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세포 배양 배지 및 PBS의 구성과 삼투압

세포배양실험세포 배양 배지 및 PBS의 구성과 삼투압개요이하의 내용은 세포 배양 실험에 있어 필수적으로 사용되는 배양 배지 및 PBS(Phosphate Buffered Saline)의 구성 성분과 그 역할에 대해 서술하고 있다. 특히 IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) 배지에 포함된 대표적인 성분의 역할과 세포 성장에 미치는 영향을 알아보았고, 일반적인 배지(culture medium)와 화학적으로 정의된 배지(Chemically defined medium)의 차이점을 비교, 서술하고 있다. 또한, 배지를 멸균하는 데 있어 Autoclave 대신 여과(Filtering)를 사용하는 이유와 그 원리 및 방법을 설명하였다. 마지막으로 PBS의 삼투압 계산을 통해 생리적 조건과의 유사성을 화학적, 수학적으로 알아내었으며, 이를 통해 PBS의 실험적 가치를 논의하였다.IMDM의 구성 성분의 역할Culture media에는 세포를 구성하는 성분들의 조합과 세포성장과 단백질 생산을 위한 에너지 공급이 필수적이다. 따라서 기본적으로 들어가는 성분은 포도당, 아미노산, 지방, 비타민, 무기염류, pH buffer 가 있고, 추가로 혈청(serum), 펩톤, 성장인자 등을 media에 공급해준다.Glucose는 대표적인 cell media의 영양분으로 세포 구성 성분을 만들어 주는 에너지원이다. Glucose는 가장 흔하게 사용되는 에너지원이지만 다른 6탄당 물질인 Fructose, galactose, mannose 등이 사용되기도 한다(Jongkwang Hong, Cell Culture Media, lecture slide 19). Glucose는 배지에서 가장 중요한 탄소원이지만, 포도당의 해당과정(glycolysis)에 의해 pyruvate가 형성되고, 이는 TCA회로를 통해 젖산(lactate)로 전환된다. 그럼으로, 세포 배지에는 젖산의 축적이 발생하고, 이는 배양 환경의 산성화(acidification of the culturally defined media의 차이점Chemically-defined media(화학적으로 정의된 배지)는 분자적으로 균질한 물질이거나, 그 특성이 명확하게 정량화된 혼합물로 구성된다. 즉, 화학적으로 정의된 배지는 실험자가 배지의 모든 성분과 양을 알고 있으며, 이는 세포 배양에서 재현성과 성능 제어, 품질 향상 등의 장점으로 꼽힌다. 정의된 배지는 배지 내 구성 성분이 모두 알려져 있으며, 최근에 들어 혈청을 넣지 않는 serum-free media 라고도 불린다. 이러한 배지는 일반적으로 특정 세포 유형의 배양을 할 수 있도록 특이적으로 조성된다. 이런 정의된 배지는 오염되지 않은 매우 순수한 무기, 유기 성분을 가지고 있으며, 성장 인자와 같은 단백질 첨가제가 포함되기도 한다. 또한 배지에 들어가는 성분들은 박테리아나 효모를 통해 생산된 물질을 넣으며, 비타민, 콜레스테롤, 아미노산, 지방산 등이 추가된다(Arora, Meenakshi. 2013. “Cell Culture Media: A Review.”).화학적으로 정제된 배지와는 달리, 일반적으로 사용되는 media는 basic media, 또는 complex media라고 불린다. complex media는 아주 다양한 미생물체를 배양할 수 있게 설게 되어 있다. Complex media는 주로 효모, 동물, 식물, 등 화학적으로 정확하게 정량화 되지 않은 성분들을 사용한다. 예를 들어, LB media(Luria-Bertani (LB) Media/Broth)는 대표적인 complex media이다. LB media의 구성 성분으로는 Tryptone, Sodium chloride, 그리고 효모 추출물이 있다. 이때, 효모 추출물은 화학적, 공학적으로 만들어진 물질이 아니기 때문에 그 구성과 농도 등이 아주 미세하게 배지마다 다르게 된다(Sigma-Aldrich. “Types of Media in Microbiology” n.d.).즉, 화학적으로 정제된 배지는 그 구성 성분이 명확히 알려져 있려는 성질에서 발생하며, 이때 그 움직임을 막기위한 압력을 삼투압이라고 한다. 이상 용액에서는 삼투압을 다음과 같이 계산한다. Π=nRT/V (π: 삼투압 (atm), n: 용질의 몰 수 (mol), V: 용액의 부피 (L), R: 기체 상수 (0.0821 L·atm/mol·K), T: 절대 온도 (K)). 혹은 π=MRT. 이때 M은 몰농도(mol/L)이다. 즉 M=n/V이다(Brown, LeMay, and Bursten, Chemistry: The Central Science).하지만, 상기 명시된 공식은 비전해질의 경우에 해당되는 이야기이다. 전해질의 경우는 다른 방법이 필요하다. 비전해질의 경우, 예를 들어 설탕의 경우는 물에 녹아도 입자수가 변하지 않지만 NaCl의 경우는 이온으로 분리되기 때문에, 용액 내 입자 수가 변하게 된다. 이것이 중요한 이유는 용액의 삼투압, 끓는점, 어는점 등의 성질이 입자 수에 비례하여 나타나기 때문이다(Chang, General Chemistry).이러한 효과를 반영하기 위해 우리는 반트 호프 계수(van’t Hoff factor)를 공식에 보정해주어야 한다. 반트 호프 계수 i = (용액에서 해리된 실제 입자 수)/(녹인 화합물 단위 수) 이다. 예를 들어, NaCl 은 i=2, CaCl2는 i=3, 비전해질인 설탕은 i=1이 된다. 따라서 전해질의 경우 삼투압 공식은 π=iMRT가 된다(ibid).적용(PBS 삼투압 구하기)PBS 용액 500ml를 만들기 위해 NaCl 4g, Kcl 0.1g, Na₂HPO₄, 0.72g, KH₂PO₄ 0.12g, 0.1M HCl 0.0003L, 마지막으로 증류수 넣어주었다고 하자. 이 PBS의 삼투압은 다음과 같이 구할 수 있다.화합물몰 질량 (g/mol)질량 (g)몰 수 (mol)해리 이온반트 호프 인자 (i)NaCl58.4444 ÷ 58.44 = 0.0684 molNa⁺, Cl⁻2KCl74.550.10.1 ÷ 74.55 = 0.00134 molK⁺, Cl⁻2Na₂HPO₄141.ces. L-Glutamine Solution 200 mM: Technical Data Sheet. Issued December 2006. Accessed March 20, 2025. Hyperlink "https://www.safcbiosciences.com" https://www.safcbiosciences.comThermo Fisher Scientific. "Gibco™ L-Glutamine (200 mM) Supplement." Accessed March 20, 2025. Hyperlink "https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/kr/ko/A2916801" https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/kr/ko/A2916801.Merck. "Base Ingredients of Microbiology Media." Accessed March 20, 2025. Hyperlink "https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/technical-article/microbiological-testing/microbial-culture-media-preparation/base-ingredients-of-microbiology-media" https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/technical-article/microbiological-testing/microbial-culture-media-preparation/base-ingredients-of-microbiology-media.Bonar, Pamela T., and Joseph R. Casey. "Plasma Membrane Cl⁻/HCO₃⁻ Exchangers: Structure, Mechanism and Physiology." Channels (Austin) 2, no. 5 (September-Osites/default/files/Pioli_Lab_LB_Media_Recipe.pdf" https://med.wmich.edu/sites/default/files/Pioli_Lab_LB_Media_Recipe.pdf.Michaels, I. 1948. “The Sterilisation of Sodium Bicarbonate Solutions.” Quarterly Journal of Pharmacy and Pharmacology 21 (3): 231–39.Leitzen, Sarah, Matthias Vogel, Michael Steffens, Thomas Zapf, Christa Elisabeth Müller, and Martin Brandl. 2021. "Quantification of Degradation Products Formed during Heat Sterilization of Glucose Solutions by LC-MS/MS: Impact of Autoclaving Temperature and Duration on Degradation" Pharmaceuticals 14, no. 11: 1121. https://doi.org/10.3390/ph14111121Wang, Xiao-Jia, and Ke-Cheng Hsiao. 1995. “Sugar Degradation during Autoclaving: Effects of Duration and Solution Volume on Breakdown of Glucose.” Physiologia Plantarum 94 (1): 46–49. Hyperlink "https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1995.tb00947.x" https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1995.tb00947.x.Sandal, I., A. Bhattacharya, U. Saini, D. Kaur, S. Sharma, A. Gulati, J. K. Kumar, N. Kumar, .

자연과학| 2025.07.02| 15페이지| 2,000원| 조회(65)

배지, 삼투압, filtration, PBS, 세포배양실험, IMDM, 화학적으로 ..

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세포배양실험_비성장속도와 비생산속도

세포배양실험Introduction바이오 의약품(Biopharmaceutics)이란, 일반적인 저분자 화합물과는 다르게, 생물학적 과정을 이용하여 만들어진 의약품이다. 바이오 의약품의 범주는 매우 넓다. 이들은 백신, 혈액, 혈액 성분, 유전자 치료제, 재조합 단백질 등 다양한 것들을 포함한다.과학자들은 생물학적 연구를 진행하기 위해 적절한 실험용 세포주를 찾던 도중, 1950년대에 CHO(Chinese hamster ovary) cell을 발견하게 되었는데, CHO cell은 낮은 염색체 수와 안정적인 유전자 발현, 그리고 높은 단백질 생산 능력을 가져, 현재 생물학 연구에서 널리 사용되는 포유류 세포이다. CHO cell과 동시에 또 많이 사용되는 HEK(human embryonic kidney) cell은 재조합 단백질 발현 도구로 광범위하게 사용되어지고 있다. HEK cell은 성숙한 단백질을 생성하기 위해 필요한 번역 후 변형, 및 접힘 과정이 잘 수행되기 때문에 생물학 실험과 바이오 산업에서 자주 사용된다.이러한 세포들을 사용하기 위해서는 이 세포들을 배양해야 하는데, 배양 방식에는 부착 배양 (Adherent Cell Culture) 방식과 부유 배양 (Suspension Cell Culture)이 있다. 부착 배양은 세포를 고체 표면에 부착하여 세포를 성장시키는 배양 방법이고, 부유 배양은 세포 어느 기질에 붙지 않고 액체 배지 속에 떠 있는 상태로 성장하는 것을 의미한다. 세포를 공장형으로 대량 생산하기 용이하다는 점에서 주로 부유 배양이 생물 공학에서는 선호된다.부유 배양에는 초기 배양액만 넣고 세포가 사멸할 때까지 더 이상의 공급 없이 진행되는Batch Culture, 배양 도중 기질과 영양분을 지속적으로 추가해주는 Fed-Batch Culture, 신선한 배지를 계속 공급해주고 배양약을 제거해주는 Perfusion Culture, 새로운 배지를 지속적으로 공급하고 빼 주며, 동시에 세포까지 조금씩 제거해주는 Continuous Culture전에 water blank 측정 후, incubation이 완료되면 빠르게 sample 검체를 꺼내어 흡광 분석을 해준 뒤 데이터를 기록한다.Result(그림1) Randox결과1. 공정조건A에서 5일간 배양시킨 세포군의 포도당 농도(그림2) Randox결과2. 공정조건B에서 5일간 배양시킨 세포군의 포도당 농도농도: 4.16mM/L농도: 4.96mM/LRandox결과 5일차에서의 조건 1에서의 포도당 농도는 4.16mM/L로 조건2에서 배양된 세포 배양액의 농도인 4.96mM/L보다 더 낮았다.(위. 그림 3) Vi-cell로 측정한 결과 / (아래. 표 3) Vi-cell 측정 결과 값 표Vi-cell로 500μ의 계대배양된 세포를 검사하여 표3과 같이 정보를 얻어냈다. 측정된 생존 세포 밀도는 3.31×10^63.31cells/mL였으며, 생존율은 97.9%로 매우 양호하였다.DiscussionRandox를 통해 나타난 각 glucose의 농도는 4일차에 비교하여 현저하게 떨어진 것을 확인할 수 있는데, 이는 5일차부터 세포의 density가 급격하게 증가하면서 많은 양의 영양분을 소비하면서 생긴 급격한 변화로 생각되어진다.Vi-CELL 분석 결과를 보면, 생존 세포 수는 3.31×10^6 cells/mL, 생존율은 97.9%로 매우 양호한 상태를 보여주었다. 세포의 평균 직경과 circularity는 각각 13.93 μm과 0.84로 정상 범위에 해당하기 때문에, 분주한 세포의 상태가 안정적인 것으로 생각되어진다(Wu, Andrew. 2024).(표4) specific growth rate와 glucose, lactate, ammonia에 대한 specific production rate 계산 과정.(표5) Specific Growth Rate (μ)와 Specific Production Rate (qₚ) 계산 방법.(표6) Specific Growth Rate (μ)와 Specific Production Rate (qₚ) 결과 표.rSpecific G 분류된다. Off-line 분석은 분석 장비와 공정이 분리되어 떨어진 공간에 위치하여 공정 외부에서 시료를 채취하여 실험실로 옮긴 뒤 분석한다. 따라서 분석까지 시간이 많이 걸리지만 정밀하고 다양한 분석이 가능하다. 그러나 실시간으로 공정을 제어할 수 없다는 단점이 있다.On-line 분석는 시료 공정 중간에서 자동으로 채취되어 분석장비로 자동으로 보내지는 방식이다. 즉, 채취, 측정, 결과까지의 과정이 모두 자동으로 이루어져, 실시간 데이터 확인이 가능하며 공정을 빠르게 제어 할 수 있다(Dagge et al. 2009).At-line 분석은 공정 근처에서 시료를 수동으로 뽑아내어 근처의 분석 장비로 곧 바로 분석하는 방식이며, 장비가 생산 설비와 가까이 위치 하는 것이 특징이다. 분석 속도는 빠르지만, 수동으로 이루어지기 때문에 자동화 방식은 아니다(Dagge et al. 2009).In-line 분석은 센서나 측정 장치가 공정 내부에 직접 삽입되어 있어 시료 채취 과정 없이 공정 흐름 중 실시간 측정이 이루어진다. 데이터가 연속적으로 수집되며, 가장 즉각적인 공정 제어가 가능한 방식이다(Dagge et al. 2009).우리가 진행한 실험에서는 사전에 배양한 세포와 배양액을 실험실에서 사용하였다. 세포의 상태를 Vi-Cell 장비를 통해 분석하였고, 포도당 농도를 Randox 분석기로 측정했다. 이러한 분석은 모두 세포를 배양한 공간에서 떨어진 실험실에서 수동으로 이루어 측정되었기 때문에, off-line 방식에 해당한다(Dagge et al. 2009).사람 치료용 목적 단백질 (치료용 항체)의 생산은 현재까지도 사람세포가 아닌 Chinese hamster ovary (CHO) cell에서 더 많이 생산되고 더 많이 개발되어져 있다. 그 이유에 대해서 문헌조사를 통해 서술하시오.CHO cell은 전 세계적으로 가장 많잉 사용되는 세포주이며, 임상시험과 상용화에 필요한 안정성과 생산성, 규제 적합성 면에서 이미 많이 검증되었다. CHO cell이 인간세수 있고, transfection 또는 infection, 그리고 세포 기반 assay에서 밀도 오류를 범할 수 있다. 또한 세포의 생산성, 성장 곡선 데이터를 왜곡하고 immortalization 여부의 판단을 흐리게 할 수 있다.세포 계수에 오류가 생길 수 있는 원인은 다양하며, 세포를 준비하는데 있는 복잡성과 다양한 계수의 목적, 방법 등으로 인해 신뢰성이 낮은 세포 계수가 이루어질 수 있다. 가장 쉽게 오류가 범해지는 경우는 수동 세포 계수를 진행할 때인데, 이는 시각적 오류, 세포의 응집, 시력의 한계 등으로 발생 가능하다. 이로 인해 대표성이 떨어지는 샘플링이 진행될 수 있으며 주의를 요한다.ReferenceCauvin, Annick J., Christopher Peters, and Frank Brennan. “Chapter 19 - Advantages and Limitations of Commonly Used Nonhuman Primate Species in Research and Development of Biopharmaceuticals.” In The Nonhuman Primate in Nonclinical Drug Development and Safety Assessment, edited by M. A. Bussiere and G. F. Weinbauer, 379–393. Amsterdam: Elsevier, 2015. Hyperlink "https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417144-2.00019-6" https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417144-2.00019-6.Wuest, D. M., S. Hou, and K. H. Lee. “Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells.” In Metabolic Engineering, edited by M. C. Flickinger, vol. 3.52 of Encyclopedia of Industrial Biotechnology,accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2021/761178s000lbl.pdfHorizon Therapeutics. TEPEZZA (teprotumumab-trbw) for Injection, Prescribing Information. Revised July 2023 https://www.tepezzahcp.com/-/media/Themes/Horizon/Tepezzahcp-com/Tepezzahcp-com/Document/TEPEZZA-Prescribing-Information.pdf윤진숙. “갑상선 안병증 [Thyroid Ophthalmopathy].” 세브란스 건강정보, 연세대학교 의료원, 2024년 1월 5일. https://sev.severance.healthcare/health/encyclopedia/disease/body_board.do?mode=view&articleNo=69888&title=%EA%B0%91%EC%83%81%EC%84%A0+%EC%95%88%EB%B3%91%EC%A6%9D+%5BThyroid+ophthalmopathy%5DBioverativ Therapeutics Inc. ALPROLIX [Eftrenonacog Alfa] Package Insert. Revised October 2020. https://www.fda.gov/media/85656/downloadDagge, L., K. Harr, M. Paul, and G. Schnedl. Classification of Process Analysis: Offline, Atline, Online, Inline. Cement International 7, no. 5 (2009): 2–9Wang, Q., Chung, C. Y., Chough, S., & Betenbaugh, M. J. 2019. “Antibody Glycoengineering Strategies in Mammalian Cells.” Biotechnology and Bioengin4

자연과학| 2025.07.02| 16페이지| 2,000원| 조회(79)

세포배양실험, CHO, HEK, 비생산속도, 비생장속도, vi cell count..

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세포배양실험 실험 장비와 멸균

세포배양실험세포배양실 장비와 멸균개요생명과학 연구실의 모습은 그 실험 목적에 따라 다양하다. 그 중 세포를 중점적으로 연구하는 실험실은 빼놓을 수 없는 대표적인 실험실이다. 세포를 연구하는 실험실은 일반적으로 세포 배양 시설을 갖추게 된다. 세포 배양은 동물 또는 식물에서 세포를 분리하여, 적절한 환경에서 배양하는 과정을 의미한다. 세포는 조직에서 뗴어진 뒤, 배양 전에 효소적, 기계적 방법을 이용하여 분리될 수 있다.세포 배양(Cell culture)은 기초 과학 연구 및 응용 연구에서 매우 유용한 도구이다. 과학 연구에서 세포주를 사용하는 장점은 세포의 균일성(homogeneity과 이에 따른 데이터의 재현성(reproducibility)을 확보할 수 있다는 점이다. 그러나 세포 배양을 하기 위해서는 수많은 준비와 장비가 필요하며 모든 과정에 있어 주의를 요한다. 특히, 세포 배양 시 샘플을 오염에서 보호하는 것은 매우 핵심적이다. 이번 보고서에서는 세포 배양실에서 자주 사용되는 여러 장비들과 도구, 그리고 오염으로부터 샘플을 보호하기 위한 멸균에 대해 알아보고자 한다.DiscussionCO2 Incubator는 세포 배양 시 적정 온도와 습도, 그리고 CO2 농도 등의 환경을 일정하고 정확하게 조성하여 세포의 배양과 증식을 최적화할 수 있게 하는 장비이다. 보통 37°C의 온도, 95%의 습도, 5%의 CO2 농도를 조성하여 사용한다. CO2 인큐베이터는 스테인리스 또는 스틸과 같은 부식이 일어나지 않는 소재로 만들어지고, 공기 멸균 필터를 통해 내부 오염을 최소화한다. CO2 Incubator는 세포 배양이 필요한 의료, 제약 생명공학 연구 등에서 많이 사용되며 줄기세포 연구, 조직 재생 연구에서도 자주 사용된다. CO2는 CO2 가스통을 연결하여 일정하게 내부로 배출되게 되어 있다.clean bench는 연구실에서 샘플을 오염으로부터 보호하기 위해 사용되는 장비이다. Clean bench는 작동 시 HEPA(High-Efficiency Particul 위험을 줄이기 위해 액체 질소 층이 아닌 증기층(Vapor Phase)에 보관하는 것이 권장된다. 또한 질소 가스는 액체 질소가 승화하면서 발생하는데, 질소 가스는 밀폐된 공간에서 질식위험을 만들기 때문에 항상 액체질소를 환기가 잘되는 환경에 보관 사용해야 한다(University of Utah Environmental Health and Safety, n.d.)원심분리기는 실험실에서 아주 자주 사용되는 장비로, 원심력을 이용하여 원심분리기를 돌리는 액체나 고체 샘플에서 입자의 크기와 밀도 차이에 따라 물질을 분리하는데 사용된다. 원심분리기는 빠른 회전을 통해 원심력을 발생시켜, 무거운 입자는 회전 중심에서 멀리, 가벼운 입자는 중심에서 비교적 가까운 위치에 남게 만든다. 이를 통해 세포, 단백질, 핵산, 혈액 성분 등을 분리할 수 있다. 원심분리기를 사용시, 로터에 배치하는 샘플이 너무 가득 차 있지 않게 하고, 반드시 균형이 잡히게 배치를 해야 한다. 원심 분리기를 작동 후 잠시 동안 대기하여 원심 분리기에서 이상한 소리나, 진동이 없는지 확인한다. 만약 이상 시 샘플 배치가 불균형한지 확인한다.마이크로 피펫은 소량의 액체를 정밀하게 측정하고 소분 가능한 실험 도구로, 실험실에서 필수적인 도구이다. 마이크로 피펫은 그 용량을 조절 가능하며 P10(1-10µL), P20(2-20µL), P100(10-100µL), P200(20-200µL), P1000(100-1000µL)과 같이 그 종류와 크기가 다양하다. 피펫의 끝에는 오염 방지를 위해 일회용 팁을 사용하고, 사용 후 eject button을 눌러 쉽게 폐기 가능하다. 피펫은 plunger를 통해 작동한다. Plunger를 누르고 천천히 놓으면 액체를 흡입할 수 있고 다시 누르면 액체를 배출할 수 있다. Plunger를 더 세게 누르면 배출 시 모세관 현상으로 팁에 남은 용액을 더 깔끔하게 배출 가능하다. 다만 흡입시에는 이 기능을 절대 사용하지 않는다. 또한 용액이 들어 있을 때는 피펫을 거꾸로 들어 설정한 후 뚜껑을 닫는다. 뚜껑이 확실히 닫혔는지 반드시 확인해야 하는데, 이유는 뚜껑이 제대로 닫히지 않으면 압력이 유지되지 않아 멸균이 불완전해질 위험이 있기 때문이다.Autoclave를 하는 물품에는 반드시 autoclave tape를 붙인다. 이 테이프는 특정 온도에서 내부의 잉크가 비치게 되어, 물품의 멸균 여부를 알 수 있으며, 만약 테이프에 잉크 자국이 없으면 멸균이 제대로 되지 않았음을 알 수도 있는 편리한 테이프이다.Autoclave 사용 시, 기록부에 다음 정보를 작성한다. 날짜 및 시간, 사용자 성명, 멸균한 물품 목록, 사용한 멸균 모드. 멸균이 완료된 후 내부 물품은 매우 뜨거우므로 보호 장갑을 반드시 착용하여 꺼낸다. 액체가 포함된 용기는 완전히 식을 때까지 움직이지 않는 것이 좋다.Buffer solution생물학에서 버퍼(Buffer solution)는 세포 내 및 세포 외 PH를 매우 좁은 범위 내에서 유지하고, 내부 및 외부 요인 영향을 받더라도 PH 변화에 저항을 하게 해주는 것이다. 즉, 세포 배양 시 실험 세포나 유전물질(RNA, DNA) 등이 잘 배양되고 유지될 수 있게 PH를 맞춰주는 완충제 역할을 한다. 버퍼에는 약산과 약염기가 평형 상태를 이루고 있어, pH에 저항이 가능하며, 약산과 그 짝염기, 또는 약염기와 그 짝산으로 구성된다.따라서 버퍼에 강산이나 강염기를 첨가하여도 H⁺ 농도의 로그(log) 값이 pH에 영향을 주기 때문에 pH 변화를 적게 만든다. 수용액에서 H⁺ 농도는 산 해리 평형 상수(Ka, acid-ionization constant)와 약산 대 약염기의 농도 비율에 의해 결정되며, 이는 식 (Equation) 1로 표현된다. 반면, 순수한 물은 약산이나 약염기가 없기 때문에 강산이나 강염기가 추가될 시 이를 중화하지 못한다. 현재 실험에서 가장 많이 사용되는 버퍼는 PBS buffer, TAE buffer, TBE buffer가 있다. PBS(Phosphate buffered saline)는 Nlideshare.net/slideshow/co2-incubatorpptx/264585203?utm_source=chatgpt.com#1Idaho State University. 2025. "Micropipette." Biology Lab Instructor Training. Accessed March 13, 2025. Hyperlink "https://www.isu.edu/biology/biolab/instructor-training/technology/micropipette/" https://www.isu.edu/biology/biolab/instructor-training/technology/micropipette/Princeton University, Environmental Health and Safety. 2025a. "Autoclave Use." Princeton University Environmental Health and Safety. Accessed March 13, 2025. Hyperlink "https://ehs.princeton.edu/laboratory-research/biological-safety/autoclave-use" https://ehs.princeton.edu/laboratory-research/biological-safety/autoclave-use———. 2025b. "Autoclave Use: Autoclave Cycles." Princeton University Environmental Health and Safety. Accessed March 13, 2025. 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Hyperlink "https://ibc.utah.edu/_resources/documents/fact-sheets-and-sops/liquid-nitrogen-storage_fact-sheet.pdf" https://ibc.utah.edu/_resources/documents/fact-sheets-and-sops/liquid-nitrogen-storage_fact-sheet.pdfCalbiochem, Buffers (University of North Carolina at Chape3.

자연과학| 2025.07.02| 9페이지| 2,000원| 조회(60)

Buffer, 멸균, Clean bench, 세포배양실험, autoclave, 무..

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Brassinosteroid이 Columella Cell의 분화와 생장에 미치는 영향

Brassinosteroid이 Columella Cell의 분화와 생장에 미치는 영향Result 미지의 식물 A bzr1-1D col-0(Columbia-0)(WT)Lugol 용액을 이용한 뿌리 끝 염색 결과, Col-0, bzr1-1D, 식물 A 사이에서 columella 세포의 녹말 축적 정도에 차이가 관찰되었다. Col-0(WT)는 columella 세포 부위에서 갈색 염색이 나타나, 정상적인 세포 분화와 녹말 축적이 이루어졌음을 보여주었다. 반면 bzr1-1D는 해당 부위에서 염색이 약하게 나타났으며, 이는 BR 신호가 과도하게 활성화된 상태에서 columella 세포의 분화가 억제되어 녹말 축적이 감소한 것으로 해석된다. 식물 A는 Col-0보다 더 강하고 넓게 퍼진 염색 형태을 보였으며, 이는 columella 세포가 과도하게 분화하거나 녹말을 비정상적으로 많이 축적했을 가능성을 의미한다.DiscussionBrassinosteroids(BRs)는 식물에서 발견되는 천연의 스테로이드 호르몬이다. BR은 식물 생장에 필수적인 호르몬 중 하나로, 세포 신장 촉진에 더불어, 발근, 발아, 줄기 신장, 과실과 꽃 발달, 항산화 효소 활성 조절 등 다양한 역할을 한다.BR의 작용 기전은 다음과 같다. Brassinosteroid(BR)는 식물의 세포막에 존재하는 수용체 BRI1과 공동수용체 BAK1에 결합함으로써 그 작용을 시작한다. 이 결합은 억제 단백질 BKI1의 해리를 유도하고, BRI1-BAK1 복합체 형성을 한 후, BRI1-BAK1의 상호 인산화가 일어나 신호전달을 활성화시킨다. 이후 BSK(Brassinosteroid Signaling Kinase)가 인산화되어 BSU1이라는 phosphatase를 활성화시키고, 이는 음성조절자인 BIN2의 활성을 억제한다. 억제된 BIN2는 더 이상 전사인자 BZR1과 BES1을 인산화하지 못하게 되며, 이 전사인자들은 탈인산화 상태로 전환되어 핵 내로 이동한 뒤 BR 의존 유전자의 발현을 조절한다. 이 과정을 통해 BR은 식물의 생장, 세포 신장, 분화, 스트레스 반응 등 다양한 생리적 과정을 촉진한다.Columella Cell이란 Arabidopsis root cap의 중심 하단에 위치한 조직으로, lateral root cap으로 둘러 싸여 있다. Columella 세포는 root apical meristem(RAM) 내의 columella stem cell(CSC)로부터 유래하였고, 분화된 columella 세포는 녹말 과립(starch granule)을 축적하여 중력 인지(gravity sensing)에 중요한 역할을 한다. 중력 인지 기능은 뿌리가 중력을 따라 아래로 자라도록 유도하는 데 필수적이며, 분화의 지표로 starch 축적량이 사용된다.Lugol’s solution은 요오드(Iodine)와 아이오딘화 칼륨(Potassium iodide)으로 구성된 갈색 용액으로, 전분(녹말)이나 글리코겐, α-1,4 glucan 같은 다당류에 선택적으로 반응하여 염색하는 데 사용된다. 특히 알파-1,4 글루코사이드 결합을 가진 다당류와 결합하면 짙은 청색 또는 갈색으로 변색되며, 이 반응은 전분의 존재를 확인하거나 조직 내 글리코겐 분포를 시각화하는 데 활용된다. 따라서 Lugol’s solution은 생물학 실험이나 의료 진단에서 유용한 시약이다.bzr1-1D는 Arabidopsis thaliana에서 발견된 우성 돌연변이체로, Brassinosteroid(BR) 신호전달 경로의 핵심 전사인자인 BZR1 단백질의 기능이 과도하게 활성화된 형태이다. 이 돌연변이는 BZR1 단백질의 234번째 아미노산이 프롤린에서 류신으로 치환되면서 생긴 것으로, 그 결과 BZR1이 핵 내에 안정적으로 축적되고, BR이 존재하지 않아도 세포 성장과 발달을 유도할 수 있다. 따라서 bzr1-1D는 BR 생합성 억제제(brassinazole)에 저항성을 보이며, BR 수용체 결함 돌연변이체의 생장 결함을 억제할 수 있는 능력을 갖는다.상기한 BR의 역할과 Columella의 특성을 연관지어, 이번 실험의 결과를 보면, control인 col-0에서 Lugol’s solution에 의해 염색된 녹말의 양이 bzr1-1D에서의 녹말의 양보다 많았다. 즉, bzr1-1D 돌연변이에서는 녹말 과립의 축적이 감소하였고, 이는 bzr1-1D 돌연변이가 BZR1의 지속적인 활성화를 통해 BR 신호를 과도하게 유도하며 columella stem cell의 분화를 억제하고 결과적으로 녹말 축적을 감소시킨 것으로 해석 할 수 있다. 즉, 다시 말하면, BR 신호가 활성화되면 columella stem cell의 분화가 지연되거나 억제되며, 이로 인해 분화된 columella cell에서 관찰되는 녹말 과립(starch granule)의 축적이 감소하게 된다. 이는 BR이 세포의 성장을 촉진하는 동시에, 특정 조직에서의 분화, 특히 columella와 같은 중력 감지 세포의 분화를 억제할 수 있음을 의미한다.식물 A는 control보다 많은 양의 녹말 과립이 염색된 것으로 관찰되었다. 즉, A는 BR의 신호를 거의 못받거나, 받지 않았거나 혹은 BIN2 단백질이 과발현되어 BZR1이 계속 분해되어 핵내로 이동하지 못한 경우를 생각해볼 수 있다. 따라서, 식물 A는 BR 수용체가 돌연변이화된, bri1-1 혹은 BIN2 단백질이 과별현된 bin2-D와 같은 식물일 것으로 예측된다.연구에 따르면, bri1-1을 포함한 여러 BRI1 돌연변이체들은 BR 수용체의 기능이 결손되어 BR 신호 전달이 차단되며, 이로 인해 식물의 전체 생장이 둔화되지만 BR 억제 효과가 사라져 특정 조직에서는 분화가 촉진되는 양상을 보인다. 이러한 조건에서는 columella 세포가 더욱 빠르게 또는 많이 분화하여 녹말 축적이 과도하게 일어날 수 있다.반면, bin2-D 돌연변이체는 BR 신호 경로를 음성 조절하는 GSK3-like kinase인 BIN2의 과활성화 돌연변이체로, 이 역시 BR 신호가 억제되어 성장보다 분화가 우세해질 수 있는 상황을 유도한다. BIN2-D는 특히 BR 처리에 반응하지 않으며, 뿌리 생장 억제 반응을 보인다.ReferenceAnkita Singh, Padmanabh Dwivedi, Vijay Kumar, and Devendra Kumar Pandey, “Brassinosteroids and Their Analogs: Feedback in Plants under In Vitro Condition,” South African Journal of Botany 143 (2021): 256–265, Hyperlink "https://doi.org/10.1016/j.sajb.2021.08.008" https://doi.org/10.1016/j.sajb.2021.08.008Narender Kumar and Anjali S. Iyer-Pascuzzi, “Shedding the Last Layer: Mechanisms of Root Cap Cell Release,” Plants 9, no. 3 (2020): 308, Hyperlink "https://doi.org/10.3390/plants9030308" https://doi.org/10.3390/plants9030308National Cancer Institute. "Lugol's Solution." NCI Drug Dictionary. Updated 2024. https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/cancer-drug/def/lugols-solutionZhi-Yong Wang et al., “Nuclear-Localized BZR1 Mediates Brassinosteroid-Induced Growth and Feedback Suppression of Brassinosteroid Biosynthesis,” Developmental Cell 2, no. 4 (2002): 505–513, https://doi.org/10.1016/S1534-5807(02)00153-3Hak-Soo Lee et al., “Brassinazole Resistant 1 (BZR1)-Dependent Brassinosteroid Signalling Pathway Leads to Ectopic Activation of Quiescent Cell Division and Suppresses Columella Stem Cell Differentiation,” Journal of Experimental Botany 66, no. 15 (2015): 4835–4849, https://doi.org/10.1093/jxb/erv316Noguchi, Takao, Susumu Fujioka, Atsushi Choe, et al. “Brassinosteroid-Insensitive Dwarf Mutants of Arabidopsis Accumulate Brassinosteroids.” Plant Physiology 121, no. 3 (1999): 743–752. https://doi.org/10.1104/pp.121.3.743Li, Jing, Michael M. Nam, and Joanne Chory. “BIN2, a New Brassinosteroid-Insensitive Locus in Arabidopsis.” Plant Physiology 127, no. 1 (2001): 14–22. https://doi.org/10.1104/pp.010134

자연과학| 2025.06.25| 5페이지| 1,500원| 조회(44)

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Western blot을 통한 단백질 정량

Western blot을 통한 단백질 정량Introduction웨스턴 블롯(Western blot)은 immunoblotting이라고도 불리며, 세포나 조직에서 추출한 단백질 혼합물로부터 특정 단백질을 검출하고 정량 할 때 자주 사용되는 면역기반 단백질 분석 기법이다. SDS-PAGE를 통해 단백질을 크기별로 분리한 후, 이를 막(membrane)에 전이(transfer)시키고, 항체를 이용해 원하는 단백질을 선택적으로 검출한다. 최근에는 인산화나 유비퀴틴화 같은 번역 후 변형(post-translational modifications)도 확인할 수 있어 생리적 또는 병리적 상태에 따른 단백질 변화를 연구하는 데 유용한 도구로 사용되어지고 있다.처음 개발된 이후, 많은 개량을 거친 western blot은 민감도 향상과 함께 형광 및 화학발광 기반의 비방사성 신호 시스템이 주로 활용되고 있습니다. 비록 항체의 특이성 문제나 표준화 부족 등이 한계로 지적되어지고 있으나, 실험 조건을 최적화하고 개량되고 너 나은 항체를 사용할 경우, 재현성 있고 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있다.본 실험에서는 western blot을 통해 샘플 단백질 3가지에 대한 발현 양상을 분석하고, 이를 통해 western blot을 방법과 원리, 과정 등을 학습하였다.Materials and methodsD.WSDSTris-HClHeat blockVertex mixerSDS-PAGE geldiscontinuous polyacrylamide gel(stacking gel, running gel)discontinuous polyacrylamide gelPVDF membraneTransfer buffermethanolFilter papersBlocking reagentwashing bufferPrimary antibodySecondary antibodyHousekeeping protein구성A (Sample A: 13)B (Sample B: 15)C (Sample C: 15.5)Protei쳤고 filter paper 사이에 membrane을 끼워 넣은 뒤 전류를 걸어주어 젤에 있는 단백질을 막으로 이동시켜주었다. 이때 우리는 Semi-dry transfer 방식을 사용하였다. 이후 background signal을 잡아주기 위해 blocking을 해주고, 1차 항체를 붙여주고 overnight reaction을 해주었다. 다음 날, 우리는 membrane에 비특이적으로 결합한 항체를 제거해주기 위해 wash를 해주었고, HRP가 붙은 2차 항체를 붙여주고 다시 세척해주었다. 이후, 기질 처리를 해주어서 반응을 관찰하였다. 시료 간에 단백질 양을 정확히 비교하기 위해 우리는 loading control로 housekeeping protein을 같이 검출해주었다.Resultwestern blot결과, 샘플 1과 2, 3 모두 크기가 모두 동일하거나 큰 차이가 없는 것으로 보인다. 모두 같은 위치에 밴드가 형성되었고, 차이점이라고 하면, 샘플 1에서는 관찰하고자 하는 밴드 외에 다른 밴드가 검출되는 smear 현상이 발견되었고, 샘플 3에서는 단백질이 너무 많아서 생긴것으로 생각되는 퍼짐 현상이 나타났다. 샘플 2에서는 다른 background signal 없이 잘 깨끗하게 관찰되었다.Discussion먼저, 각 샘플의 밴드 위치가 모두 같은 것을 보아 모두 같은 크기의 단백질임을 알 수 있었다. 다르게 넣어준 것은 단백질의 양인데, 단백질의 양이 가장 많은 샘플 3에서 밴드가 부풀어 오른 것을 보아, 이는 넣어준 항체의 농도가 너무 높거나, 한 well에 loading한 단백질의 양이 너무 많아서 생긴 현상일 수 있다고 생각했다. 또한 샘플 1에서도 마찬가지고, 같은 이유로 smear가 생겼을 수도 있고, 그 외에도 단백질 분해, 블로킹 미흡, loading시 기포 생성 등 여러가지 이유가 있을 수 있다.stacking gel 과 running gel의 구조, 기능적 차이에 대해 설명하시오stacking gel 과 running gel은 불연속 버이온화 상태가 약하여 속도가 느리고, Cl⁻(tris)는 빠르게 이동한다. 단백질은 두 느리고 빠른 이온 사이의 속도로 이동하면서 두 이온 사이에서 압축되어, stacking zone에서 얇게 모이게 된다. 이후 이렇게 모인 단백질은 pH 8.8인 separating gel로 이동하면서 크기에 따라 분리된다. running gel은 단백질을 분자량에 따라 분리하는 역할을 수행인다. 이때는 Glycine이 음전하로 대전되면서 이동속도가 변하게되고, 단백질은 molecular sieving에 의해 분리된다. 상대적으로 높은 아크릴아마이드 농도(7.5–15%)를 가지고 pH는 약 8.8을 가지고 작은 기공을 가진다.membrane 종류 3가지 이상 조사해서 장단점을 서술하시오Nitrocellulose (NC) Membrane은 오래되고 널리 사용되는 단백질 고정용 membrane이다. 소수성 상호작용에 기반하여 단백질을 비공유결합으로 결합시킨다. 장점으로는 사용이 간단하고, background signal이 낮으며 다양한 염색법과 같이 사용 가능하다는 점이 있다. 단점으로는 재탐침이 어렵고 마르게 되면 쉽게 부서자며 저분자 단백질은 membrane을 그냥 통과할 수도 있다는 점이있다.PVDF (Polyvinylidene Fluoride) Membrane는 NC와 더불어 가장 많이 사용되는 membrane이다. PVDF는 고분자 불소화합물로 구성되어 있어, 분극된 구조가 dipole을 형성하고, 소수성 성질이 강해 소수성 아미노산과 비공유적으로 잘 결합한다. PVDF는 단백질 결합력이 매우 강하고 재탐침이 가능하며 기계적 강도와 화학적 안정성 모두가 뛰어나다. 또한 다양한 염색법과 형광 탐지에 적합한 구조를 가진다. 단점으로는 사용전에 메탄올로 활성화시키는 전처리 과정이 필요하고 background signal이 존재 할 수 있다.Nylon Membrane은 높은 단백질 결합력을 가지며, NC 만큼이나 부드럽고 얇고, 내구성이 높다. Nylon Membrane은 제조protein는 모든 조직에서 많이 발견되고, 다른 단백질과는 달리 여러 조건에서도 일정하게 발현된다.Housekeeping protein의 western blot에서의 역할은 각 샘플의 단백질이 동일한 양으로 loading되고, 전이가 잘 되었는지 확인하는 loading control 또는 internal reference이다. 이는 실험 조건에 따라 target protein의 band intensity가 다를 수 있기 때문인데, housekeeping protein의 intensity를 기준으로 상대적인 정량(normalization)을 수행하여 우리가 알고 싶은 단백질의 발현 변화가 실험에 의한 것인지, 아니면 단순히 적재량의 차이인지를 구별하기 위한 지표로 사용된다.ReferenceRasheed Sule, Gabriela Rivera, and Aldrin V. Gomes, “Western Blotting (Immunoblotting): History, Theory, Uses, Protocol and Problems,” BioTechniques 74 (2023), https://doi.org/10.2144/btn-2022-0034101 Western Blotting Troubleshooting Tips (2024), 101 Western Blotting Troubleshooting Tips Guide, accessed May 14, 2025, https://www.chemie-brunschwig.ch/documents/suppliers-information/AssayGenie/101-western-blotting-troubleshooting-tips-guide-2024.pdfJackson ImmunoResearch Laboratories, Western Blot Troubleshooting Guide!, April 27, 2017, accessed May 14, https://www.jacksonimmuno.com/secondary-antibody-reand Detection. Bulletin 6040. Accessed May 10, 2025. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdfMakoto Hagiwara, "Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Western Blotting Analyses via Colored Stacking Gels," Analytical Biochemistry 652 (2022): 114751. https://doi.org/10.1016/j.ab.2022.114751Yufang Xiang et al., "Comparison of the Sensitivity of Western Blotting between PVDF and NC Membranes," Scientific Reports 11, no. 12022 (2021), https://doi.org/10.1038/s41598-021-91521-8Biji T. Kurien and R. Hal Scofield, "Western Blotting: An Introduction," Methods in Molecular Biology 1312 (2015): 17–30, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2694-7_5Rena Li and Yong Shen, “An Old Method Facing a New Challenge: Re-visiting Housekeeping Proteins as Internal Reference Control for Neuroscience Research,” Life Sciences 92, no. 13 (April 19, 2013): 747–751, https://doi.org/10.1016/j.lfs.2013.02.014Novus Biologicals, Loading Control Handbook (Centennial, C4

자연과학| 2025.06.25| 7페이지| 2,000원| 조회(77)

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