유전공학의 이해 8장8.1 유전자 분석유전자 구조 분석옛날 방법으로는 염기서열을 결정하기 전에 대략적인 구조를 파악하는 일부터 하였다.획득된 유전자를 특정 제한효소로 처리하여 절편의 크기와 수를 조사한 후 제한효소 지도를 얻는것이 먼저였다. 또한 제한효소로 잘린 DNA 절편의 특성을 알아보는 서던블롯 분석을 수행하였다. DNA 절편에 특정한 DNA 서열이 존재하는지 여부를 판단할 수 있는 이 분석법은 제한효소 지도와 함께 효과적인 염기서열 결정을 위한 기초 자료로 사용되었다.(1) 제한효소 지도 Restriction enzyme map특정 DNA 절편 내 제한효소 자리를 나타낸 지도DNA 절편의 대략적인 특성을 알아보는데 유용유전체에서 유전자와 돌연변이 위치를 알아보고자 할 때도 좋은 이정표 역할유전자 진단 (돌연변이가 있는 개체의 유전자는 정상의 것과 제한효소 절편 길이가 다름)DNA 부분 절단(partial digestion)으로 제한효소의 농도와 처리 시간을 조절하면 DNA가 부분적으로 잘린 조각이 나타난다. 이후 전기영동을 통하여 크기표지자(size marker)로 조각의 크기를 조사해보면 특정 절편에 인접해 있는 절편이 무엇인지 추정할 수 있다.(2) 서던블롯 분석법 (Southern blot analysis )-제한효소 등으로 잘린 DNA 절편에 특정한 DNA 서열이 존재하는지 여부를 알아보는 분석법- 전기영동으로 분리된 DNA 절편을 나이트로셀룰로오스 또는 나일론 필터에 옮긴 후 특정 DNA 탐침과 혼성화시켜서 나타나는 밴드의 크기와 진한 정도를 분석하는 방법과정DNA 분리 및 제한효소 처리전기영동 젤 상에서의 분리블롯팅(blotting) (Southern transfer) – 젤을 염기성 용액에서 처리하여 DNA를 변성시켜 단일가닥으로 만든 다음 나이트로셀룰로오스 필터나 나일론 필터로 이동시킨다.혼성화 (hybridication) - 적절한 DNA 절편을 방사성 동위원소나 비방사성 표지를 포함하여 탐침(probe) 을 제조하고 이것을 이용하여 상하고 폴리아크릴아마이드 젤 또는 모세관 상에서 이동하는 절편을 레이저와 형광검출기로 검출한다. 각 ddNTP로 표지된 절편의 형광색이 다르므로 색을 가지고 A, T, C, G를 판별할 수 있고 이동순서에 따라 염기서열을 결정할 수 있다- 모세관(capillary) 상에서 이동하는 절편을 레이저와 형광 검출기로 검출하고 판독결과 컴퓨터에 자동입력- 4줄이 아닌 한줄에서 모두 분석; 다량의 샘플처리 가능해짐- 판독의 정확도 증가- 긴 모세관 이용으로 분석할 수 있는 길이 증가- 분석결과 자동 입력8.2 유전체 분석유전체(genome)란 유전자 (gene)와 덩어리(체)를 뜻하는 -ome이 결합된 단어이고,한 생명체의 염색체(chromosome)에 있는 유전정보의 총집합이다Ex) Transcriptome(DNA 로부터 만들어지는 RNA 전사체), Proteome(RNA 로부터 만들어지는 단백질 체)유전체 지도 작성 (세포학적,유전적,물리학적 지도:유전체 구조, 염기서열 분석에 필요함세포학적 지도 작성 (Cytological Map)염색체 띠 패턴으로 염색체 지도 작성 ex) 김사(Giemsa)염색 이용세포분열 중기에만 가능함염색체의 형태는 동원체 (centromere) 양쪽에 두 팔(arm)로 이루어져 있는데 짧은 팔을 p, 긴부분을 q라고 표시한다.특정 유전병 질환자의 염색체 띠 패턴을 조사하면 유전병을 일으키는 염색체의 이상이 무엇인지를 알아볼 수 있다. 예를 들어 낭성섬유증 (cystic fibrosis) 환자 는 CFTR로 밝혀졌다.형광 In situ 혼성화법 (fluorescence in situ hybridization, F ISH)-세포분열 중기(metaphase)단계에 있는 세포의 염색체를 표지된 DNA 또는 RNA와 혼성화시키고, 현미경으로 염색체와 표지 신호를 동시에 검출하는 방법이다.-실험 원리는 분열하는 세포를 슬라이드 위에 올려놓고 고정시킨 후에 약품을 처리하여 염색체가 변성되고 DNA 가닥이 풀어지도록 한다. 이후 형광물질로 표지된 탐침을 영동단순 서열길이 다형성 (simple sequence length polymorphism,SSLP)짧은 반복 서열이 반복 숫자가 달라 길이가 달라지는 다형성이다. 반복서열의 길이에 따라 두가지로 나뉜다.단순 직렬 반복(simple tandem repeat, STR) : 서열이 6bp 이하이며 보통 10~30번 반복되어 있다. 유전체 전반에 걸쳐 있으며 전체 길이는 짧다.가변 사본 직렬 반복(variable number of tandem repeat, VNTR) : 서열이 25bp까지 이르며 염색체 말단체(telomere) 근처에 존재한다. 반복횟수가 STR 보다 많고 전체 길이는 길다.단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) : 염기 서열 하나가 차이나는 유전적 다형이다.물리적 지도 (physical map)제한효소 지도STS (sequence tagged site, 염기서열 표지자리) 지도: 다른곳에서는 발견되지 않는 유전체의 특이한(unique) 서열Ex) STS 지도를 고려하여 여러 YAC 클론을 바르게 정렬할 수 있다. 각 클론은 여러 STS를 포함하는데 이들을 겹쳐보면 각 YAC 클론의 방향과 순서를 결정할 수 있다.방사선 조사 하이브리드 지도 (radiation hybrid)방사선 조사 후 하이브리드 세포주 (hamster cell line) 제조두개의 DNA 마커(STS)가 서로다른 fragment 에서 발견되는 빈도를 구함과정: 방사선을 쬐여 염색체의 분절을 유도한다. 이 세포를 햄스터 세포와 융합하면 사람의 염색체는 햄스터 염색체에 삽입된다. 이렇게 삽입된 세포주를 계속 유지하면서 사람 염색체의 물리적 지도(sts 지도) 를 작성할 수 있다.유전체 염기서열 결정 전략얻은 염기서열을 정렬하여 전체 서열을 결정하는 법콘티그 방식 (contig): 이 방식은 유전체를 YAC 나 BAC에 나누어 클로닝하고 물리적 지도를 만든 다음 정렬시키고 코스미드로 쪼개고 나서 다시 정렬한다. 이것을 플라스미드 벡터 로 구 하는 분야- 유전자 구성 요소의 공통점, 원리 등을 파악하여 새로운 유전자 찾는데 이용Ex) in silico 새로운 microRNA 찾음기능 유전체학 (functional genomics)유전자의 서열이 의미하는 바가 무엇인지, 유전자 수행 기능을 대량으로 밝힘Ex) 미세배열(microarray) , 대량의 RNAi비교 유전체학 (comparative genomics)서로 다른 생물종간 유전체 정보를 이용하여 유전적 유사성/ 차이점 밝힘Ex) 암호화 부위/비암호화 지역독성 유전체학 (toxicogenomics)사람이 가지고 있는 유전체가 무엇인지에 따라 독성이 나타나는 정도가 차이가 나는지 예측하는 분야약물유전체학 (pharmacogenomics)개인의 유전적 특성과 약물에 대한 반응 간의 관계에 대해 연구하는 분야.구체적으로 약효와 유전자 변이와의 상관성, 약효를 결정 짓는 전체 유전자의 활동, 유전자형에 맞는 처방법이 활발히 연구되고 있다.2. 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing)-기존 염기서열 분석법(자동 염기서열 분석법) 은 정확하나 시간이나 비용이 문제였다- 특징* 분석할 DNA를 PCR로 확보 (vs cloning)* PCR 산물을 평판이나 미세구슬 등의 고체 표면에 고정 ( DNA 증폭법)* 합성과 동시에 염기서열 정보 확보* 분석 정확도 낮다* 분석 속도 빠르고, 분석 이용 저렴DNA 증폭법유전체 DNA에서 무수한 종류의 PCR 산물을 얻고 이것을 고체 표면에 고정시키는 방식에는 기존의 염기서열 분석법과는 전혀 다른 여러 혁신적인 기법이 사용되었다. 그중에서 대표적으로 사용된 방식이 에멀젼( emulsion) PCR 과 가교(bridge) PCR 방식이다.에멀젼 PCR : 유전체 DNA를 적절한 길이로 절단한 후 DNA 어댑터를 연결하고 단일가닥 A 프라이머가 표면에 고정된 미세구슬과 적절한 비율로 혼합하여 기름 속에 넣어 미세한 수용액 방울을 만든다. PCR 과정을 통하여 하나의 미세구슬에 한 종류의 D로 dNTP를흘려준다. 뉴클레오타이드가 하나 첨가될 때 하나의 파이로인산과 함께 수소 이온이 하나 떨어져 나온다. 이 수소 이온에 의해 pH변화가 나타나면 이것을 전압 변화로 변환하여 염기서열을 분석한다.가역종결자 이용한 분석법 (Reversible Terminator): 데옥시리보오스기의 3’ 위치에 아지도메틸기(azidomethyl)가 붙어 있어 DNA 합성 반응 중 사슬을 종결시킨다. 타이민이 ==에 형광물질과 아미도메틸기가 떨어져나가 3’OH기가 재생되어 사슬을 신장시킬 수 있는 상태가 된다. 다른 뉴클레오타이드도 이와 마찬가지 구조를 갖고 있어 가역적 종결자로 작용한다. (DNA 합성 정지>다시 중합>반복하면서 염기서열 분석삼세대 염기서열 분석법(3rd Generation Sequencing): PCR 증폭없이 긴 길이의 DNA 단일 사슬에서 염기서열 분석: Single molecule realtime (SMRT) sequencing 방식 이용Ex) zero-mode waveguide(ZMW) 이용-바닥에 효소 고정-빛 도달 범위 매우 적다- 유리판 위 금속 박막에 난 미세 구멍에 형광물질과 융합된 dNTP를넣고 빛을 조사하면 빛이 20~30nm 정도밖에 도달하지 못한다. 따라서 이 빛은 바닥에 고정된 DNA 중합효소 분자와 반응하는 dNTP만을 비추어 특정 형광만을 검출하게 된다.SMRT 과정: DNA 중합효소가 바닥에 고정된 ZMW에 DNA를 넣어주고 네 종류의 뉴클레오타이드를 흘려주면 표적 DNA 서열에 맞는 상보적 뉴클레오타이드가 ZMW 바닥의 중합효소와 결학하게 된다. 이때 형광이 나타났다가 DNA 사슬 신장이 이루어짐에 따라 인산기와 형광물질이 함께 떨어져 나간다. 이런 과정이 반복되면서 단일 분자로부터 염기서열 분석을 할 수 있다.유전체 분석과 응용의 다양화유전체 재분석 (resequencing)-SNP 검색-집단내 유전적 변이 조사Ex) human 1000 genome 프로젝트유전체 신규분석 (de novo sequencing)-새로운
6장6.1 재조합 DNA형질전환 – 재조합 DNA(recombinant DNA) 를 다른 세포에 도입, 발현시키는 과정클로닝(cloning) – DNA 를 재조합하고 이를 다시 숙주세포로 도입하여 특정 유전자를 다량 획득하는 과정, 즉 증폭과 정제를 일컫는 말.제한효소에 의한 재조합 DNA 분자의 제작재조합 DNA 분자 제작의 가장 일반적이며 전형적인 방법은 제한 효소와 DNA 라이게이즈를 이용하여 제작하는 방법이다.플라스미드 벡터를 이용한 재조합 DNA 분자의 제작특정 제한효소로 잘려진 플라스미드 벡터를 원하는 DNA 분자와 DNA 라이게이즈로 연결시키면 여러 다른 재조합 벡터가 생성된다. 이 중 특정 재조합 벡터만을 박테리아 세포로 도입할 수 없기 때문에, 숙주세포로 형질전환을 통해 세포내로 도입한 후 원하는 재조합 DNA 를 함유하고 있는 숙주세포를 선발하여 필요한 DNA를 다량 획득한다.벡터끼리의 자가 연결을 방지하기 위해서는 송아지 장 염기성 탈인산화효소 (calf intestine phosphatase, CIP)와 같은 효소를 이용하여 제한효소로 절단된 벡터 DNA의 한쪽 말단으로부터 5’ 인산기를 제거한다. (DNA 연결효소는 한 DNA의 3’-OH와 다른 DNA의 5’-인산기 사이에 인산다이에스터 결합을 형성하는데, 만약 DNA 한 말단으로 부터 인산기를 제거하면 인산다이에스터 결합을 형성할 수 없게 되므로 자가 연결을 방지하게 된다. )만약 벡터의 삽입 부위를 두가지 종류의 제한효소로 절단이 가능하고 또한 삽입하고자 하는 외부 DNA도 이와 동일한 두 종류의 제한효소로 절단이 가능하다면, 자가 연결이나 DNA의 삽입 방향성을 걱정할 필요 없이 외부 DNA를 원하는 방향으로 벡터에 삽입할 수 있다.제한효소 자리가 제한적일 경우, eq oac(○,1) 비점착성 말단으로 만들어서 삽입함. (blunt end) 클레나우 절편을 이용한 비점착성 말단 형성에 의한 재조합 DNA 벡터의 제작. 삽입하고자 하는 DNA분자의 한쪽말단은 벡터와 동일한 제한효소로 절단된 점착성 말단이며, 다른 말단은 클레나우 절편의 처리로 생성된 비점착성 말단이다. eq oac(○,2) 호환성 점착성 말단을 생성하는 제한효소를 사용 (compatible sticky end) SaLI 과 XhoI, BamHI 과 BgLII의 조합처럼 일부 제한효소는 서로 간에 인식 부위는 다르지만 상호 호환이 되는 점착성 말단을 생성하기도 한다. 이러한 특성을 이용하면 비록 다른 제한효소로 절단되었지만 DNA 라이게이즈에 의한 연결이 가능하게 된다.Ligation의 효율은 sticky end 를 가지는 것이 blunt end 보다 효율의 훨씬 높다.파지 벡터를 이용한 재조합 DNA 분자의 제작플라스미드 벡터 에 조합할 수 있는 DNA조각 크기보다 훨씬 더 큰 조각을 클로닝 하고 싶을 때 사용메틸화효소와 특정 제한효소 자리를 가지고 있는 연결자 DNA(Adaptor DNA)를 이용하여 재조합 파지 벡터를 제작한다.이경우 삽입하고자 하는 DNA 분자를 위치 특이 메틸화효소(EcoRI Methylase)를 이용하여 EcoRI 인식 부위의 아데닌 염기에 메틸기를 첨가함으로써 EcoRI 효소가 인식하지 못하도록 한다.EcoRI 연결자를 연결한 후 , 삽입 DNA 양쪽 말단만 EcoRI으로 절단한다. 이 DNA를 EcoRI으로 절단된 파지의 양팔과 DNA 라이게이즈를 이용하여 연결시킴으로써 재조합 파지 벡터를 제작한다.PCR 산물을 이용한 재조합 분자의 제작PCR (중합효소 연쇄반응, polymerase chain reaction)PCR 이란 Taq 중합효소와 같은 열 안정성 DNA 중합효소를 이용하여 시험관 내에서 적은 양의 DNA 시료를 빠른 시간에 다량의 DNA 단편으로 증폭시키는 방법PCR은 주형 DNA 의 변성, 프라이머 결합과 중합반응의 3단계를 거친다.TA 클로닝 원리 . Taq과 같은 내열성 중합효소에 의해 증폭된 DNA 는 3’쪽에 하나의 돌출된 아데닌을 갖는다. 이 산물을 비점착성 말단에 하나의 5’ – T(타이민)가 돌출된 T-벡터와 연결하여 클로닝 한다.상동재조합 시스템을 이용한 재조합 DNA 분자의 제작위치 특이 상동 재조합(site-specific homologous recombination) 이란 상동의 DNA 절편 사이나 또는 높은 유사성을 보이는 염기서열을 포함하는 서로 다른 두 DNA 절편 사이의 특정 위치에서 DNA 가 교환되는 현상을 말한다.파지 에 의해 만들어지는 파지 Int(Integrase)와 대장균에 의해 만들어지는 대장균 IHF(Integration Host Factor) 두효소에 의해 촉매된다.Gateway 시스템 은 상동재조합의 원리를 이용하여 상용화된 방법. 원하는 DNA 를 BP 반응에 의해 공여자 벡터 ( donor vector) 에 도입하여 엔트리 벡터 (entry vector) 를 제작한다. 제작된 엔트리 벡터는 LR 반응에 의해 원하는 목적 벡터(destination vector)로 도입하여 발현 벡터(expression vector)를 제작한다. CcdB 유전자 산물은 복제효소(gyrase)의 작용을 방해하여 세포를 죽이므로 PCR산물과 재조합된 벡터만 선별할 수 있게한다. 이 시스템의 특징은 제한효소와 라이게이즈를 사용할 필요가 없어 매우 간편하고 매우 빠른 시간내에 재조합 벡터의 대량 제작이 가능하다.6.2 유전자의 대장균 내 도입 방법형질전환(Transformation)외부 DNA(유전자)를 숙주세포내에 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운 유전형질을 추가로 얻게 되는 것을 말함1928 Frederick Griffith Transformation 실험은 비병원성 폐렴쌍구균을 병원성 균으로 바꾼 실험대장균이 외부의 DNA를 쉽게 받아들일 수 있는 상태로 만들어준 세포를 반응능 세포(competent cell) 라고 한다. 따라서 박테리아 세포로 플라스미드 DNA 를 넣어주어 형질 전환시킬 때 대장균이 외부의 DNA 를 받아들일 수 있는 반응능)이 있는 상태로 만들어 준 후(CaCl2 처리) , 열 충격(Heat shock, 42도 온도,90초간) 이나 전기충격을 주어 외부 DNA 의 도입이 이루어지게 된다.전기천공법(electroporation)- 그 다음으로 금속판이 부착된 큐벳(cuvette)에 반응능 세포와 도입하고자 하는 플라스미드 DNA를 혼합한 후 전기충격기를 이용, 짧고 강한 전류를 흘려주어 세포 내로 플라스미드 DNA 가 들어가게 한다.형질감염 (Transfection)파지 DNA 만을 대장균에 직접 도입하는 과정형질전환과 동일한 방법파지감염(Infection)6.3 형질전환된 세포의 선발재조합 플라스미드 벡터의 확인항생제 (antibiotics) 에 의한 선발항생제 표지자(ex. 앰피실린) 에 의한 형질전환체의 선발 과정은 오직 플라스미드를 포함하고 있는 박테리아, 즉 형질전환 박테리아만이 항생제 배지에서 자랄 수 있다앰피실린 처리시,항생제 저항 유전자를 포함하는 플라스미드 없음 > 콜로니 형성 불가항생제 저항 유전자를 포함하는 플라스미드 있고 재조합 유전자도 포함 > 콜로니 형성 가능세포벽 합성 저해제페니실린(penicillin), 앰피실린(ampicillin)lacZ 삽입 비활성화에 의한 선발플라스미드의 lacZ 유전자 산물(B-절편)은 대장균의 염색체 내에 존재하는 lacZ 유전자 산물(w-절편)과 함께 합쳐져 완전한 효소(B-galactosidase)를 이루고 X-gal을 분해하여 청색을 띠게 한다.하지만 플라스미드의 LacZ 유전자 내부에 외부 유전자가 삽입되면 유전자 산물이 만들어지지 않으므로 효소가 형성되지 못하여 X-gal을 분해하지 못하므로 대장균 콜로니는 흰색을 나타낸다.PCR 에 의한 선발도입된 유전자에 존재하는 것과 동일한 염기서열을 가진 프라이머를 이용한 PCR에 의해 삽입된 유전자를 확인하여 형질전환체를 선발 할 수 있다.재조합 파지 벡터의 확인재조합 유전체 크기에 기초한 선발재조합 파지가 파지 입자로 조립되기 위해서는 ____ 파지 유전체의 크기가 37~52 kb 의 DNA 크기를 가져야 한다. 따라서 박테리아를 감염시켜 용균반을 형성하는 파지입자는 적절한 크기의 재조합 벡터를 포함하고 있다는 것을 의미한다.lacZ 삽입 비활성화에 의한 선발(lacZ X)재조합 백터를 포함하는 파지는 X-gal 과 IPTG 를 함유한 배지 위에서 투명한 용군반을, (lacZ O) 비재조합 벡터를 가지는 파지는 청색 용균반을 형성한다.Lamda cl 삽입 비활성화에 의한 선발(Cl O) 손상된 cl 유전자를 가지게 되는 재조합 파지는 투명한 용균반을 가지지만,(Cl X) 비재조합체는 투명하지 않고 흐린 용균반을 가지게 된다.Spi 표현형에 의한 선발 ( Sensitive to P2 inhibition)Spi- 인 재조합 파지 벡터만이 P2 프로파지를 가지는 박테리아를 감염시켜 용균반을 만들 수 있으므로 재조합 파지의 선발이 가능하다. (P2 인식에 필요한 유전자 부위에 클로닝)
