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일반화학및실험1 A+레포트 모음집

1. 유리세공법(1) 유리관 자르기(2) 구부리기(3) 가늘게 뽑기(1) 유리관 자르기: 초반에 유리관을 줄로 긁을 때 같은 위치를 반복해서 긁지 않고, 그 주변부도 긁어서 여러 개의 긁힘 자국이 생겼다. 이후 점차 안정적으로 유리관의 한 곳에만 줄로 긁으니, 줄자리가 확실해졌고 이 부분에 엄지손가락으로 힘을 가했더니 깨끗하게 잘라졌다. 관을 줄로 긁을 때 수직 방향으로 작업하라는 실험 방법을 따랐기 때문에, 결과적으로 유리관을 매끈한 원통형으로 자를 수 있었다.(2) 구부리기: 결과 사진에서 볼 수 있듯이, 우리 조는 ‘제한된 구부리기’에 해당하는 모양의 결과를 얻었다. 그 원인을 알아보았다. 우선 ‘좋은 구부리기’의 결과를 얻기 위해서는 일정한 속도로 균일하게 유리관을 가열해야한다. 그러나 우리 조는 유리관을 일정한 속도로 돌리지 않아 양쪽이 동일하게 열을 받지 않았다. 이에 따라 유리관의 길이가 다르게 늘어났을 것이다. 또 열이 균일하게 가해지지 않고 좁은 부위에만 가해져서 ‘좋은 구부리기’의 결과를 얻지 못했다. 90°로 관을 구부리려고 했으나, 힘을 조금 더 많이 쏟아서 90°보다는 조금 작은 각도로 구부러진 관을 얻었다.(3) 가늘게 뽑기: 초반에 유리관을 불꽃에서 가열시켜도 아무런 변화가 없어서 원인을 찾아본 결과, 유리관이 불꽃에 제대로 닿아있지 않고 불길만 느껴질 정도의 거리에 있어서였다. 위치를 재조정한 후, 유리관을 약 5분간 가열하자 연해지는 것을 확인할 수 있었다. 천천히 당기자 모래시계 형태로 가열 부위의 두께가 얇아졌다. 하지만 유리관이 한 쪽으로 치우치면서 얇아졌다. 이는 유리관의 가열부위가 고르게 가열되지 않아서였다. 이후 조금 더 당기는 과정에서 너무 힘을 가했는지 유리관이 얇아지다가 끊어지는 현상이 발생했다. 유리관을 가늘게 뽑는 작업은 속도 조절, 힘 조절에 더 신경을 써야하는 일임을 알게 되었다.(4) 생각해보기: 이번 실험에 사용한 유리들은 열에 의해 쉽게 가공할 수 있었지만 모든 종류의 유리가 그런 것은 아니다. ‘팽창 좋지 않았다. 그 이유를 생각해보았다. 우선 실험을 조원들끼리 번갈아가면서 진행했기 때문에 눈금을 읽는 과정에서 차이를 보였다. 눈금을 읽을 때에는 눈의 높이를 수평으로 맞추고 메니스커스의 맨 밑바닥 부분을 읽었어야 하는데 어중간하게 읽었다. 둘째로, 눈금실린더를 사용할 때 액체를 옮기는 과정에서 벽면에 남은 액체를 최대한 털어냈어야 하는데 그러지 못해서 측정값의 정밀도가 낮아졌다. 셋째로, 뷰렛 사용에 미숙했던 점이다. 코크를 돌리는 타이밍을 놓쳐서 측정값의 정밀도가 낮아졌다. 액체 옮기기를 수돗물이 아닌 증류수로 진행하는 이유가 궁금했다. 수돗물은 각종 유기물과 무기물을 함유하고 있고, 공기 중에 방치되면서 이산화탄소가 녹아 약한 산성이 된다고 한다. 즉 순수하지 못하다. 그러나 증류수는 수증기를 냉각시켜 정제했기 때문에 순수하다. 질량 측정은 정확한 값을 측정해야 하는 실험이므로 순수한 물인 증류수를 사용하는 것이다.일반화학 제2판 / 일반화학교재연구회 / 자유아카데미 / 10~14쪽네이버지식백과 [화학대사전] ‘메니스커스’네이버지식백과 [두산백과] ‘증류수’네이버지식백과 [생활속의화학과고분자] ‘먹는물, 어느것이 좋은가?’3. 물탑쌓기와 화학정원(1) 물 탑 쌓기섞은 용액밀도가 높은 용액노랑, 녹색녹색 > 노랑노랑, 파랑파랑 > 노랑노랑, 빨강노랑 > 빨강녹색, 파랑녹색 > 파랑녹색, 빨강녹색 > 빨강파랑, 빨강파랑 > 빨강밀도가 높은 순서: 녹색 > 파랑 > 노랑 > 빨강금속 염색깔속도육수화염화코발트(Ⅱ)자주색->남색빠름육수화질산아연백색->흰색느림삼수화질산구리(Ⅱ)파란색->하늘색느림구수화질산철(Ⅱ)핑크빛 백색->갈색매우 빠름(2) 화학정원(1) 물 탑 쌓기‘물 탑 쌓기’는 용액의 농도 차에 의한 밀도의 차이를 이용한 실험이었다. 사전에 준비된 밀도가 다른 4가지 설탕 용액을 2가지씩 섞어 밀도를 비교하고, 밀도가 높은 순으로 용액을 쌓아 물 탑을 만들어 보는 것으로 실험이 진행되었다. 이론에 따르면 밀도가 다른 용액은 서로 섞이지 않고 층을 이루어야는 속도에 차이가 있었는데, 이는 금속염마다 반응성이 다르다는 것으로 설명할 수 있다. 반응성이 좋은 금속염들은 반투과성 막을 빠르게 형성하고, 반응성이 좋지 못한 금속염들은 막을 천천히 형성하기 때문에 속도의 차이가 생긴 것이다. 실험결과 구수화질산철(Ⅲ)의 반응속도가 가장 빠르고, 삼수화질산구리(Ⅱ)는 반응속도가 훨씬 느렸다. 주위 환경을 관찰해보면 철은 흔히 녹슬어 있는 상태로 발견되는데 이는 철은 반응성이 커서 불순물들과 결합되어 있기 때문이다. 그에 비해 구리의 반응성은 철보다 훨씬 작다. 인류가 철보다 구리를 먼저 발견할 수 있었던 이유도, 철은 산화철 형태로 존재해 순수한 형태로 바꾸기 위해 높은 열과 까다로운 제련 과정이 필요했기 때문이다. 실험결과, 결정은 위쪽 방향으로만 자라는 것을 확인할 수 있었는데 그 이유가 궁금하여 알아보았다. 결정은 옆 부분과 윗부분의 압력이 다른데, 윗부분이 더 약하다. 반투과성 막은 압력을 받으면 터질 때 약한 부분이 터지므로 윗부분이 터지게 되고, 그래서 결정은 위쪽 방향으로만 자라게 되는 것이다. 또 결정은 일정 시간이 지나자 성장을 멈추었는데, 이는 결정이 다 녹아서 규산나트륨 용액과 더 이상 반응할 수 없게 되었기 때문이라고 추측할 수 있다. 규산나트륨 용액은 1:4의 비율로 묽게한 용액을 사용했는데 다른 비율의 용액을 사용하면 어떤 결과를 얻을 수 있을지 궁금해 알아보았다. 농도가 너무 진한 용액을 사용하면 막이 너무 두꺼워서 반응이 진행되는 속도가 느리고, 너무 묽으면 결정이 자라지 않게 된다고 한다. 즉, 절절한 반투과성 막을 형성하기 위해서 1:4의 비율로 묽게한 용액을 사용하는 것임을 이해할 수 있었다. 이번 실험은 반투과성 막에 대한 삼투현상으로 이해해볼 수 있는 실험이었다. 이 원리가 적용된 예는 실생활 속에서도 흔히 발견할 수 있는데, 그 예로는 소금물에 배추를 절이는 경우가 있다. 배추 세포의 세포막과 결정이 형성한 막은 반투과성 막으로서 분자 크기에 따라 물질을 선택적으로 통과시킨다. 소금시킨다. 즉 순수하게 흡광물질에 의한 흡광만을 관찰하기 위해서는 대조액이 100% 투과도를 갖도록 보정하는 단계를 거쳐야 하는 것이다. 이번 실험에서는 염화코발트의 최대흡수파장이 주어졌지만, 만약 이 파장이 주어지지 않았다면 대략적인 영역을 어떻게 알 수 있을지에 대해 생각해 보았다. 첫째, 여러 파장 범위에서 흡광도를 측정하여 이를 비교해 흡광도가 큰 파장 범위를 구하고 대략적인 최대 흡수 파장을 구할 수 있을 것이다. 둘째, 염화코발트와 같이 색을 띠는 경우에 어떤 색을 나타내기 위해선 그 색과 보색 관계에 있는 파장을 흡수한다고 알려져 있으므로 이로부터 대략적인 흡수파장을 유추해내어 그 근방에서 최대 흡수가 일어난다고 판단할 수 있다. 마지막으로 분광광도계가 활용되는 양상을 알아보았다. 분광광도계는 유기 및 무기 화합물의 정량, 정성 분석에 주로 사용되며, 일정 파장에서의 흡광도 측정 뿐만 아니라 시간에 따른 흡광도의 변화, 일정 범위에 걸친 파장에 따른 흡광도 변환도 측정할 수 있어 핵산, 단백질, 약, 발표물질 등의 다양한 시료의 측정에 이용이 가능하다.사이언스올 '광도계', '보색광'네이버지식백과 '분광광도계'네이버지식백과 ‘흡수스펙트럼’5. 화학양론결과 값구리줄의 무게(g)0.83g반응한 후의 구리줄의 무게(g)0.79g반응한 구리의 무게(g)0.04gCu 몰질량(g/mol)63.546g/molCu 몰수(mol)6.29×0.0001molAgNO3의 무게(g)수용액으로 주어짐거름종이의 무게(g)1.58g건조한 Ag + 거름종이의 무게(g)2.51gAg 석출량(g)0.93gAg의 몰질량(g/mol)107.8682g/molAg의 몰수(mol)8.62×0.001molAg : Cu13.70 : 1이론적 계수: 2AgNO3 + Cu -> 2Ag(↓) + Cu(NO3)2실험을 통한 계수: 화학반응은 질량-에너지 보존 법칙에 따라 일어나기 때문에, 반응물에 있는 각 원소의 원자수는 생성물에 있는 같은 원소의 원자수와 같아야 한다. 하지만 실험을 통해 얻은 반응성을 따져보면 상대적으로 이온화 경향이 큰 구리는 양이온이 되어 용액 속으로 녹고, 이온화 경향이 작은 은은 석출되게 된다. 즉, 산화-환원 경향이 서로 다른 두 금속이 접촉할 때, 쉽게 산화되는 금속은 산화되고, 다른 금속은 환원된다. 실험을 진행한 후, 화학양론이 무엇인지 알아보니 이는 화학반응에서 반응물과 생성물의 양적 관계에 대한 이론으로 화학반응 전후의 원자 개수와 양이 보존된다는 사실에 바탕을 두고, 일정성분비 법칙, 질량 보존법칙, 배수비례법칙이 이에 관한 법칙임을 알게 되었다.일반화학 제2판 / 일반화학교재연구회 / 자유아카데미 / 206~231쪽네이버지식백과 [살아있는교과서] ‘금속마다 반응성이 다르다’네이버지식백과 [물백과사전] ‘휘발성물질’6. 비누화 반응약 40℃로 가열한 식용유에 에탄올과 NaOH를 넣고 저어주며 가열을 진행하니 응고되기 시작했고 부풀어 오른 상태가 되었다. 비누화 반응이 끝난 용액에 5분 간격으로 NaCl을 첨가하자 용액이 불투명하게 응고된 덩어리 형태를 나타냈다. 적당히 건조된 비누를 풀어 PH를 측정해보았다. 처음 측정 시 물의 양이 비누에 비해 너무 많아 연한 녹색 PH 9~10의 결과를 얻었는데, 이후 2번 다시 측정해보니 PH 12~14의 결과를 얻을 수 있었다.이번 실험은 식물성 기름인 식용유를 이용해 비누를 만들어 보는 실험이었다. 실제 실험 결과가 이론상의 결과 및 실험 과정과 일치하였기 때문에, 이번 실험에 대한 토의 및 고찰은 오차의 원인을 규명하는 게 아닌 실험에 대한 화학적인 분석에 초점을 두었다. 비누화 반응은 유지를 강염기와 반응시킬 때 카르복실기가 떨어지며 지방산의 염과 함께 글리세롤을 생성하는 것으로, 이때 생성되는 지방산의 염이 비누이다. 실험을 진행할 때, 식용유를 가열하는 과정에서는 큰 변화는 관찰되지 않았는데 에탄올과 NaOH를 넣어주면서부터 비누화 반응이 진행되었다. 이 반응에 에탄올과 NaOH가 기여하는 역할이 무엇인지 궁금해 알아보았다. 우선 비누화 반응도 일종의 가수분해 ol)

자연과학| 2024.04.01| 19페이지| 10,000원| 조회(189)

기체상수의결정, 화학양론, 유리세공법, 비누화반응, 질량측정과액체옮기기, 반응열과..

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Cryopreservation of mammalian cells A+레포트

11주차 - Cryopreservation of mammalian cells1. TitleCryopreservation of mammalian cells2. Date3. Name4. Purpose세포를 장기간 계대배양을 하게 되면 오염으로 인해 세포가 소실되거나 돌연변이가 생겨날 수 있다. 따라서 이를 대비하기 위해 미리 충분한 양의 세포를 확보하고, 장기간 안정하게 유지·보관할 수 있도록 cell stock을 만들어 동결 보존시킨다.5. MaterialsMCF-7 Cells (cultured in T25 flask), DPBS, 0.05% Trypsin-EDTA solution, Media (RPMI1640, FBS, P/S), DMSO, alcohol lamp, micropipette, tip, rack, beaker, 1.5㎖ ep-tube, cryogenic vial, 70% ethanol, tissue, incubator, centrifuge, clean bench, (2-propanol, cryo freezing container, liquid nitrogen container)6. Methods① 4℃에서 냉장보관 중이던 media를 37℃ water bath에서 충분히 pre-warmed.② Clean bench에 넣기 전, pre-warmed media 및 필요한 실험기구들을 70% 에탄올로 소독한다. (Cell이 들어있는 flask는 에탄올로 소독하지 않고 clean bench로 옮겨준다.)③ 세포주를 배양 중인 배양접시 내부의 media를 micropipette으로 aspiration & discard.④ DPBS washing: Micropipette으로 DPBS 1㎖을 flask에 조심히 분주하고 좌우로 gently washing 해준 후, DPBS를 다시 aspiration & discard.⑤ 0.05% Trypsin-EDTA solution 500㎕를 flask 안에 조심히 분주한다.⑥ 4분간 incubation at 37℃ (wi준다. (frozen slowly at 1℃/min)⑬ -70 ~ -90℃의 deep freezer에서 24hrs 보관 후 질소 탱크에 넣어준다.7. Discussion앞서 5주차에서는 동결보존해두었던 세포를 해동하여 배양접시에 plating 하는 실험을 진행했다면, 이번 실험에서는 정반대로 배양접시에 배양 중이던 세포를 회수하여 동결보존해보았다. 세포실험에 있어서 배양세포를 초저온의 환경에서 동결보존하는 것은 가장 기본적이면서도 필수적인 과정이라고 할 수 있다. 이때 동결보존이란 일반적으로 cryoprotective agent(동결보호제)와 함께 세포나 조직과 같은 생물학적 물질의 현탁액을 -80℃의 deep freezer나 -196℃ 이하의 액체질소에서 보존하는 것을 의미한다(1).세포를 동결보존해야하는 이유는 세포 배양 과정에서 발생할 수 있는 유전적 변이와 오염이라는 측면에서 생각해볼 수 있다. 세포를 배양할 때 배양접시의 한정적인 면적으로 인해 세포 증식이 제한되기 때문에, 지속적인 세포분열이 가능하려면 새로운 배양접시에 plating하는 계대배양이 필요하다. 이때 세포가 분열할 수 있는 공간을 제공하는 것도 중요하지만, 동일한 유전적 특성을 가진 세포주를 지속적으로 대를 이어 배양하기 위함이 계대배양의 주된 목적이라고 할 수 있다. 실험에 사용하는 세포의 일관성을 유지하는 것이 정확하고 신빙성 있는 실험결과를 도출하는데 중요하기 때문이다. 하지만 계대배양을 거듭하며 passage number가 증가할수록 세포에서는 불가피하게 유전적 변이가 발생하는데, 이로 인해 세포가 가진 성질도 조금씩 변하게 된다. 유전적 변이로 인한 세포 성질의 변화가 축적될 경우, 계대배양에 사용된 초기 세포주와는 전혀 다른 성질을 갖는 세포로 변화가 가능하다.이외에도 주변의 환경적 요인으로 인해 의도하지 않은 오염이 발생할 수 있는데 계대배양 중 세포주가 오염될 경우 이전 상태로 되돌릴 수 없기 때문에 오염을 방지하는 것은 중요하다. 따라서 세포실험을 할 때에는 clean 에 효과가 없다. 게다가 배양세포에 오염되어도 세포를 죽이지 않고 공존하여 증식하는 경우가 많으므로 광학 현미경으로는 관찰이 어렵다(3). 또한 일반적인 박테리아 감염과는 다르게 배양액의 pH 변화나 혼탁도를 유발하지 않아서 감염 여부를 인지하는 것도 쉽지 않다(4). 세포가 mycoplasma에 감염되면 transfection 효율이 저하되고, 세포 대사 및 성장이 저해되며, 세포 모양이 변화하고 단백질 및 유전자 발현이 변화된다(3). 이로 인해 해당 배양세포를 사용해 실험을 진행할 경우 올바른 실험결과를 얻기 어려울 것이다. 뿐만 아니라 mycoplasma는 배지나 액체질소를 통해서 다른 세포에 쉽게 감염될 수 있기 때문에, 미리 예방하고 주기적으로 오염 여부를 확인하는 것이 중요하다(2).따라서 가급적 오염을 최소화하고, 초기 세포주에 가까운 상태로 온전히 세포를 보존하기 위해서 동결보존은 필수적인 과정이라고 할 수 있다. 또한 세포를 동결보존하는 시기 역시 중요하게 고려할 사항이다. 앞서 언급했듯이 계대배양 중 세포가 오염되면 되돌릴 수 없고, 계대배양을 거듭할수록 세포는 유전적 변이로 인해 초기 세포주와는 다른 성질을 가지게 된다. 따라서 가급적이면 passage number가 낮은 초기 계대배양 시기일 때, 세포가 cell stock을 만들기에 적절한 농도로 증식했으면 이를 동결보존하여 보관하는 것이 중요하다(5).이번 실험 역시 세포현탁액을 만드는 과정까지는 기존의 subculture 실험과 동일하게 진행되었다. 지난 subculture 실험에서는 세포에 trypsin-EDTA solution을 처리한 후 incubator에 넣기까지 시간이 약간 지체되었었다. 하지만 trypsin은 결합단백질에만 특이적으로 작용하는 것이 아니라, 세포막에 존재하는 모든 단백질에 비특이적으로 작용하여 가수분해를 일으키는 효소이므로 적정 시간을 초과하여 처리할 경우 세포에 해로울 수 있다. 따라서 이번 실험에서는 이 점에 주의하여 trypsin-EDTA soluti㎕로 더 큰 volume에 해당하기 때문에 먼저 넣어줬고, 두 용액이 서로 잘 섞일 수 있도록 1000㎕ pipette을 이용해 기포가 생기지 않게 주의하며 pipetting 해주었다. 동결보존을 할 경우에 사용할 수 있는 다양한 동결보호제가 존재하지만, 이번 실험에서는 일반적으로 가장 많이 사용되는 DMSO를 최종적으로 10% 농도가 될 수 있게끔 넣어주었다. 동결보호제는 동결보존을 하는데 있어서 가장 중요한 요소라고 할 수 있는데, 이는 세포를 동결하는 과정에서 형성된 얼음 결정이 세포에 손상을 유발하는 가장 큰 원인이기 때문이다. 세포나 조직에서 물이 차지하는 비중은 대략 70~80%인데, 세포를 동결하는 과정에서 물이 얼면서 날카로운 얼음 결정이 형성된다. 형성된 얼음 결정은 세포막뿐만 아니라 세포소기관을 포함한 세포 구조를 파괴하며, 세포 내부의 물이 어는 과정에서 부피가 팽창함에 따라 세포가 터질 수도 있다. 이때 DMSO와 같은 동결보호제는 일반적으로 세포막 투과성이 좋으며, 물과 수소결합을 형성할 수 있는 구조를 가지고 있다. 본래 물 분자간의 수소결합에 의해 큰 얼음 결정이 형성되지만, DMSO와 같은 동결보호제가 물 분자와 수소결합을 이루게 될 경우 물 분자간의 상호작용을 저해하게 된다. 이를 통해 얼음 결정의 형성이 저해되며, 얼음 결정이 형성되더라도 비교적 작은 크기의 결정이 형성되기 때문에 세포에 가해지는 손상을 줄일 수 있다(7). 따라서 동결보호제는 얼음 결정의 형성을 최소화하고 삼투 스트레스로 인한 세포의 손상을 방지하여 세포가 비교적 온전한 상태로 보존될 수 있도록 해주며, 추후 세포를 해동했을 때 세포 생존율을 높이는데 도움을 주는 요소이므로 필수적이라고 할 수 있다.동결보존을 할 때 동결보호제가 필요한 것은 맞지만, 사용된 동결보호제의 농도가 높아질수록 세포에 toxic하게 작용할 수 있다. 이번 실험에 사용한 DMSO의 경우 양친매성 분자로서 극성 영역에 해당하는 sulfinyl기와 비극성 영역에 해당하는 methyl기를 동경우에는 신속하게 진행하는 것이 중요하다. 따라서 이번 실험의 최종 결과였던 세포현탁액과 DMSO가 담긴 cryogenic vial은 곧바로 액체질소에서 동결시키는 것이 아니라 우선 2-propanol이 들어있는 cryofreezing container를 사용하여 초기 냉각을 진행하게 된다. 앞서 사용한 동결보호제인 DMSO가 세포가 동결되는 과정에서 얼음 결정이 형성되는 것을 방지하지만, 얼음 결정은 세포를 급속하게 냉각시킬 때에도 발생할 수 있다. 따라서 DMSO가 존재하더라도 세포를 급속하게 냉각할 경우 얼음 결정이 형성되고 이로 인해 세포가 손상될 수 있으므로, 비교적 일정하고 낮은 속도로 초기 냉각을 하는 것이 중요하다. 이때 2-propanol은 온도가 1분당 1℃씩 천천히 일정하게 감소하도록 도와주기 때문에, 2-propanol을 넣은 cryofreezing container를 이용해 초기 냉각을 진행하게 된다.8. Project(1). 또 다른 cryoprotective agent (cryoprotectant)에는 어떤 것들이 있을까?Cryoprotective agent는 세포 내부의 용질 농도를 높이는 방식으로 물의 결정화를 방해하여 얼음 결정의 형성을 최소화하고, 삼투 스트레스로 인한 세포 손상을 방지한다. 따라서 극저온의 환경에서 세포를 비교적 안정한 상태로 동결보존할 수 있으며, 추후 세포를 다시 해동할 때 활성을 갖는 정상 세포의 회수율을 높이는데 기여하기 때문에 중요한 요소라고 할 수 있다. 이번 실험에서는 최종 농도가 10%가 될 수 있도록 dimethylsulfoxide (DMSO)를 cryoprotective agent로 사용했는데, 이외에도 또 다른 cryoprotective agent로는 glycerol (GLY), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)등이 있다(9). DMSO를 포함하여 앞서 서술한 cryoprotective agent는 세포막을 투과할 수 있는 permeating a다.

자연과학| 2024.01.12| 5페이지| 1,500원| 조회(189)

계대배양, 액체질소, cell stock, 동결보존

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Adherent Cell lysis for Protein extraction A+레포트입니다.

12주차 - Adherent Cell lysis for Protein extraction1. TitleAdherent Cell lysis for Protein extraction2. Date3. Name4. PurposeCell lysis (or cellular disruption)에 사용되는 여러 가지 물리적, 화학적 방법을 알아본 후, RIPA lysis buffer를 사용하여 세포를 파괴하고 cellular protein을 얻을 수 있다.5. MaterialsMCF-7 Cells (cultured in 60㎜ dish), Ice cold DPBS, Ice cold RIPA lysis buffer, micropipette, tip, rack, beaker, cell scraper, ep-tube, centrifuge, ice, tissue, 70% ethanol6. Methods① Micropipette으로 media를 제거한다.② Ice cold DPBS 1㎖을 분주하여 wash 한 후, DPBS를 다시 aspiration & discard.③ Ice cold DPBS 1㎖을 분주하고 세포를 cell scraper를 이용하여 긁어낸 후 ep-tube에 harvest & centrifugation 10000rpm for 4min at 4℃.④ 상층액 제거 후, ice cold RIPA lysis buffer를 분주하여 suspension (pipetting 충분히)* 아래 표를 참고하여 분주한 다음, 15분간 ice 위에서 incubation.RIPA Lysis BufferSample amount5 million cells per 1㎖ of reagent→ 실험에 사용된 세포는 약 1×106 cells이므로, RIPA lysis buffer는 200㎕ 사용함.⑤ Centrifuge at ~10,000rpm for 8min (to pellet the cell debris at 4℃)* 상층액에 protein이 존재함⑥ 상층액을 ep-tube (labelled 바닥에 부착하지 않은 죽은 세포를 포함한 불순물을 제거해 주었다. 이후 새롭게 DPBS를 분주한 후 cell scraper를 이용해 세포를 모아주었다. 앞선 subculture 실험에서도 진행했듯이 cell scraper를 이용한 scraping은 물리적인 압력을 가해 세포를 배양접시 바닥으로부터 떼어내는 방법을 의미한다. 이때 배양접시 바닥을 긁어 세포를 한곳으로 모을 때에도, 너무 세게 압력을 가할 경우 세포가 손상될 수 있기 때문에 배양접시를 살짝 기울인 상태로 부드럽게 긁어 모아주었다. 물론 추후 실험 과정에서 lysis buffer를 처리하게 되면 세포가 lysis되어 세포 구성 성분이 용출될 것이다. 하지만 cell scraping 과정에서 과도한 압력으로 인해 세포가 손상되어 파괴될 경우 노출된 단백질이 protease에 의해 분해될 수 있고, 이는 추후 단백질 획득량에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 최대한 세포가 손상되지 않도록 주의해서 scraping을 진행했다. 또한 scraping을 마치고나서 배양접시를 기울여 DPBS가 고여 있는 곳에서 DPBS를 micropipette으로 흡입한 후, DPBS가 없는 바닥에 분주하여 cell이 바닥을 타고 내려와 한 곳으로 모일 수 있게 해준 후에 세포를 ep-tube에 회수해주었다. 이를 통해 배양접시에 배양되고 있던 세포를 최대한 회수함으로써 단백질 획득량을 높일 수 있도록 하였다.세포를 wash하고 ep-tube로 회수하는 과정에서 DPBS를 사용했는데, DPBS는 세포에 non-toxic하기 때문에 세포 실험에서 자주 사용되는 인산염을 포함하는 생리식염수이다. 앞서 여러 번의 실험에서 wash 단계에 DPBS를 사용했던 것과 마찬가지로, 세포를 회수하는 과정에서도 DPBS를 사용할 수 있는 이유는 삼투 현상과 관련이 있다고 생각한다. DPBS는 증류수와 다르게 0.9%의 NaCl로 이루어져 있어 체액과 같은 농도를 이루는 등장액이다. 만일 cell harvest를 진행하는 과정에서 저장액을 사용이었다. 이는 SDS와 같은 계면활성제로 인한 자연스러운 현상이었으므로 cell pellet이 RIPA lysis buffer에 골고루 섞일 수 있도록 pipetting 하는 것에 주의를 기울였다. Cell pellet이 뭉친 곳 없이 균일하게 RIPA lysis buffer에 섞여야 cell lysis 반응이 원활하게 일어날 수 있기 때문이다. Suspension을 마친 세포가 들어있는 ep-tube는 곧바로 ice로 옮겨 15분간 incubation 해주었다.RIPA lysis buffer는 MCF-7과 같은 adherent cell이나 suspension mammalian cell을 lysis 할 때 주로 사용하는 buffer이다. 제품에 따라 조성에 차이가 있지만 이번 실험에 사용된 Thermo Scientific™ 제품의 경우 25 mM Tris?HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS의 조성을 갖는다(3). 이때 RIPA lysis buffer라는 이름에서 보이는 것처럼 해당 용액은 pH 변화를 최소화하는 buffer로도 기능할 수 있는데 이는 용액에 포함된 Tris?HCl이 수행한다. 또한 염인 NaCl은 세포로부터 용출된 단백질의 안정성에 기여한다. 해당 용액의 주된 목적인 cell lysis는 detergent에 해당하는 NP-40, sodium deoxycholate, SDS에 의해 진행된다. 이때 non-ionic detergent에 속하는 NP-40는 전하를 띠지 않는 상대적으로 약한 계면활성제이기 때문에 세포막을 구성하는 인지질은 약하게 분해할 수 있지만 핵막까지는 lysis 하지 못한다. 따라서 RIPA lysis buffer에는 NP-40보다 분해력이 강한 ionic detergent인 sodium deoxycholate와 SDS가 들어있다. 이로 인해 세포막뿐만 아니라 핵막도 분해될 수 있으며 핵에 들어있던 핵 단백질까지 용출될 수 있다(4).이번 실험당 단백질 lysate는 -70℃에 보관해두는데 만일 해당 ep-tube에 들어있는 것이 무엇인지 적어두지 않는다면 추후 실험에 사용하려고 해도 해당 sample이 무엇인지 알기가 어려울 것이다. 따라서 착오 없이 실험을 진행하기 위해서는 늘 sample에 꼼꼼하게 라벨링 하는 것이 중요하다는 생각이 들었다.이번 실험과 같이 세포로부터 단백질을 추출하고자 할 때 실험의 전체 과정에서 가장 신경써주어야 할 점은 바로 온도였다. 단백질을 변성시키는 가장 큰 두 가지 요인은 온도와 pH이다. 따라서 cell lysis를 진행하는 동안 발생하는 pH 변화를 최소화하고자, 사용되는 lysis buffer에는 Tris?HCl과 같은 완충제가 포함된다. Lysis buffer를 이용하여 pH 변화를 최소화했다면, 온도로 인해 단백질에 가해지는 영향을 최소화하기 위해서 실험의 전체 과정은 최대한 ice에서 진행했다. 이번 실험에 사용한 DPBS와 RIPA lysis buffer도 모두 ice-cold 상태였고, lysis buffer로 suspension한 세포도 곧바로 ice에 incubation 해주었는데 이는 모두 단백질의 안정화를 위함이라고 생각한다. 특히 세포가 파괴되고 단백질이 용출되었을 때 세포에 들어있던 protease에 의해 단백질이 분해될 수 있다. Protease를 포함한 대부분의 효소의 활성은 온도에 의존적인 경우가 많은데, cell lysis가 진행되는 동안 ice에서 incubation한 것은 온도를 떨어뜨려 효소의 활성을 낮추기 위함이라고 생각한다. 또한 이처럼 세포가 파괴되면서 단백질과 함께 protease가 용출되었을 때 아예 protease의 활성을 막기 위해서 protease inhibitor를 RIPA buffer와 함께 처리하기도 한다. 하지만 이번 실험의 경우 protease inhibitor를 처리하지 않아도 단백질에 큰 영향이 없었다는 사전 정보가 있었기 때문에 protease inhibitor 없이 cell lysis를 진행했다.할을 하며, NaCl은 염으로서 단백질의 안정성에 기여한다. 계면활성제인 detergent는 친수성과 소수성 영역을 모두 가지고 있는 양친매성 물질인데, 크게 전하를 띠는 ionic detergent와 전하를 띠지 않는 non-ionic detergent로 나뉜다. RIPA lysis buffer의 경우 non-ionic detergent인 NP-40와 ionic detergent인 sodium deoxycholate, SDS를 모두 포함하고 있다. 세포막은 분해하지만 핵막이나 단백질 결합까지는 분해하기 어려운 약한 detergent인 NP-40와 세포막, 핵막, 단백질 결합까지 모두 분해 가능한 강한 detergent인 sodium deoxycholate, SDS가 작용하여 최종적으로 세포막, 세포질, 핵 단백질을 모두 얻을 수 있다(4). 세포가 분해될 때 protease의 작용에 의해 단백질이 분해될 수 있으므로, protease inhibitor를 첨가하여 단백질 분해를 억제하기도 한다(3).(2). 우리가 오늘 뽑은 total protein 양을 측정할 수 있는 방법에는 무엇이 있을까요?세포로부터 추출한 total protein 양을 측정할 수 있는 방법으로는 첫째, 280㎚에서의 자외선(UV) 흡광도를 측정하는 방법이 있다. 방향족 아미노산에 속하는 티로신과 트립토판은 280㎚ 부근에서의 자외선을 최대로 흡수할 수 있는데, 이를 통해 단백질의 농도를 추정할 수 있다. 신속하게 진행할 수 있으며 0.5㎕ 정도의 소량의 sample만 있어도 측정 가능하다는 장점이 있지만, 핵산과 같이 280㎚에서의 자외선 흡수 능력을 가진 기타 오염물이 포함되지 않아야 정확한 측정이 가능하다. 두 번째로는 bicinchoninic acid (BCA) assay가 있다. 이는 알칼리 조건에서 단백질에 의해 Cu2+가 Cu1+로 환원되는 Biuret reaction에 기반한 방법으로, 이와 같은 환원 반응은 시스테인, 티로신, 트립토판 등 여러 아미노산 잔기와 펩타이드 골

자연과학| 2024.01.12| 5페이지| 1,500원| 조회(255)

단백질 추출, Protein extraction, Cell Lysis

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BCA assay A+레포트 평가A+최고예요

13주차 - Protein quantification : BCA assay1. TitleProtein quantification : BCA assay2. Date3. Name4. Purpose단백질 정량 분석 방법 중 colorimetric method의 일종인 BCA assay를 수행하여 표준 단백질의 흡광도를 이용한 표준곡선을 그린 후, 미지의 단백질 시료 농도를 구해본다.5. MaterialsExtracted proteins (from MCF-7 cells), Bovine serum albumin (BSA) protein, nuclease free water, BCA reagent A & B, micropipette, tip, rack, 96well plate, 1.5㎖ ep-tube, tissue, 70% EtOH, incubator, plate reader6. Methods[1] Preparation of standard protein (BSA)2㎎/㎖ BSA stock (조별로 80㎕씩 제공됨)으로 serial dilution을 진행하여 7개의 ep-tube에 각각 0, 0.025, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2㎎/㎖ 농도의 BSA을 최소 30㎕씩 준비한다.2㎎/㎖80㎕(2㎎/㎖ BSA)30㎕1㎎/㎖50㎕(2㎎/㎖ BSA) + 50㎕(D.W)60㎕0.5㎎/㎖40㎕(1㎎/㎖ BSA) + 40㎕(D.W)40㎕0.25㎎/㎖40㎕(0.5㎎/㎖ BSA) + 40㎕(D.W)40㎕0.125㎎/㎖40㎕(0.25㎎/㎖ BSA) + 40㎕(D.W)60㎕0.025㎎/㎖20㎕(0.125㎎/㎖ BSA) + 80㎕(D.W)100㎕0㎎/㎖40㎕(D.W)40㎕[2] Preparation of BCA working reagent1) Total volume of BCA working reagent required(Standard 수 + Unknown 수) × (# replicates) × (# volume in each microplate)= (7 + 1) × (3) ×.025111E0.1250.1250.125222222F0.250.250.25UnknownGHFigure 2. 흡광도 측정 결과Figure 3. BCA assay resultFigure 1은 microplate의 각 well에 넣은 BSA 농도와 위치를 나타내며, Figure 2는 570㎚ 파장에서 측정한 흡광도 값을 나타낸다. Figure 3는 BCA assay result로 triplicate를 진행한 sample의 평균 흡광도를 표로 정리하였다. 표준단백질로 사용한 BSA의 농도(x축)에 따른 570㎚에서의 평균 흡광도(y축)를 이용하여 standard curve를 그린 결과 y = 0.3635x + 0.0834라는 상관관계식과 R2=0.9988이라는 결과를 얻을 수 있었다. 570㎚에서 농도를 구하고자한 단백질 시료의 평균 흡광도는 1.007이었고, 이 값을 식의 y값에 대입한 결과 해당 단백질의 농도는 2.54㎎/㎖이라고 구할 수 있었다.8. Discussion이번 실험에서는 MCF-7 세포를 lysis하여 얻은 단백질 시료의 농도를 알아보기 위해, 단백질 정량 분석 방법 중 하나인 BCA assay를 수행해보았다. 단백질 정량이란 시료 내에 포함된 단백질의 전체 양 또는 농도를 분석하는 것을 의미한다. 다양한 분석 방법이 존재하는데, 각각의 방법에 따라 측정원리, 감도, 소요시간, 방해물질에 대한 저항도 등에 차이가 있기 때문에 측정할 대상의 특성을 고려하여 적절한 방법을 선택하는 것이 중요하다(1).우선 이번 실험에서 진행한 BCA assay에 대해 논의하기에 앞서, 단백질 정량의 목적이 무엇인지에 대해 생각해보았다. 단백질을 정확히 정량하는 것은 SDS-PAGE gel 전기영동과 같은 단백질 관련 연구를 진행하는데 있어 매우 중요한 단계라고 할 수 있다. 이는 단백질 관련 연구를 진행할 때 sample 간에 특정한 단백질의 발현량 차이 또는 효소의 활성 정도를 비교하게 되는데, 이때 각각의 sample이 가지고 있는 단백질의 총량을 동일하게 맞춰줄을 잘 흡수하는 파장에서의 흡광도를 측정하여 알아낼 수 있다. 해당 화합물은 보통 562㎚ 부근에서 빛의 흡수율이 높기 때문에 해당 파장에서 흡광도를 측정하는데, 540 ~ 590㎚ 범위 내에서는 흡광도에 큰 차이가 없기 때문에 이 범위 이내의 파장에서 흡광도를 측정하는 것도 가능하다. 따라서 이번 실험에서는 570㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 농도를 알아내었다.BCA assay는 단백질에 의해 환원된 구리 이온이 BCA와 결합한 화합물에 의존하는 분석 방법인데, 그렇다면 단백질의 조성이 BCA assay의 결과에 영향을 미치지는 않을지에 대해 의문이 들었다. 실제로 실험실에서 자주 사용되는 단백질 정량분석 방법인 Bradford assay의 경우 BCA assay와 마찬가지로 colorimetric method에 속하지만 다른 원리를 가지고 있다. 이 경우에 사용되는 Coomassie G-250 dye는 주로 염기성이나 방향족 곁사슬을 갖는 특정한 아미노산과 결합을 형성하는데, 이는 아미노산의 조성 차이에 따라 단백질과 dye 간의 결합 정도가 달라질 수 있음을 의미한다(4). 따라서 Bradford assay에 사용하는 BSA와 같은 표준단백질과 농도를 구하고자하는 단백질 시료 간에 아미노산 조성 차이가 클 경우에는 정확한 농도를 구하기 어려울 것이라고 생각해볼 수 있다. 반면에 BCA assay는 Bradford assay에 비해서 시간은 오래 소요되지만, 단백질 시료 내에 존재하는 peptide bond의 수가 중요하기 때문에 단백질을 구성하는 아미노산의 조성이 크게 흡광도에 영향을 미치지 않으며 이로써 단백질의 농도를 비교적 정확하게 구할 수 있다는 장점을 가진다(3).BCA assay를 진행할 때, 농도를 알고자하는 단백질 시료를 BCA reagent와 반응시킨 후 흡광도를 측정한다고 해서 곧바로 단백질의 농도를 알 수 있는 것은 아니다. 단백질 시료의 농도를 알기 위해서는 이미 농도를 알고 있는 단백질을 표준단백질로 사용하여 standard cur.025, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2㎎/㎖)의 서로 다른 농도의 BSA를 준비하기 위해서, 희석하고자 하는 비율로 물질을 단계적으로 희석하는 serial dilution을 진행했다. 이 방식을 이용하여 처음에 준비된 2㎎/㎖의 BSA와 nuclease free water를 가지고 서로 다른 농도의 BSA로 희석할 수 있었다. Serial dilution을 진행할 때 가장 주의할 점은 매 단계마다 충분한 pipetting을 해줘야한다는 점이다. 희석을 할 때 충분한 pipetting을 통해 균일한 농도의 BSA를 만든 후에 다음 단계의 희석을 진행해야 원하는 농도에 맞는 BSA를 얻을 수 있다. 만일 pipetting이 충분히 진행되지 않아 원하는 농도와 다른 BSA를 가지고 흡광도를 측정하여 standard curve를 그린다면, 이를 토대로 구한 단백질 시료의 농도는 실제 값과 큰 차이를 보일 수 있기 때문에 주의가 필요했다.이번 실험에서는 serial dilution을 통해 서로 다른 농도의 BSA를 만들어 사용했지만, 시중에는 pre-diluted된 표준단백질도 존재한다. 이때 이미 pre-diluted된 표준단백질을 사용하지 않고 serial dilution을 진행한 이유에 대해 생각해보았다. 만일 pre-diluted된 표준단백질을 사용했다면 dilution 과정이 생략되기 때문에 시간이 단축되고, 정확한 농도의 시약을 사용할 수 있다는 장점이 있을 것이다. 하지만 실험에 따라 pre-diluted된 표준단백질과 다른 농도의 표준단백질이 필요할 경우에는 dilution을 거쳐 원하는 농도를 만들어줘야 한다. 따라서 serial dilution은 실험자의 필요에 따라 원하는 농도의 시약을 유연하게 제작할 수 있다. 또한 serial dilution을 진행하면 한 가지 농도의 시약으로부터 다른 농도의 시약을 만드는 것이기 때문에 전체적인 일관성을 유지할 수 있고, 실험을 배우는 과정에서 serial dilution을 직접 해봄으로써 원리를 sample을 모두 10㎕씩 분주한 후 각 well에 200㎕의 BCA reagent를 분주하고 pipetting하여 골고루 섞여 반응이 일어날 수 있게 해주었다. 따라서 서로 다른 well간에 protein sample이 섞이지 않도록 tip을 계속 바꿔서 pipetting 하는 것이 중요했다. 또한 실험의 정확도를 위해서는 각 well에서의 반응 시간이 최대한 차이가 나지 않는 것이 중요했으므로 신속하게 pipetting을 진행한 후 incubation 할 수 있도록 했다. Incubation을 마치고 나서는 plate reader를 이용해 10초간 shaking을 진행해준 후 570㎚ 파장에서의 흡광도를 측정했다. 얻은 흡광도로부터 각 sample의 평균 흡광도를 구하고 BSA 농도에 따른 평균 흡광도를 나타내는 standard curve를 그린 결과, y = 0.3635x + 0.0834라는 상관관계식과 R2=0.9988 값을 얻을 수 있었다. 이때 결정계수인 R2은 0부터 1 사이의 값을 가지는데 해당 갑이 1에 근접할수록 추세선과 실제 데이터가 일치함을 의미한다(6). 따라서 R2값이 1에 가까울수록 standard curve의 신빙성이 높다고 할 수 있고, 보통 0.99를 넘을 경우 해당 추세선이 실제 데이터를 제대로 설명하고 있다고 할 수 있다. 실험 결과 R2=0.9988이라는 값을 얻었으므로 높은 신뢰도를 보인다고 할 수 있다. 상관관계식 y = 0.3635x + 0.0834의 y값에 농도를 구하고자한 단백질 시료의 평균 흡광도인 1.007을 대입한 결과 해당 단백질의 농도는 2.54㎎/㎖이라고 구할 수 있었다. 다만 단백질 시료의 흡광도와 농도가 standard curve를 그리는데 사용한 BSA의 농도와 흡광도의 범위보다 큰 것을 볼 수 있었는데, 좀 더 높은 농도의 BSA를 이용하여 standard curve를 그렸다면 더 정확한 결과를 얻을 수 있을 것으로 보인다.9. Project(1). BCA assay의 원리를 간단하게 설명하세요3).

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실험보고서, 단백질 정량, BCA Assay

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Colony formation assay A+레포트

10주차 - Colony formation assay1. TitleColony formation assay2. Date3. Name4. PurposeIn vitro에서 세포 군집 형성 정도를 분석하는 것을 통해 세포 활성을 확인할 수 있다.5. MaterialsMCF-7 Cells (cultured in 35㎜ dish), DPBS, fixation solution (Methanol : Acetic acid = 7:1), 0.2% crystal violet solution, D.W, micropipette, tip, beaker, 70% ethanol, tissue6. Methods① 실험테이블 70% 에탄올 소독 등 준비 후, 37℃ CO2 incubator에서 dish를 꺼내온다.② Pipette을 이용해 RPMI media를 제거하고, DPBS로 1㎖씩 두 번 rinse (wash)해준다.③ 준비된 fixation solution 200㎕을 분주한 후, 골고루 퍼질 수 있게 부드럽게 흔든다.④ 실온에서 5분간 incubation 후, fixation solution을 제거한다.⑤ D.W를 사용하여 0.2%로 희석된 crystal violet solution 1㎖을 dish에 분주한다.⑥ 실온에서 10분간 incubation 후, solution을 제거한다.⑦ D.W를 사용하여 세포를 제외한 나머지 부분의 염색약이 빠지도록 washing.(세포를 tip으로 건들지 않도록 조심할 것)⑧ Washing을 마친 dish를 tissue 위에 뒤집어서 말려준다.⑨ 염색된 세포군집을 촬영한 후, 다른 조의 colony formation 결과와 비교해본다.Figure 1. 각 조별 MCF-7 cell colony formation assay 결과1조2조3조4조7. ResultsFigure 1은 각 조별 MCF-7 cell colony formation assay 결과이다. Crystal violet solution을 이용하여 염색한 결과, dish 상의 colony를 assay이다(1). 우선 이번 실험과 관련하여 colony의 개념 및 이와 관련된 clone, cloning의 개념에 대해 이해할 필요가 있었다. 한 개의 세포로부터 증식한 세포 집단을 구성하는 각각의 세포는 이론적으로 동일한 유전적 특성을 갖기 때문에 클론이라고 불리며, 이와 같은 클론을 획득하는 과정을 cloning이라고 부른다. 이때 하나의 세포로부터 증식한 세포 집단을 colony라고 하며, 보통 최소 50개 이상의 세포로 구성된 경우를 일컫는다. 일반적으로 정상 세포의 경우 colony 형성률이 낮은 경우가 많지만, 암세포와 같이 분열 능력에 제한이 없는 경우 colony 형성률이 높다는 특징이 있다(2). 이번 실험에 사용한 대상은 앞서 9주차에 seeding하여 일주일 간 배양해두었던 MCF-7 세포인데, 이는 인간 유방암 세포주로서 암세포에 해당하기 때문에 실험 결과 dish 상에 높은 비율로 colony가 형성된 것을 관찰할 수 있었다.이번 실험 이전에 진행했던 cell thawing, media change, subculture, seeding 등의 세포 실험의 경우에는 추후 진행할 실험을 위해 오염을 방지하는 것이 중요했으므로 화염멸균에 주의를 기울이며 clean bench 내에서 진행되었다. 하지만 이번 colony formation assay의 경우에는 배양된 세포를 대상으로 실험을 진행한 후, 더 이상 해당 세포를 이용한 후속 실험이 예정되어있지 않기 때문에 70% 에탄올로 소독을 마친 실험테이블에서 진행했다. 우선 기존의 RPMI media를 제거한 후 DPBS로 2회 washing해주었다. 이때 세포가 부착되어있는 dish 표면에 직접적으로 쏘아줄 경우 살아있는 세포가 떨어질 가능성이 있기 때문에 벽면을 향해 분주한 후 골고루 washing될 수 있게 가볍게 흔들어주었다. 해당 과정에서 죽은 세포가 충분히 제거되지 않을 경우 crystal violet으로 염색 시에 죽은 세포까지 염색되어 colony 형성 정도를 파악하는데 영향dish 표면에 분비된 세포외기질에 속하는 단백질 또한 고정되기 때문에 dish 표면으로부터 세포가 떨어지지 않도록 하는 효과도 있다. Fixation을 하는 대상과 목적에 따라 고정하는 방식이 달라지기도 하지만, 일반적으로 배양세포에는 알코올이 사용되는 경우가 많은데 이번 실험에서도 methanol을 주된 성분으로 하는 fixation solution을 이용하여 고정했다(2).Cell fixation을 마친 후에는 세포를 육안으로 확인할 수 있도록 crystal violet solution을 이용하여 staining 해주었다. 이때 Crystal violet이란 강한 양이온성을 나타내는 alkaline dye인데 미생물 종류를 판별하기 위한 그람 염색뿐만 아니라, colony formation, cell migration, cell invasion assay와 같이 많은 bioassay에 흔하게 사용되는 염료를 의미한다(4). 해당 염료는 진한 보라색을 나타내며, 세포가 가지고 있는 음전하를 띠는 핵과 같은 산성 물질과 결합하여 세포를 염색시키는 특징을 가지고 있다. 세포를 염색하기 위해 crystal violet을 분주할 때에는 원액 그대로가 아닌 D.W를 이용해 0.2%로 희석된 염료를 분주해주었는데, 그 이유에 대해 다음과 같이 생각해보았다. 세포를 염색하는 것은 살아있는 세포 집단에 해당하는 콜로니를 육안으로 쉽게 확인하기 위함이다. 이때 너무 진한 농도의 염료를 이용하여 염색할 경우 주변 환경까지 짙게 염색되어 콜로니의 경계를 명확하게 확인하기 어려울 수 있다. 즉 염색은 관찰하고자 하는 대상이 색을 나타내도록 하는 것도 중요하지만 주변 환경으로부터 구분 되는 것 또한 중요하다. 따라서 주변으로부터 콜로니를 식별할 수 있는 적정 농도로 염료를 희석하여 사용하는 것이라고 생각하였다. Crystal violet solution을 분주한 후 실온에서 10분 간 incubation 하여 세포가 충분히 염색될 수 있도록 시간을 제공한 후에는, D.W를 사용하ng 한 이후에 1~3주 정도 지나고 나서 colony formation assay를 진행하는데, 아직 seeding을 한지 일주일 밖에 지나지 않았기 때문에 형성된 colony의 크기가 작은 것이라고 판단하였다. 앞선 9주차 실험에서 cell counting을 진행한 후 모든 조가 동일하게 1㎖ media에 세포수가 5×103 cell이 될 수 있도록 dilution을 진행한 후 dish에 분주해주었다. 따라서 이론상으로는 동일한 양의 세포를 seeding했기 때문에, 각 조별 배양접시 상의 세포양이 비슷해야 한다. 하지만 관찰 결과 1조와 2조의 세포양은 비슷했지만, 3조는 두 조에 비해 세포양이 적었고, 4조의 경우 육안으로 관찰 가능한 colony가 거의 보이지 않았다. 이와 같이 colony가 형성된 정도에 차이가 발생한 이유가 무엇일지에 대해 생각해보았다. 우선 지난 9주차 실험에서 cell counting에 사용할 10㎕의 세포 현탁액을 따기에 앞서 다시 한 번 세포 현탁액을 1000㎕ pipette으로 충분히 pipetting 해줄 필요가 있다. Fresh media를 이용해 pellet을 골고루 풀어준 상태의 현탁액이지만, 실험에 사용하기 전까지의 시간동안 세포가 가라앉을 가능성이 있다. 따라서 전체 9㎖이라는 용량 중에 상층에 해당하는 영역에서 pipetting 없이 10㎕라는 소량을 딸 경우 실제 세포 농도보다 훨씬 낮은 농도의 세포 현탁액을 cell counting에 이용하게 된다. 이 경우 cell counting 결과 측정한 세포수가 실제 세포 현탁액의 세포수를 반영하지 못할 것이다. 두 번째로는 cell counting 결과를 기반으로 dilution을 진행할 때 역시 세포 현탁액을 충분히 pipetting 해준 후에 사용해야 한다. 이와 함께 dilution하여 농도를 낮춘 세포 현탁액도 pipetting을 충분히 한 이후에 serial dilution 해주어야 정확한 농도의 세포 현탁액을 얻을 수 있을 것이다. 따라서 현저하게 적 Seeding을 마친 후에도 dish를 상하좌우로 부드럽게 흔들어주어 세포가 균일하게 퍼질 수 있도록 해야 한다. 실험을 진행할 때 해당 과정을 충분히 진행하지 않았기 때문에 세포가 한쪽에 편중되어 자란 것이라고 생각하며, 이외에도 seeding을 마친 dish를 clean bench 밖으로 옮기는 과정에서 아직 dish 표면에 부착하지 않은 세포가 한쪽으로 쏠렸기 때문에 colony가 균일하게 형성되지 않았다고 생각한다. 또한 colony 밀도가 낮은 영역에서는 개별적으로 존재하는 colony를 관찰할 수 있었지만, colony 밀도가 높은 영역에서는 서로 다른 colony 간에 겹쳐서 존재하는 것을 볼 수 있었다. 이처럼 colony가 겹쳐서 존재할 경우 colony 형성 정도를 파악하는데 영향을 줄 수 있으며, 이번 실험에서는 진행하지 않았으나 colony의 개수를 counting 하는 경우에는 큰 영향을 미칠 수 있다. 따라서 colony 형성을 위해 세포를 seeding 할 때에는 너무 낮거나 높지 않은 농도로, 서로 독립적인 colony가 형성될 수 있게 적정 농도로 고르게 세포를 분주하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있었다.9. Project(1). Colony formation assay 외에 세포 활성을 측정할 수 있는 실험방법을 최소 한 가지, 간략히 소개해보세요.이번 실험에서 진행한 colony formation assay 외에 세포 활성을 측정할 수 있는 실험방법으로는 colorimetric assay(비색분석법)의 일종인 MTT assay가 있다. MTT는 테트라졸륨(tetrazolium) 염료에 속하며 평상시에는 노란색을 띠지만, mitochondrial reductase의 작용에 의해 비수용성의 보라색 MTT formazan으로 환원된다는 특징이 있다(5). 살아있는 세포의 경우 미토콘드리아에서의 에너지 대사활동이 원활하게 진행된다. 따라서 살아있는 세포에 MTT를 처리하게 되면 mitochondrial reductase에 의해 보

자연과학| 2024.01.12| 5페이지| 1,500원| 조회(309)

Colony formation, 세포 군집 형성, 세포 활성 측정

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