이것저것보고서 스토어

이것저것보고서

개인인증

팔로워1 팔로우

소개

보고서 판매합니다

전문분야 논문자연과학프로그램소스

판매자 정보

학교정보

입력된 정보가 없습니다.

직장정보

입력된 정보가 없습니다.

자격증

입력된 정보가 없습니다.

판매지수

판매중 자료수

12개
전체 판매량

71개
최근 3개월 판매량

2개
자료후기 점수

평균A+
자료문의 응답률

-

전체자료 12개

판매자 표지

생명과학 보고서_SDS-PAGE & Western blot(아주대 전공실험2)

SDS-PAGE & Western blot과목명생명과학 전공실험2담 당제출일소 속학번 및 성명1. 실험목적본 실험은 SDS-PAGE를 통해 단백질을 분자량에 따라 분리시킨 후, Western blot의 항원-항체 반응을 이용하여 단백질 정량 과정과 sample 단백질에 처리한 MG132의 효과, 즉 proteasome activity를 확인하기 위해 수행되었다.2. 실험원리< Sample이 well에 load되는 모습과 분자량과 모양에 따라 분리된 모습 >모든 단백질 분리, 정제 기법은 전하, 분자량, 결합 친화도의 차이를 이용한다. 원래 당과 아미노산 같은 분자량이 낮은 물질을 분리하기 위해 고안된 chromatography는 단백질 정제에 필요한 도구이다. 다양한 Chromatography 기법은 크기, 모양, 무게, 특정 결합 친화도을 기반으로 단백질 혼합물을 분리하는 데 이용된다. 용액에 녹은 단백질 혼합물(이동상)이 고체 matrix(정지상)를 통과하면서, 이동상이 정지상과 계속 상호작용 하려하는 것으로 인해 분리가 일어난다. 전기영동(electrophoresis)은 단백질은 전하를 띄기 때문에 electric field에서 이동할 수 있음을 이용한다. 전기영동 과정에서 분자는 net charge의 차이로 인해 분리된다. 예를 들어, positive net charge를 띄는 분자는 음극을 향해 이동하고, 반대로 negative net charge를 띄면 양극을 향한다. Net charge가 없는 분자는 움직이지 않는다. 생화학에서 가장 널리 쓰이는 기법인 전기영동은 polyacrylamide나 agarose같은 gel을 사용하여 수행된다. gel-filtration chromatography에서처럼, gel은 단백질을 분자량과 모양에 따라 분리시킨다. 따라서 gel 전기영동은 복잡한 단백질 복합체를 분리하는데 매우 효과적이다. 전기영동으로 생성된 band는 다양한 방법으로 처리된다. 특정한 bands는 UV light로 시각화된 다음 잘릴 수 있고,ng system으로 구분된다. Dissociating system은 sodium dodecyl sulfate (SDS)와 같은 ionic detergent나 수소결합을 끊어주는 urea등을 단백질 시료에 첨가한 후 열을 가해 denature시킨 후 단백질복합체를 개별 단백질로 해리하여 분석하는 방법이고, non-dissociating system은 denaturation없이 단백질 복합체를 단백질의 고유한 전하에 의해서만 분리하는 방법이며 이를 흔히 Native-PAGE라고 한다. 즉, SDS-PAGE는 크기에 따른 결과를, Native-PAGE는 단백질 고유 전하에 따른 결과를 얻을 수 있는 것이다.< Polymerization of acrylamide gel >Polyacrylamide gel은 acrylamide와 N,N’-methylene bis-acrylamide를 사용하여 합성된다. Acrylamide는 중합에 의해 polymer 사슬을 셍성하고 bis-acrylamide는 acrylamide chain을 형성하는 과정에서, acrylamide의 free radical을 발생시키기 위해 ammonium persulfate를 가하고 촉매로서 TEMED를 첨가한다. 여기에 직류전압을 공급하면 단백질 시료와 액 중의 glycine이온은 stacking gel에서 separating gel로 이동한다. Gel 속의 염소이온은 pH에 의존하지 않고 이동이 자유롭지만, glycine이온은 stacking gel의 pH 6.7에서 전하량이 작으므로 단백질 시료보다 이동도가 매우 작다. 따라서 단백질 분자들은 net charge, 크기, 모양 등의 요인에 의해 이동속도가 달라져 분리된다.널리 이용되는 SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)는 분자량을 알아내기 위해 사용될 수 있는 전기영동 기법의 variation이다. SDS는 끝에 sulfate가 붙어 있어 음전하를 띄는 detergent로, 단백질 분자의 소수는 2차 항체를 1차 항체에 결합시킨다. 이때 일반적으로 2차 항체에는 이 항체를 쉽게 검출할 수 있도록 하기 위해 horseradish peroxidase(HRP)나 alkaline phosphatase(AP)와 같은 효소가 결합되어 있다. HRP가 결합된 경우, HRP는 과산화수소를 분해하여 radical을 생성하고 이것이 루미놀 반응을 통해 발광하므로 chemiluminescence 반응을 통한 검출이 가능하다.마지막으로, 실험과정에서 쓰인 약품 및 재료가 왜 사용되었는지 알아보겠다. SDS-PAGE의 Gel 제작과정에서 트리스(히드록시메틸)아미노메테인는 전기영동에 쓰이는 일반적인 완충제인 TAE 혹은 TBE의 요소로, 완충역할을 수행한다. Western blot과정에서 사용되는, 친수성을 띄는 Nitrocellulose는 단백질과 소수성 작용에 의하여 결합하고 PVDF 필터보다 훨씬 싸지만 매우 약하여 찢어지기 쉽다. 그에 반해 PVDF membrane은 소수성을 띄고, 그로 인해 한번 붙은 protein이 반영구적으로 붙어있을 수 있다. 이번 실험에서는 Nitrocellulose를 사용하였다. Nitrocellulose 사용 전 Methanol이 사용되는 이유는, (1) 단백질의 소수성 아미노산이 membrane에 interaction할 수 있도록 결합가능한 형태로 바꾸어 주기 위해, (2) 단백질에 처리된 SDS coating의 방해를 줄이기 위해 SDS와 경쟁하여 protein의 membrane binding을 돕기 위함으로 볼 수 있다. 단백질과 항체를 결합하기 전에 먼저 membrane을 skim milk로 전 처리하는 이유는, skim milk에 있는 단백질이 membrane에 골고루 결합하여 항체가 불필요한 부위에 결합하는 것을 blocking하기 위함이다.3. 실험재료 및 방법가. 준비물40% acrylamide , 1.5M Tris-HCl, 증류수, gel틀, Temed, SDS, methanol, 스펀지, 0.5M Tris-HCl, cassette를 잠그고, tank에 transfer 기기를 색깔 방향에 맞게 넣어준다. Transfer buffer를 안쪽부터 분주한 후 rid를 색깔 방향에 맞게 덮고 전원을 공급하여 진행하였다.1. skim milk로 만든 blocking buffer를 준비된 통에 붓고, transfer가 된 membrane이 건조되지 않도록 주의하며 blocking buffer에 담갔다.2. washing한 후 1차 항체를 ubiquitin과 tubulin으로 나누어 넣고 2차 항체까지 넣었다.4. 실험결과MG132가 처리되지 않은 세포와 MG132가 처리된 세포로부터 얻은 sample 단백질이 SDS-PAGE, Western blot을 겪어 chemiluminescence 반응하고 있는 모습이다.5. 실험고찰SDS-PAGE를 통해 단백질 sample이 분자량에 따라 분리되었고, Western blot에서 ubiquitin과 tubulin을 target으로 하는 1차 항체와 그에 특이적으로 결합하는 2차 항체의 chemiluminescence 반응을 통해 단백질을 검출하였다. 그 결과, ubiquitin을 target으로 했을 때 MG132를 처리한 세포의 sample 단백질은 아무것도 처리하지 않은 세포의 sample보다 band가 더 짙은 모습을 나타냈고, tubulin band의 굵기, 짙음은 모두 동일한 결과를 얻었다.우선, MG132를 처리한 세포의 sample 단백질 band가 더 짙게 나타난 결과를 해석해보겠다. MG132는 이전 proteasome activity 실험에서 다뤘듯, proteasome 활성 저해제로서 ubiquitin이 달린 비정상 단백질 분해를 저해한다. 즉, 세포 내에 ubiquitin이 달린 비정상 단백질이 축적되어 있기 때문에, 정상적으로 proteasome이 비정상 단백질을 분해하던 sample 보다 더 많은 ubiquitinated unfolded protein을 갖고 있어서 더 짙은 band가 나타난 것으로 생각된다. 반대로, 으로 선형화된 단백질은 Acrylamide가 이루는 그물구조를 통과하게 된다. 따라서 크기가 큰 단백질일수록 그 길이가 길어 그물구조를 빠져 나오는데 시간이 오래 걸리기 때문에 이동속도가 느려지게 되고, 이 원리를 이용해 단백질이 분리하기 위해 이 실험에서 SDS를 사용하였다.실험에서 Transfer를 진행할 때, Transfer cassette를 하얀색이 아래로 오도록 둔 후, “스펀지 -> paper -> membrane -> gel -> paper -> cassette” 순서로 진행하였다. 이 순서를 지켜야하는 특별한 이유에 대해 생각해보았다. SDS를 이용해 단백질을 음전하로 바꾸어 놓았기 때문에 gel 내의 단백질들은 +극으로 이동하려고 하는 경향을 띤다. 단백질을 membrane으로 옮기기 위해서는 membrane을 +극 쪽으로 두어야 한다. cassette의 하얀색은 +극과 연결되는 부위이기 때문에 membrane을, 검정색은 -극과 연결되는 부위이기 때문에 gel을 위치시킨다.Skim milk를 이용해 Blocking을 진행하는 이유에 대해 생각해보았다. membrane은 단백질이 잘 들러붙는 성질 때문에 단백질에 결합하는 항체도 잘 들러붙는다. 따라서 membrane 과 target 단백질을 검출해 내는 데 사용하는 항체, 혹시 모를 불순물의 결합을 막기 위해 blocking을 진행하는 것이다. 이를 막기 위해서 Skim milk를 사용하는데, skim milk 속의 단백질이 transfer된 단백질이 붙어 있지 않은 membrane의 빈 공간에 결합해 western Blot을 진행할 때, 항체가 transfer된 단백질이 아닌 다른 외적인 요소들과 결합하지 못하도록 하는데 이유가 있다.본 실험에서는 MG132를 처리한 세포와 그렇지 않은 세포로부터 얻은 단백질 sample을 SDS-PAGE로 분자량에 따라 분리하고, Western blot을 통해 분리된 단백질을 targeting하여 발광시킴으로써 그 양을 band의 명도를 통해 시각적으로 알1-4

자연과학| 2023.09.13| 10페이지| 1,500원| 조회(357)

생물학, 생명과학, 단백질정량, 전공실험, westernblot, SDSPAGE, MG132

미리보기

닫기
판매자 표지

생명과학보고서_Primary Cell Culture & Sub culture(아주대 전공실험2)

Primary cell culture & Sub culture과목명생명과학 전공실험2담 당제출일소 속학번 및 성명[1] 실험 목적- primary cell culture의 원리를 이해하고, 쥐의 간세포를 이용해 primary cell culture를 진행해본다.- Sub culture의 방법을 익힌다.[2] 실험 원리primary cell culture는 불멸화 된 세포주와는 반대로 다세포 유기체에서 갓 얻은 세포의 생체 외 배양이다. 생물체로부터 분리한 세포, 조직 및 기관을 재료로 하여 직접 배양하는 것을 말하며, 첫번째 sub culture 전 단계까지를 의미한다. 조직으로부터 가장 처음 배양된 세포를 1차 배양 세포라고 하며, 생체 내와 가장 유사한 형태를 보이고, 제한된 수명을 가지고 있다. 일반적으로 primary cell culture은 세포주보다 생체 내 조직을 더 대표하는 것으로 간주한다. 이 배양에 사용되는 세포는 조직이나 기관으로부터 떼어내거나 화학적으로 분해를 하거나 하여 얻는다. 이 세포들을 적절한 배지가 들어있는 유리 용기나 플라스틱 용기에 옮겨서 자라도록 한다. 이렇게 키우면 세포의 성장속도는 보통 낮고 이질적인 경우가 많다. 또한 바이러스나 박테리아의 의한 잠재적인 오염도 치명적인 단점이다. 그럼에도 불구하고 이 세포들은 여전히 세포주에 비해 선호되는데 그 이유는 세포주에 비해 그 조직에 있는 세포 형태들을 잘 대표하기 때문이다. 그리고 윤리적인 측면에서도 자유롭다. 1차 세포 배양에서 세포의 형태적 구조는 몇몇 유형이 있다.① 상피(epithelium) 유형이들은 다각형 형태이고 편평하게 보인다. 그 이유는 세포들이 기판에 부착해서 연속된 얇은 층을 형성하기 때문이다.② 에피테로이드(epitheloid) 유형이들은 둥근 외형을 가지며 상피 유형과 달리 기판에 부착하지 않고 얇은 층을 형성하지도 않는다.③ 섬유아세포(fibroblast) 유형이들은 각이 져 있고 길쭉한 형태로 단단하게 패킹된 세포가 아니라 그물망처럼 네트워크를 형성, 양분을 저장하며, 쓸개즙, 요소 등을 생성한다. 간은 모든 내장 기관 중 가장 크다. 간은 물질대사에서 주요 역할을 담당하며, 글리코겐의 저장, 적혈구의 분해, 혈청 단백질의 합성, 호르몬 생산, 해독작용 등 기타 여러 역할을 한다. 간은 배에서 복부-골반 부분의 횡격막 아래에 놓여 있다. 간은 지질의 유화로 소화를 돕는 알칼리성의 혼합물인 담즙을 생산한다. 간의 고도로 전문화된 조직들은 작고 복잡한 분자들의 합성과 분해와 같은 매우 다양한 대량의 생화학적 작용을 조절하며, 이들은 평상시의 주요 기능을 위해 필요하다.간은 간 상부 하대정맥과담낭을 잇는 가상의 선을 기준으로 우엽과 좌엽으로 나뉘어 지며, 더욱 세밀하게 8개의 분절로 구성되어 있다. 간으로 유입되는 혈류는 간동맥과 간문맥을 통하여 유입되며, 간동맥은 심장에서부터 산소가 많은 혈액을 간에 공급하고 간문맥은장관에 흡수된 영양분이 많은 혈액을 간에 공급한다. 간에서 배출되는 혈류는간정맥을 통하여 심장으로 배출된다. 담관은 간에서 만들어진 담즙을 간내 담관을 통해서 담낭에 저장하고 필요에 따라서 총수담관을 통해서 십이지장에 배출한다.1. 탄수화물 대사간은 문맥을 통해 유입된 포도당이나 아미노산, 글리세린, 유산 등을 글리코겐(glycogen) 형태로 저장한다. 글리코겐은 신체 내에서 필요시 포도당으로 다시 전환되어 혈당을 유지하고, 여기에서 유도된 포도당은 연소되어 생체 활동에 필요한 에너지를 발생시킨다. 이렇듯 간이 탄수화물 대사에서 중요한 역할을 담당하기 때문에 만성 간질환 환자에서는 혈당이 잘 조절되지 않을 수 있다.2. 아미노산 및 단백질 대사식사 후 단백질은 아미노산의 형태로 분해되어 간문맥을 통하여 간에 도달하며 흡수된 아미노산은 새로운 혈청 단백질, 호르몬 등의 합성에 이용되며 아미노기 전이 과정을 거쳐 포도당 신생 과정에 이용되어 에너지원으로도 사용된다. 간에서는 하루에 약 50g의 단백질이 합성되며 면역글로불린을 제외한 거의 모든 단백질이 간에서 합성된다. 간에서만 생성되는 단백질인 간은 철, 구리, 아연 등을 저장할 수 있다.6. 호르몬 대사간은 각종 장기에서 생성되는 호르몬을 분해하는 기능이 있어 간기능 저하가 발생할 경우 호르몬 대사 장애가 발생할 수 있다. 예를 들어 만성 간염이나 간경변증에서는 성호르몬인 에스트로겐이나 테스토스테론의 대사가 저하되어 여성의 경우 생리 이상이, 남성의 경우 고환 위축이나 여성유방증 등이 나타날 수 있다.7. 해독작용간은 신체 내에서 합성되거나 외부로부터 유입되는 각종 지용성 물질을 수용성으로 변환하여 쓸개즙이나 소변을 통해 배설하는 해독작용을 담당한다.8. 살균작용간에서 생성되는 보체는 살균작용에 중요한 역할을 하며 따라서 간의 단백 합성능력이 저하되면 보체 농도가 감소하여 살균 기능이 떨어지게 된다. 간의 별큰포식세포는 간에 존재하는 대식세포의 일종으로 체내에 들어오는 세균과 바이러스 등을 포식하여 제거하는 역할을 한다. 또한 항체인 감마 글로불린을 생성하는 역할도 담당한다.cell culture에서, confluence는 adherent cell에 의해 덮인 dish의 표면적 비율을 의미한다. 예를 들어 50% confluence는 표면의 절반가량 덮여 있다는 것이고, 100% confluence는 표면이 다 덮여 더 이상 세포가 monolayer로 자랄 공간이 없다는 것을 의미한다. 세포를 seeding할 때는 70~80% confluence를 갖도록 seeding해주도록 한다. 70~80% confluence가 넘어가면 세포가 자랄 공간이 부족하므로 더 큰 dish로 옮겨주어 넓은 공간을 제공하는 sub culture를 진행한다. 덧붙여서, media에는 pH 지시약으로서 페놀레드가 첨가되는데, 세포의 대사산물로 인해 media의 색변화가 관찰된다면 media change를 진행한다.마지막으로, 본 실험에서 사용된 시약의 사용 목적에 대해 알아보겠다. Trypsin은 protease로서 위에서 다뤘듯 배양할 때 단세포로 분리하고, adherent cell을 surface에서 떼어 내기 위해 사, 피막을 걷어낸다.2. 쥐의 간 바로 아래에 있는 혈관에 PBS를 주입하여 간 내의 혈액을 빼낸다.3. 쥐에서 간을 추출하여 페트리접시에 옮긴다.4. 핀셋을 이용해 간을 잘게 쪼갠다.5. 0.01% collagenase을 이용하여 간을 10분동안 소화시킨다.6. tube에 70um mesh 거치하고 간 찌꺼기들을 걸러낸다.7. 걸러낸 tube를 4℃, 50 xg, 2min 조건으로 원심분리한다.8. 상층액을 suction한다.9. CM4ml 를 더하고 다시 suction한다.10. 더 순수한 간세포를 얻어내기 위해 과정 6번~8번을 반복한다.11. 새로운 60pi dish로 교체한다.12. 37℃, 5% CO2 조건에서 incubate 한다.< Sub culture >1. media를 suction하고, DPBS를 이용해 washing한다.2. Trypsin-EDTA를 넣고, CO₂ incubator에서 2분간 기다린다.3. 새 media를 tube에 주입하며 cell을 떨어뜨리고, 1300rpm에 5분 간 원심분리한 후, 상층액을 suction한다.4. media를 넣고 잘 풀어준 뒤, Trypsin Blue : cell = 1:1로 섞은 뒤, 혈구계수기에 떨어뜨려 계수한다.5. cell이 안정화 된 후, media를 suction 해준다.[4] 실험 결과[5] 실험 고찰primary cell culture은 많은 실험에서 이용되고 있으며, 그에 따른 장점과 단점이 모두 존재한다. primary cell culture은 생체 내 연구를 위한 최고의 실험 모델이다. 왜냐하면 그들은 부모와 같은 핵형을 공유하고 배양한 세포에서는 볼 수 없는 특성을 나타내기 때문이다. 즉, 생체 내와 가장 유사한 형태를 보이기 때문에 생체 내에서 수행할 수 없던 인체조직에 대한 실험이 가능하다. 그러나 단점 또한 존재하는데 primary cell culture은 구하기가 어렵고 세포의 수명이 제한 되어있어 장기간 실험 하기에는 문제가 있다. 또한 바이러스나 박테리아의 의한 잠재를 주입했다. 그 뒤 이 간 조직을 배양한 후, H&E 염색방법으로 염색을 시행하였다. 정상군과 DMN을 처리한 군 RIP를 처리한 군을 비교한 결과, 정상군에서는 혈관들이 잘 발달되어있는 것을 볼 수 있었고, DMN군에서는 문맥구역 부위에서 각각의 구조물을 구별할 수 없을 정도로 심한 간의 파괴가 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 RIP로 치료한 군에서는 다시 중심정맥을 향한 간세포줄이 나타나기 시작했으며 문맥주변부로 판단되는 부분들도 모습을 보였다.위 실험은 한방이나 대체요법의 천연물로부터의 간치료제는 오랜 세월 임상적인 효력이 어느 정도 확보되어 있다는 점에서 그 약효 및 부작용 등에 대해 깊이 있는 연구가 진행될 경우에 치료제로서의 활용이 충분히 가능하다는 점을 시사한다.사람의 hepatocyte cell을 이용하지 않고 mouse를 이용하는 이유에 대해 생각해 본 결과, mouse는 한 번에 최소 10마리 이상의 새끼를 낳으며, 임신기간도 매우 짧아 다음 세대로의 연구가 편리하기 때문일 것이다. 뿐만 아니라 사람의 세포를 이용하는 경우는 윤리적인 문제가 발생할 수 있기 때문이다. mouse hepatocyte cell을 primary cell culture함으로써 인간에게 직접적으로 생체 내에서 실험할 수 없었던 것들을 빠르고 간편하게 실험할 수 있다. Mouse Hepatocyte cell culture을 이용한 실험을 통해 질병이 생기는, 또는 분화가 일어나는 메커니즘을 파악할 수 있으며, 이는 암 연구, 바이러스 연구, 약물 독성 테스트, 줄기세포 치료 등 다양한 방면에 이용할 수 있다고 생각한다.[6] 참고 문헌1) 강신성 외 11인 역. (2017). Vander’s 인체생리학 제14판. ㈜라이프사이언스. pp.164-1692) Gagnieur, L., Cheval, J., Gratigny, M., Hébert, C., Muth, E., Dumarest, M., & Eloit, M. (2014). Unbiased analysis by

자연과학| 2023.09.13| 9페이지| 1,500원| 조회(199)

생물학, 아주대, 전공실험, subculture, PrimaryCellCultu..

미리보기

닫기
판매자 표지

생명과학보고서_Immunostaining (아주대전공실험2)

Immunostaining과목명생명과학 전공실험2담 당제출일소 속학번 및 성명1. 실험목적본 실험은 cell culture를 통해 세포를 배양하여 counting해보고 적정 confluence에 맞춰 immunostaining을 통해 세포의 상태를 시각적으로 직접 관찰해보기 위해 수행되었다. 2. 실험원리Cell culture란 다세포 생물체로부터 분리한 세포를 protease 등의 처리로 단세포로 분리하여 배양하는 과정이다. 우선 생체조직을 무균적으로 선발하여 trypsin 등의 소화효소로 처리한 후 단세포로 분리하여 초대배양을 한다. 또 계대 중인 세포계나 세포주를 같은 효소처리로 분산시켜 얻어낸 단세포를 증식배지에 이식, 접종하여 다음의 계대배양을 한다. Culture condition은 세포 type에 따라 매우 다양하지만 기본 환경은 필수 영양소(탄수화물, 아미노산, 비타민), serum(호르몬, growth factor), 가스(산소, 이산화탄소)를 공급하고 물리화학적 환경(pH, 온도)이 조절되어야 한다. pH 지시약으로서 media에 첨가되는 페놀레드는 pH 6.8~8.4 변색역을 가지며 산성색은 황색, 염기성색은 적색이다. 세포배양에서 세포를 키우는 기본 시스템이 두가지 있다. 대부분의 세포는 solid or semi-solid substrate에 부착된 상태로 배양(adherent culture)되어야 하지만 일부는 media에 부유한 상태로 배양(suspension culture)될 수 있다. 표 1을 참고하면 각 방법이 적절하고 활용되는 실험은 각기 다름을 알 수 있다. Adherent culture에서는 세포가 surface에서 떼어져야 하는데, 그 방법으로는 흔들거나 긁어내는 기계적 방법과 trypsin과 같은 효소를 이용하는 방법이 있다. 표 2를 보면, 세포의 종류, 부착 강도에 따라 방법을 선택하면 됨을 알 수 있다. culture후에는 실험에서 관찰하고자 하는 변화에 따라 treatment를 진행하여 세포 대사 변화, 표현형 변 Immortalized cell은 생화학, 동물세포생물학 연구에서 복잡한 생물 시스템의 모델을 결정하는 데에 유용하게 쓰인다. (1) 세포가 항상성을 지니며 죽지 않기 때문에 생물학적 분석이 유용하고, (2) 증식을 통해 발생된 자손들이 동일한 유전 정보를 지니기 때문에 높은 재현성에 따른 신뢰를 요구하는 과학적 연구에 적합하다는 것이 장점이다. 생명공학 분야에서 immortalized cell은 저비용으로 다양한 목적에 활용되는데, 가령 독성 물질을 테스트하거나 진핵생물에서 의학용 단백질을 대량으로 뽑는 데에 사용된다. 혈구 계수기는 혈구수 또는 그 밖의 입자수를 측정하는 계량기이다. 그림 1(좌)에서 알수 있듯, 깊이 0.1mm, 1mm2 구획 9개로 구성되어 있고 1mm2 한 칸의 volume은 10-4ml이다. 따라서 count한 세포 수의 계산은 sample 1ml당 1mm2 한 칸에 든 평균 세포 수에 104를 곱한 것만큼 있다고 생각하면 된다. cell culture에서, confluence는 adherent cell에 의해 덮인 dish의 표면적 비율을 의미한다. 예를 들어 사진과 같이, 50% confluence는 표면의 절반가량 덮여 있다는 것이고, 100% confluence는 표면이 다 덮여 더 이상 세포가 monolayer로 자랄 공간이 없다는 것을 의미한다. 세포를 seeding할 때는 70~80% confluence를 갖도록 seeding해주도록 한다.Immunocytochemistry는 특이성을 지닌 1차 항체를 사용하여 세포에 있는 특정 단백질이나 antigen의 위치를 해부학적으로 시각화하는 실험 기법이다. 항원-항체 반응을 이용하여서 매우 specific하고 실제 위치를 시각화할 수 있다는 장점을 가진다. 1차 항체는 형광물질을 가진 2차 항체에 결합할 때 형광 현미경에서 단백질을 시각화한다. 이 방법으로 특정 항원이 대조군과 비교하여 실험군에 존재하는 여부를 알 수 있다. 더 나아가서 세포 내 어떤 특정 부분에 그 항원이 광원의 강한 빛과 시료에서 방출되는 약한 형광을 효과적으로 분리할 수 있다.형광염색에는 3가지 방법이 있다. 첫번째로, 관찰하고자 하는 물질(항원)에 직접 반응하여 형광을 내는 것이다. Ion fluorescence indicator는 Ca2+, H+와 같은 ion에 직접 반응하여 형광을 냄으로써 Ca2+가 관여하는 G-protein signaling 과정, H+가 나타내는 pH변화를 보여준다. Mito tracker는 미토콘드리아의 상태, 더 나아가 apoptosis를 알 수 있다. Apoptosis의 초기 단계 특징은 미토콘드리아의 malfunction이다. 이는 막 potential 변화, 건강한 미토콘드리아의 특징 변화, 산화-환원 potential alterations을 포함한다.두번째, 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP)은 238개 아미노산으로 이루어진 단백질로서 어떠한 보조인자의 도움 없이도 스스로 형광을 일으킨다. 즉 자외선을 조사하면 그 자체가 녹색(510nm)혹은 청색(395nm)의 형광을 발생한다. 그러므로 GFP 유전자를 이용하면 유전자의 세포내 전달 및 발현 효율성을 추적, 관찰할 수 있다.세번째, 특이적 항체 결합을 이용한 면역형광법(면역염색법)이다. 면역형광법에는 직접법과 간접법이 있는데, 직접법은 특이적 항원에 직접 표식하여 그 표식한 항원을 검출하는 것으로 특정 단백질의 존재를 밝히는 방법인 반면, 간접법은 특이적 항체(1차 항체)를 항원으로 인식하는 항체(2차 항체)를 표식하고, 그 표식을 검출하는 것으로 특정 단백질의 존재를 밝히는 방법이다. HRP등의 효소를 이용하는 효소항체법, fluorescein(녹색형광)이나 rhodamine(적색형광) 등을 이용하는 형광항체법, biotin을 이용하는 ABC법, 금 이온을 이용하는 Gold Collide법과 같은 간접법이 직접법에 비해 형광량이 증대되어 검출감도도 좋고 응용범위도 넓다.마지막으로, 본 실험에서 사용된 시약의 사용 목적에 대해 알아보겠정효과는 조직단백질과 methylene bridge를 형성하는 단백질과의 반응에 의해 이루어지며 항원결정부의 인식을 저해하지 않으므로 대부분의 면역형광법에서 가장 좋은 고정액이다. Triton X-100은 친수성 폴리에틸렌 옥사이드 사슬과 방향족 탄화수소 친유성 또는 소수성 그룹을 갖는 비이온성 계면 활성제로, 세포막 permeabilization을 위해 사용된다. BSA는 small, stable, moderately non-reactive protein이기 때문에 면역화학염색(immunohistochemistry)에서 non-specific 염색을 방지하기 위한 blocker로써 사용된다.DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)는 DNA의 A-T rich region에 붙는 형광염색물질이고, dsDNA에 붙었을 때 461nm(청색)에서 최대 발광하는 것을 통해 dsDNA를 labeling한다. Rhodamine-phalloidin은 phalloidin이 cytoskeleton 중 actin filament의 F-actin에 특이적으로 결합할 때 rhodamine의 derivative인 TRITC가 580nm(주황색)에서 발광하는 것을 이용한 것으로, actin filament을 labeling하는 데 사용된다.3. 실험재료 및 방법가. 준비물Media, DPBS, Trypsin-EDTA, FBS, Hemocytometer, Microscopy, Cover glass, Micro pipette, Paraformaldehyde, Triton X-100, BSA, Rhodamine-phalloidin, DAPI나. 방법1. 오래된 media를 제거한 후 DPBS 3ml로 washing하고 suction했다.2. Trypsin-EDTA solution 500㎕를 넣고 37℃에서 3분동안 incubation했다.3. 10% FBS를 포함하는 complete media 500㎕를 넣고 2000rpm, 3min, room temperature 하였다.3. 2번 과정을 suction한 후 세포를 1ml PBS로 5분동안 두 번 세척하였다.4. 0.5% Triton X-100 1ml로 5분동안 세포가 침투성이 좋게 만들어 주었다.5. 4번 과정을 suction한 후 세포를 1ml PBS로 5분동안 두 번 세척하였다.6. 1% BSA 1ml를 첨가하고 세포를 blocking하기 위해 5분동안 incubate하였다.7. 6번 과정의 blocking 용액을 제거한 후 세포를 1ml PBS로 5분동안 두 번 세척하였다.8. 1:200비율로 희석된 rhodamine-phalloidin를 함유한 1% BSA 1ml와 1:200비율로 희석된DAPI를 넣은 후, 1시간동안 incubate하고 계속해서 빛을 가려주었다.9. 세포를 1ml PBS로 5분동안 두 번 세척하였다.10. PBS 1ml를 첨가한 후 세포를 fluorescence microscope으로 관찰하였다.4. 참고문헌1) Gagnieur, L., Cheval, J., Gratigny, M., Hébert, C., Muth, E., Dumarest, M., & Eloit, M. Unbiased analysis by high throughput sequencing of the viral diversity in fetal bovine serum and trypsin used in cell culture. Biologicals, 42(3), (2014)., pp.145-152.2) Invitrogen, Gibco. The Molecular Probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies. Thermo Fish. Sci. (2010). pp.833-8573) Invitrogen, Gibco. (2016). Cell culture basics handbook. Thermo Fish. Sci. pp.2-304) Perdue, T. D., & Parthasarathy, M. V. In 453.

자연과학| 2023.09.13| 8페이지| 1,500원| 조회(293)

생물학, 생명과학, 생물학실험, 전공실험, immunostaining, cellc..

미리보기

닫기
판매자 표지

Cell seeding & Crystal violet assay 보고서(아주대 전공실험2)

과목명생명과학 전공실험 2담당제출일소속학번 및 성명Cell seeding & Crystal violet assay1. 실험목적본 실험은 사용하고자 하는 well plate에 맞추어 cell을 seeding하여 세포를 배양하는 방법을 이해하고, cisplatin의 농도에 따른 cell viability를 crystal violet assay를 통해 흡광도를 측정함으로써 직접 관찰하기 위해 수행되었다. in vitro에서 세포에 독성이 시료의 농도에 따라 어떻게 작용하는지와 항암제로 인해 세포가 얼마나 생존 또는 사멸했는지 관찰할 수 있다.2. 실험원리Primary cell은 자발적이거나 modification (virus나 mutagen 처리) 인해 정상세포로 무한 증식할수 있는 immortalized cell이 될 수 있다.Immortalized cell, 즉 cell line (세포주)은 생화학, 동물세포생물학연구에서 복잡한 생물 시스템의 모델을 결정하는 데에 유용하게 쓰인다. (1) 세포가 항상성을 지니며 죽지 않기 때문에 생물학적 분석이 유용하고, (2) 증식을 통해 발생된 자손들이 동일한 유전정보를 지니기 때문에 높은 재현성에 따른 신뢰를 요구하는 과학적 연구에 적합하다는 것이 장점이다. 생명공학 분야에서 cell line은 저비용으로 다양한 목적에 활용되는데, 암이나 바이러스 연구,독성 물질 테스트, 진핵생물에서 의학용 단백질을 대량으로 뽑는 데에 사용된다.Adherent cell(부착세포)이란 비장세포나 복강세포를 배양할 때 유리나 플라스틱 또는 나일론의 표면에 부착하는세포이다. 이 세포는 소식세포에 속하며, T와 B림프구의 상호작용에 의한 항체 생산에는 불가결한 세포로서 1967년에 처음으로 발표되었다. 최근 도움-T림프구 활성화에 필수적인 이 항원 공급세포는 그 활성화에 공헌하는 것으로 생각되는 Ia항원이 세포막에서 발견되었다. 부착세포의 전부가 Ia항원 양성에서는 없는 것으로 알려져 있다. 부착세포는 성장하기 위해 표면에 부착되어야한다. 일반적대략 1분당 1도씩 떨어지도록 서서히 냉각시켜야 한다. Cell damage를 피하기 위해 성장배지에 cryoprotectant를 첨가한다. cryoprotectant는 최소한의 생명현상 유지를 가능하게 한다. 여기에 Glycerol 또는 10% DMSO (dimethyl sulphoxide)가 자주 사용된다. Glycerol은 독성이 없어서 cell에 직접적으로 첨가될 수 있다. DMSO은 glycerol보다 cell에 더 빠르게 침투할 수 있지만 고농도로 사용되거나 너무 오래 처리할 시 cell에 독성을 일으킬 수 있다. 또한 DMSO가 용해되면 열이 발생되기 때문에 cell에 직접 처리될 수 없다. 따라서 DMSO는 희석된 채 사용되어야 하고 37°C이하로 식은 다음 최종 농도 10%로 cell에 첨가되어야 한다. Cell과 cryoprotectant가 혼합되었을 때 viable cell은 106~107 cells/ml이 되게 하여 less viability를 지닌 고농도로 냉각된다.Cytotoxicity는 in vitro 연구에서 biological evaluation을 위한 가장 중요한 지표 중 하나이다. In vitro에서 화학물질(drug)과 pesticides는 세포막 파괴, 단백질 합성 방해, 비가역적인 수용체 결합,polydeoxynucleotide elongation 방해, 효소 반응을 통해 세포에 toxicity를 유발한다. 위 기작으로부터의 세포 사멸을 관찰하기 위한 cell viability & cytotoxicity assays는 세포막 투과성, 효소 활성, 세포 부착성, ATP 생성, co-enzyme 생성, nucleotide uptake activity를 바탕으로 한다. 이들은 색 변화, 형광, 발광 등 측정하는 것에 따라 dye exclusion, colorimetric assays, fluorometric assays,luminometric assays로 분류된다. 첫번째, dye exclusion은 살아있는 세포는 염색약을herent cell은 plate로부터 떨어지게 된다. 살아있는 세포의 부착성 유지를 측정하는 간단한 방법은 plate에 부착되어 있는 세포를 crystal violet으로 염색하는 것이다. Crystalviolet은 단백질과 DNA에 붙어서, 세포가 사멸되어 그 수가 감소하게 되면 염색의 정도 (양) 또한감소하기 때문에 최대흡광파장인 590nm에서 흡광도를 찍으면 cell viability을 측정할 수 있다.항암제란 암세포의 증식을 억제하기 위하여 사용하는 화학요법 치료제로, 주로 DNA에 직접 작용하여 DNA의 복제, 전사, 번역과정을 차단하거나 대사경로에 핵산 전구체의 합성을 방해하고 세포분열을 저해함으로써 항암활성, 즉 암세포에 대한 세포 독성을 나타내는 약제를 총칭한다. 그러나 이러한 항암제는 암세포뿐만 아니라 정상세포에 서도 동일하게 작용하기 때문에 정상조직의 손상 즉 독성은 불가피하다. 그러나 암세포와 정상세포의 대사사이에는 양 적인 차이가 있어 항암제는 암조직에서 보다 큰 독성을 나타 내게 된다. 따라서 이러한 항암제의 선택적 독성을 이용하면 임상적으로 항암화학요법이 가능하다. 항암제는 크게 (1) direct DNA-interacting agent, (2) 대사 길항제, (3) 튜불린에 작용하는 약물군, (4) 호르몬제 종류로 나뉜다. 첫번째 direct DNA-interacting agents에는 DNA를 알킬화하여 DNA복제와 RNA전사를 방해하는 알킬화제, 염기쌍 사이에 끼어들어 DNA나선을 푸는 항암성 항생물질, 세포분열 시 이중 나선을 푸는 topoisomerase를 억제하는 topoisomerase inhibitor 등이 있다. 본 실험에서 사용되는 cisplatin은 알킬화제에 속한다. 두번째 대사 길항제는 세포의 기능과 복제에 필요한 정상 대사물과 유사한 구조를 가지고 있어 세포의 효소와 작용하여 억제효과를 나타낸다. 세번째 튜불린에 작용하는 약물군은 mitotic spindle inhibitor 역할로서 vinca alkaloi시메틸렌(HCHO)3이라고도 하며, 백색분말로 물에 20-30% 용해되고, 서서히포름알데하이드가스가 발생하며 포르말린에 비해 그 작용은 완만하며 지속성, 침투성도 강하다. 또한 조직의 장애도 적다.⑤ PBS : phosphate buffer saline의 약자. 생리 식염액만으로는 그 생명을 오래 유지할 수없는 생물 또는 조직이나 기관의 부유액으로서 이용된다. 보통 M/75 인산 완충액(pH적당) 속에 생리 식염액과 등장(等張)이 될 때까지 소금을 첨가한 것을 이용하고 있다.⑥ acetic acid : 아세트산은 항균 및 항진균 성질을 갖는 합성 카르복실산이다. 이 작용 메카니즘은완전히 알려지지 않았지만, 해리되지 않은 아세트산은 세포막 또는 다른 세포벽 구조에서 증가된 지방산 축적을 허용하는 지질 용해도를 향상시킬 수있다. 아세트산은 약산으로서 탄수화물 대사를 억제하므로 이후에 유기체가 사망에 이를 수 있다.3. 실험재료 및 방법가. 준비물Cultured cell, 6-well plate, 혈구계수기, serum free media, cisplatin, 4% paraformaldehyde, PBS, 1%crystal violet, 10% acetic acid, 96-well plate.나. 방법1. 배양배지를 제거한 후, DPBS로 세포층을 씻어낸다.2. Cell dissociation reagent(Trypsin, Trypsin-EDTA, EDTA solution 등)을 처리한다.3. 상온 또는 37℃에서 세포가 탈착될 때 까지 2~10분간 정치한다.4. 현미경으로 세포의 탈착을 확인한 후, 새로운 배지로 세포를 현탁한다. (Trypsin-EDTA : Media = 1 : 1)5. 세포수를 측정한 후, 적절한 세포 밀도가 형성되도록 세포 현탁액을 취하여 새로운 배지로 희석한 후 배양한다.6. 더 이상 배양할 필요가 없을 때 동결보존한다.1. 6-well plate에 각 well마다 1* cells/well만큼 존재하도록 혈구계수기로 counting하여 ce이온이 필요하다. Trypsin-EDTA는 금속과 이온결합을 하는 효과를 가지고 있어 2가 이온들을 잡아들이는 역할을 한다. 즉, 세포가 dish와 결합하고 있는 힘을 약하게 만든다. 또한, Trypsin 은 peptide bind를 끊어주어 세포와 세포의 힘을 약하게 하며, EDTA의 경우 직접적인 단백질 분해제는 아니지만 단백질 분해 작용을 도와주는 역할을 한다. 하지만 과도하게 첨가될 경우, 세포에 손상을 일으키기 때문에 후에 같은 용량의media를 첨가해준다. 그 외에도 4% paraformaldehyde를 사용하였는데, 이는 시료의 분열 및 분화를 정지 시켜 관찰 가능하게 하기 위해 세포를 고정하는 것이다. 세포 고정은 세포의 세밀한 구조를 유지시켜주지만 고정액과 시간은 항원결정기에 영향을 주고 단백질의 위치 변형을 초래하기 때문에 주의해야한다. 이 실험에서 흡광도를 450nm, 590nm 두 번에 걸쳐 측정하였다. 흡광도는 농도가높을수록 커지는데, 이 실험에서 농도는 용액 속 세포의 수이다. 흡광도 측정기는 분광법칙에 따라 빛에너지를 측정하는데, ‘흡수된 빛의 분율은 통과되는 물질층의 두께에 비례한다.’는 Lambert 법칙과 ‘흡수된 빛의 분율은 물질의 농도에 비례한다.’는beer 법칙에 의해 측정된다. 세포는 용액과 다른 굴절률을 가지고 있으므로 빛을 반사한다. 흡광도 공식에 의해 빛을 흡수하거나 반사하거나 시료를 통과한 빛의 세기는달라지지 않으므로 흡광도 값을 알 수 있다. 이번 실험에서 450nm와 590nm에서 흡광도를 측정하는 이유는 해당 파장에서 용액이 빛을 잘 흡수하지 못해 세포가 반사한빛의 양을 토대로 흡광도를 구할 수 있기 때문이다. 또한, 무한 증식 세포가 가지고 있는 아미노산 중 분자 구조 내에 고리를 가지고 있는 tyrosine, histidine 등의 아미노산이 590nm의 빛을 흡수하므로 해당 파장이 최대흡수파장이기 때문이다. 또한, crystal violet는 파란빛을 띄므로, 파란 빛을 흡수하는 파장인 450nm에서 측

자연과학| 2023.09.13| 11페이지| 1,500원| 조회(347)

생물학, 생명과학, 세포배양, 전공실험, cisplatin, Cellseeding, Crystalvioletassay

미리보기

닫기
판매자 표지

4차산업혁명과 수영 보고서(아주대 수영 중간고사 과제물)

4차 산업혁명의 기술을 수영에 접목시킬 수 있는 방법들은 무엇이 있을까?4차 산업혁명이란 정보통신 기술의 융합으로 이루어지는 차세대 산업 혁명이다. 4차 산업혁명은 전 산업에 걸쳐 강력한 영향을 미치고 있다. 수영도 그 예외가 아니다. 그렇다면 4차 산업혁명이 수영에 미치는 영향은 무엇일까? 나는 이번 보고서를 통해 4차 산업혁명의 기술을 수영에 접목시킬 수 있는 다양한 방법들에 대해 알아보고자 한다.먼저, 인체의 정보를 저장하여 수영을 하는 사람의 모습을 수영을 할 때에 모션을 가상현실과 증강현실 등을 이용하여 구현할 수 있다. 여기서 가상현실이란 어떤 특정한 환경이나 상황을 컴퓨터로 만들어서, 그것을 사용하는 사람이 마치 실제 주변 상황·환경과 상호작용을 하고 있는 것처럼 만들어 주는 인간과 컴퓨터 사이의 인터페이스를 말한다. 또한 증강현실이란 현실의 이미지나 배경에 3차원 가상 이미지를 겹쳐서 하나의 영상으로 보여주는 기술이다. 이를 구현하게 되면, 수영을 할 때의 수영 자세를 알 수 있고 수영하는 사람의 자세에서 무엇이 부족한지를 파악할 수 있게되고, 이를 보완하며 보다 더 나은 실력의 수영을 할 수 있을 것이라고 기대된다.두 번째로는 인공지능 구조요원이다. 해수욕장 익사 사고의 주요원인으로 해류가 갑자기 바다 쪽으로 빠져 나가는 이안류 현상이나 수상 보트 전복 또는 조수 변화에 따라 발생한 웅덩이에 빠지는 일이 있다. 하지만 이런 사례는 해변을 찾는 사람들의 안전을 지켜야 하는 인명구조요원들이 끊임없이 경계해야 하는 위험 중 일부일 뿐이다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 익사는 불의의 사망 원인 중 3위로 전 세계적으로 해마다 몇십만 명의 목숨을 앗아가고 있다. 실제로 현재 이스라엘의 경우, 익사사고를 예방할 수 있는 해결책으로 인공지능 기술을 이용하고 있다. 이는 인공지능 기술으르 활용한 감시 카메라 시스템으로, 해변의 잠재적 위험을 감지해 인명구조요원의 감시 활동을 지원한다. 감시활동의 경우, 인공지능을 활용한 감시시스템은 사람보다 80% 더 빠르기 때문에 물과 관련한 위기 상황을 더 빨리 감지할 수 있어 긴급한 상황이 발생하기 전에 인명구조요원에게 알릴 수 있다.세 번째로는 물을 무서워하지만 수영을 하고 싶은 사람들을 위해 가상현실 기술을 이용해 실제 물은 없지만, 물과 같은 저항력, 습도 등을 구성하여 수영을 연습하게끔 만들 수 있다. 이러한 기술이 개발된다면 물을 무서워하는 사람들이 물 공포증을 극복하게 만들 수 있고 수영을 더 잘 즐기게 만들 수 있다. 이렇게 된다면 수영산업이 더욱 더 발전할 것이라고 생각된다. 또한, 장애인과 같이 신체가 불편하여 수영을 하고 싶지만 직접 물에서 수영을 하기 어려운 사람들은 이렇게 가상으로 물과 같은 환경으로 조성된 환경에서 수영을 하며 안전하게 수영을 즐길수도 있을 것이라고 생각한다.네 번째로는 3D 빅데이터 기술을 수영에 접목하는 방법이다. 수영 동작을 분석하고자 하는 수영 선수에게 마커를 붙이고 선수들의 관절에 부착된 마커를 통해 신체 움직임을 3D 영상으로 전송받아 분석할 수 있다. 이를 이용하면 선수들에게 피드백을 주어 훈련 효율성을 높이고, 부상을 예방할 수 있다. 즉, 다시 말해서 선수 부상방지 및 능력의 극대화를 이끌어내는 효과를 볼 수 있다. 다양한 수영 선수들의 데이터가 쌓인다면 각 선수들의 수영방법에서 공통적인 모션과 같은 것들을 분석하여 이러한 동작들이 수영 실력이 어떠한 영향을 미치는 등의 분석을 할 수 있다.

독후감/창작| 2023.06.19| 2페이지| 1,000원| 조회(136)

수영, 아주대, 4차산업혁명, 4차산업혁명수영, 4차산업혁명과스포츠, 수영과4차산..

미리보기

닫기