고 남은 물기를 거름종이로 제거합니다.만들어둔 staking gel에 TEMED를 넣어주고 조심스럽게 섞어줍니다.섞은 staking gel을 기포가 들어가지 않도록 유리판에 넘칠만큼 가득 채웁니다.Comb를 공기가 들어가지 않게 넣어줍니다.Staking gel이 굳는 과정 중 gel이 수축하여 기포 생기는 것을 유리판을 꺼내고 D.W. 를 이용해 유리판 겉을 닦습니다.Running buffer를 이용해 well 안의 기포를 제거하고 완성된 gel은 running buffer에 보관합니다#2. Running실험 도구 : Power supply, tank, gel, tips, running buffer, sample, ladder, 피펫Gel의 well이 안쪽으로 모이도록 electrode chamber에 끼우고, 챔버를 tank에 넣어둡니다.Running buffer를 안쪽이 넘치도록, 바깥은 절반정도 높이까지 채워줍니다.Sample buffer를 vortex하고 첫번째 well에 loading합니다.Ladder를 vortex하고 두번째 well에 loading합니다.Sample X를 vortex하고 loading합니다.Sample은 duplicate로 2개씩 loading해줍니다.남은 두 개의 well에는 sample buffer를 loading합니다. (모든 lane에 동일한 전압 걸리게 하기 위함)Tank를 돌려서 동일한 순서와 방법으로 sample들을 loading합니다.Gel이 모드 잠기도록 running buffer를 충분히 넣어줍니다.색을 맞춰 뚜껑을 닫고 평평한 그릇에 넣고 tank 주변에 얼음을 채웁니다. (running으로 인해 발생한 열에 의한 단백질 변성을 막기위함)Power supply의 전원을 켜서 100volt로 세팅하고 running을 시작합니다. (미세 거품으로 작동 확인)Sample이 이처럼 stacking gel 밑부분에 농축되어 실선으로 보일 때까지 관찰하며 running 진행합니다.이 때 pause를 누르고 150volt로 바꿔 separating gel로 넘어갑니다.보고싶은 단백질의 분자량이 gel의 중앙에 올 때까지 running시킵니다.Power supply를 꺼주고 tank를 꺼냅니다.#3. Gel 염색하기Coomassie brilliant blue stain solution 10ml를 준비합니다.Runnung된 gel을 에서 70~80rpm으로 15~20분 교반합니다.Coomassie brilliant blue stain solution을 회수합니다증류수를 gel이 잠길만큼 넣고 5분동안 교반시킵니다.증류수를 버리고 Coomassie brilliant blue stain solution을 20ml 첨가합니다.후드에 overnight 시킵니다.실험 결과52kDa부근 존재하는 띠의 존재를 통해 원하는 물질의 유무를 판단할 수 있다. (CYP2E1)A,B,C모두 52kDa 부근에서 띠가 발견되므로 포유류에서만 존재하는 CYP2E1이 존재한다는 것을 실험 결과로 증명하였다.*1. RUNNING의 원리 설명하기SDS-PAGE에서 단백질이 분리되는 원리• 처음 단백질 solution은 음이온화 detergent인 SDS가 첨가된 후에 2차 구조와 non-disulfide bond에 의한 4차 구조가 denature된다. 또한 단백질의 질량에 따라 일정 비율로 각 단백질이 (-) charge를 띄게 된다. SDS가 없이는 분자량이 비슷한 다른 단백질들이 protein folding의 차이로 인해서 다르게 이동하는데, folding 방식의 차이에 따라 어떤 단백질들은 gel에서 다른 단백질보다 더 빠르게 이동할 수 있다. SDS를 첨가함으로 이러한 문제점들을 해결하고 선형으로 단백질을 만들어 분자량(1차 구조 또는 아미노산 수)의 크기에 따라 분리할 수 있게 된다.• SDS가 단백질에 결합하는 비율은 대략 1.4g SDS에 1.0g 단백질이다. 이 비율은 대략 전체 질량에 비례한다. 대부분 단백질은 이에 따라 오직 단백질의 size만 gel 내 이동거리와 관련되어 gel 속을 움직이게 된다. Tracking dye가 단백질 solution에 첨가되어 전기영동 시에 단백질의 이동을 구분할 수 있게 된다.Denature된 단백질은 전류가 gel을 통해 흐르면 (-) charge의 단백질이 anode(+)로 이동하게 된다. Size에 따라서 각 단백질은 다르게 gel을 통과하며 작은 단백질은 쉽지나면 size 별로 이동성이 다르게 분리되어 있다. 큰 단백질은 시작점에 가까운데 반해 작은 단백질은 더 많이 이동하게 된다. 후에 Coomassie Briliant Blue나 silver stain으로 염색한다. Marker 단백질을 사용하여 각 단백질들의 크기를 측정할 수 있다.*2. Stacking gel과 Separating gel의 차이점 설명하기• 불연속 buffer system은 이온 농도차를 만들어 전기영동의 1차 단계에서 모든 단백질이 하나의 예리한 band를 만들게 해준다. 이것은 큰 pore를 갖고 있는 gel matrix가 focusing 또는 stacking gel에서 단백질 이동을 방해하지 않기 때문이다. (-) ion이 stack 되어 있는 단백질들을 넘어서 1차 buffer를 넘어가면, 이온 농도차가 사라지고 단백질들은 일제히 resolving 구간으로 넘어가서 단백질 분리가 시작된다.• Stacking gel목적: 단백질을 일정한 출발선에서 동시에 running하기 위함.Large pore의 polyacrylamide gel(4%)이다. Tris buffer는 pH 6.8을 사용하며 전기영동 buffer보다 2 pH unit이 적은 값을 사용한다. 이 환경은 Kohlrausch reaction을 제공한다. 결과적으로 단백질은 몇 겹으로 뭉치게 되어 Starting zone에 19um 정도로 수분간 쌓이게 된다. 이 gel은 resolving gel을 감싸게 된다. Stacking gel 부분은 언제나 sample의 높이와 양보다 두 배 이상 많아야 한다.• Separating gel목적 : running 과정에서 단백질이 움직이는 공간 제공작은 pore의 polyacrylamide gel(3~30%)이다. Tris buffer는 pH 8.8을 사용한다. 고분자는 이 gel 안에서 size대로 분리된다. 현재 실험에서 8% gel은 24-205kDa, 10% gel은 14-205kDa, 12% gel은 14-66kDa 단백질을 분 분자 조합이 어떤 것인가는 관련이 없다. 따라서 주어진 물질에 관한 이온 이동은 오직 solution의 전기 저항에 영향을 받는다. SDS-PAGE의 경우에는 단백질 역시 크기에 상관없이 stacking gel에서 동일하게 움직이게 되며, 이용되는 buffer들 간의 이온 이동속도는 pH 조건을 사용하여 조절할 수 있다.*3. 각각의 시약 특징◆N,N''-methylene bisacrylamide목적 : 가교제로 (일반적으로 bisacrylamide라 한다) 많이 사용되고 있으며, 또는 N,N''-bisacrylylcystamine (BAC), N,N''-diallyltartardiamine (DATD), Ethylene diacrylate (EDIA) 등도 특수한 목적으로 사용되기도 한다.◆ammonium persulfate (APS)목적 : Acrylamide의 중합.중합은 APS 또는 riboflavin의 첨가에 의해 개시된다.◆TEMED(N,N,N'',N''-tetramethylethylenediamine)목적 : Acrylamide 중합 촉매제APS를 사용하는 경우에는 촉매제로 N,N,N'',N''-tetramethylethylenediamine (TEMED)를 사용하며 TEMED는 persulfate로부터 자유라디칼의 생성을 촉매함으로써 중합을 개시한다.◆Coomassie Brilliant Blue목적 : 단백질 염색실험 결과를 눈으로 확인하기 위해 최종적으로 염색을 통한 방법을 사용할 때 이용한다. 단백질에 결합하는 특성을 가지고 있기 때문에 단백질 확인시험에서 주로 사용한다.Reference Hyperlink "http://www.dynebio.co.kr/yc/bbs/board.php?bo_table=data1&wr_id=7&page=3" http://www.dynebio.co.kr/yc/bbs/board.php?bo_table=data1&wr_id=7&page=3 Hyperlink "https://www.ibric.org/myboard/rea3762

자연과학| 2021.01.13| 5페이지| 1,000원| 조회(111)

전기영동, 염색, 러닝, gel, staining, 겔, running, 겔 만들기

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