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[생화학] 세포의 gDNA 추출 평가A+최고예요

7주. 세포의 gDNA 추출실험 일시: 2020년 5월 6일 수요일1. 실험 목적 및 원리7주 차 실험으로 세포의 gDNA 추출을 진행하였다. 첫 번째 실험으로 Extraction buffer를 제작하고, 두 번째 실험으로 gDNA를 추출하였다. gDNA 추출을 위해서는 먼저 세포의 가장 바깥 부분인 세포벽, 또는 세포막을 분해해야 하고, 유출된 DNA를 정제하여 gDNA를 추출할 수 있다. 실험을 통해 gDNA를 추출 과정을 학습하고, 실험에서 이용되는 버퍼와 시료의 기능을 이해할 수 있다.gDNA란 genomic DNA(유전체 DNA)를 의미하며, 세포 하나가 생명 현상을 유지하기 위해 필요로 하는 모든 유전정보를 가지고 있는 DNA이다. DNA 추출 실험에서 목표가 되는 DNA는 세포의 gDNA, circular plasmid, 외부 바이러스 DNA 등 다양하다. DNA를 추출할 때는 DNA에 결합한 단백질, 탄수화물, 지질, RNA등을 포함한 오염 물질을 제거해주는 과정이 필요하고, 분리되는 DNA의 퀄리티는 연구 결과에 직접적인 영향을 미친다. 또한 gDNA 실험을 통해 세포 하나에서 얻을 수 있는 DNA 양은 picogram(10~12g)정도로 매우 적다.세포의 gDNA 추출은 아래 그림과 같은 과정으로 이루어진다.첫 번째로 세포의 수확은 원심분리를 이용해 균체를 포함한 배양액을 회전시킴으로써 진행할 수 있다. 두 번째 세포의 파괴 과정은 세포로부터 DNA를 분리하기 위해 세포 내에 있는 DNA가 세포 밖으로 유출될 수 있도록 세포벽 및 세포막을 파괴하는 것이다. 세포의 파괴는 물리적인 방법과 화학적인 방법으로 나눌 수 있고, 화학적 방법은 화학 약품을 통해서 세포벽을 용해시키는 방법으로 Lytic enzymes, chaotropic agents, different types of detergents 등이 존재한다. 물리적 방법은 기계적인 힘으로 세포를 파괴하는 방법으로, Grinding(분쇄), Shearing(절단), bead beating과 s효소를 세포 파괴 양에 맞게 구매해야 하므로 소량의 세포를 파괴할 경우 값이 저렴하나, 분해해야 하는 세포의 양이 많아지면 비싼 비용이 요구된다. 그램 양성과 그램 음성의 박테리아 세포벽을 파괴할 때 이용할 수 있다. 세 번째로 Detergents를 사용하는 방법이다. 세포막의 인지질을 가용성으로 만들어서 막을 파괴하는 방법이다. 여러 종류의 detergents를 목적에 따라 사용할 수 있다. 막 파괴 정도는 약하고, detergents에 대한 비용이 발생해 가격은 중간 정도이며, 일반 세포에서 두루 사용 가능하다. 네 번째로 Alkaline treatment 방법이다. 이 방법은 Detergents를 이용하는 방법과 유사하게 세포막의 인지질을 가용성으로 만들어서 막을 파괴한다. 막 파괴 정도가 크고, 저렴하며, 주로 plasmid DNA를 추출하는데 이용한다. 이러한 4가지의 화학적 방법 외에도 세포 파괴를 위한 물리적 방법으로 Homogenization, Ultrasomication or vacitation, Pressure cell, Ball mill 등의 방법이 존재하는 등 다양한 방법이 존재하므로 실험 목적에 따라 적절한 방법을 이용할 수 있다.세 번째 과정인 DNA를 추출하고 정제하는 방법으로도 다양한 방법이 존재한다. EtBr을 DNA와 반응 시켜 DNA 밀도 변화를 유발해 원심분리하여 DNA를 바닥에 위치하게 하는 Cesium Chloride Gradient Centrifugation with Ethidium Bromide 방법, 산성 용액을 이용해 RNA, DNA, 단백질을 추출하는 Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction 방법, CTAB가 낮은 이온 강도에서 핵산과 산성 다당류를 침전시키고 고염도 농도에서 용해해 핵산을 얻는 Cetyltrimethylammonium Bromide Extraction 방법, SDS로 세포를 녹여 알칼리성 용액으로 gDNA 등을 변형하는 Alkaline Ext이다.[실험 1] Extraction Buffer 제작첫 번째 실험으로 gDNA를 추출하기 위한 버퍼인 Extraction Buffer와 1x TE Buffer를 제작하였다. 먼저 Extraction Buffer를 제작하였는데, Extraction Buffer의 조성은 200mM Tris-HCl, 25mM EDTA, 250mM NaCl, 0.5% SDS로 구성되어있다. 세포막과 세포벽을 녹이고 gDNA를 추출하는 Extraction Buffer 제작은 크게 2단계로 이루어진다.1) 200mM Tris-HCl pH 7.5는 3차 증류수를 이용하여 200mM Tris 용액을 만든 후, HCl과 NaOH를 이용하여 pH를 7.5로 조정한다. (100mL)Extraction Buffer를 제조하기 위해서는 200mM의 Tris 용액이 필요하다. Tris의 분자량은 121.14g/mol이므로 Extraction Buffer 100mL를 만들기 위해 Tris 가루 2.42g이 필요하다. Tris 가루 2.42g을 유리병에 담고 증류수를 80mL가량 넣어서 Tris 용액을 제작한다. pH를 7.5로 조정해야 하므로, HCl을 첨가하여 pH를 7.5로 맞춘다. pH가 7.5로 조정되었으면, 증류수를 이용하여 전체 부피를 100mL로 맞춰준다. 이를 통해 200mM의 Tris-HCl 100mL이 만들어진다. 이 용액을 Extraction Buffer 제작에 이용할 수 있다.2) pH가 7.5로 조정된 Tris-HCl 시약에 25mM의 EDTA, 250mM의 NaCl, 0.5%의 SDS를 첨가하여 extraction buffer를 제조한다.1)에서 제작한 200mM Tris-HCl 용액을 일부 비커에 담고, EDTA와 NaCl 가루를 넣고 섞는다. EDTA는 농도가 25mM으로 맞춰져야 하고 분자량이 292.25g/mol이므로, EDTA 가루는 0.7306g이 필요하다. NaCl은 농도가 250mM으로 맞춰져야 하고 NaCl의 분자량은 58.44g/mol이므로 NaCl 가루는 0.1211g과 3차 증류수를 이용하여 10mM Tris 용액을 제작하고, 이 용액의 pH를 8.0으로 조절한다.2) pH가 8.0으로 조정된 Tris-HCl 시약에 EDTA의 무게를 재서 1mM의 EDTA가 되도록 EDTA를 추가하여 TE Buffer를 제조한다.1mM EDTA가 되려면 EDTA의 분자량은 292.25g/mol이므로 100mL Buffer를 제작할 때 EDTA 가루는 0.0292g이 필요하다. 1)에서 만든 Tris-HCl 시약에 EDTA 가루 0.0292g을 넣고 교반기를 이용해 섞으면 1x TE Buffer 제작이 완료된다.[실험 2] gDNA 추출두 번째 실험으로 gDNA 추출을 진행하였다. 세포에서 DNA를 추출하기 위해서는 먼저 세포의 가장 바깥 부분인 세포벽 또는 세포막을 분해해야 한다. 이를 위해 첫 번째 실험에서 제작한 Extraction Buffer를 이용하였다. 분해한 후에는 연속된 과정으로 유출된 DNA를 분리하는 과정을 진행해야 하고, 이를 위해 isopropanol을 이용하였다. 원심분리를 통해 DNA를 정제하고, 추출된 DNA를 첫 번째 실험에서 제작한 1x TE Buffer에 녹이고 Spectrophotometer를 이용해 DNA 농도를 확인하였다. 자세한 실험 과정은 아래와 같다.1) 샘플에 Extraction Buffer를 400uL 첨가하여 상온에서 5초간 섞는다.플레이트에 배양된 세포를 트립신 EDTA 시약을 처리하여 바닥으로부터 떼어낸 후, 떼어낸 세포들을 모아 원심분리를 진행하면 세포가 바닥에 하얗게 펠릿을 이룬다. 이 펠릿을 gDNA 추출에 이용하기 위해서 상층액 부위는 제거한다. 그 후 Extraction Buffer를 첨가해 펠릿이 잘 녹도록 하고, 상온에서 섞어준다.2) 원심분리(13,000rpm, 10분, RT)를 실시한다.세포가 잘 섞였으면 ep-tube로 옮겨 담고 원심분리를 진행한다. 13,000rpm에서 10분, 상온에서 진행하고 무게 중심이 맞도록 ep-tube를 위치 시켜 진행한다.3ophotometer를 사용한다. gDNA 양은 매우 적으므로 Spectrophotometer 내부에 시료를 넣을 때 나노컨트플레이트를 이용한다. 나노컨트플레이트를 이용하면 2uL으로 농도를 측정할 수 있다. 한 칸에 2uL의 1x TE Buffer를 넣고 BLANK 값을 측정한다. 그 후 gDNA 샘플을 같은 방식으로 측정하여 gDNA 용액의 농도를 구할 수 있다.4. 실험 결과[실험 1] Extraction Buffer 제작첫 번째 실험으로 Extraction Buffer와 1x TE Buffer를 제작하였다. 먼저 Extraction Buffer를 제작하였는데, Extraction Buffer의 조성은 200mM Tris-HCl, 25mM EDTA, 250mM NaCl, 0.5% SDS로 구성되어있다. 이 조성을 맞추기 위해 100mL의 Extraction buffer에 첨가된 시료는 아래 표와 같다.조성 물질최종 농도구성분자량필요량Tris-HCl200mMTris121.14g/mol2.4228g증류수-총량 100mL 맞추기 위한 용량HCl-pH 7.5로 조정하기 위한 양EDTA25mMEDTA292.25g/mol0.7306gNaCl250mMNaCl58.44g/mol1.461gSDS0.5%SDS-0.5g[표 1] Extraction Buffer 조성다음으로 1x TE Buffer를 제조하였다. 1x TE Buffer의 조성은 10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA로 구성되어 있다. 이 조성을 맞추기 위해 100mL의 1x TE buffer를 제작하기 위해 첨가된 시료는 아래 표와 같다.조성 물질최종 농도구성분자량필요량Tris-HCl10mMTris121.14g/mol0.1211g증류수-총량 100mL 맞추기 위한 용량HCl-pH 8.0으로 조정하기 위한 양EDTA1mMEDTA292.25g/mol0.029g[표 2] 1x TE Buffer 조성[실험 2] gDNA 추출두 번째 실험으로 gDNA 추출을 진행하였다. gDNA를 추출한 뒤 Spec한다.

자연과학| 2020.06.05| 9페이지| 1,000원| 조회(620)

EDTA, SDS, Tris-HCL, gDNA, gDNA 추출, Extractio..

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[생화학] 콜레스테롤 정량

6주. Cholesterol 정량실험 일시: 2020년 4월 29일 금요일1. 실험 목적 및 원리6주 차 실험으로 콜레스테롤 정량을 진행하였다. 콜레스테롤 표준 용액을 준비하여 표준 곡선을 그리고, 도출한 식에 농도를 구하고자 하는 콜레스테롤의 흡광도를 대입하여 농도를 구할 수 있다. 실험을 통해 표준 곡선을 도출하는 방법과 체내를 구성하는 중요한 물질인 콜레스테롤 정량을 이해할 수 있다.콜레스테롤(Cholesterol)이란 흰색의 결정성 물질로 척추동물에서 발견되는 스테로이드 화합물이다. 냄새, 맛이 없고 물에 잘 녹지 않으며, 중성지방, 인지질과 함께 지질로 분류된다. Cholesterol이라는 단어는 그리스어에서 기원하는데, Chloe는 담즙, Stereos는 고체라는 의미를 지닌다. 이는 사람의 담석에서 콜레스테롤을 최초로 분리하는 작용에서 유래한다. 콜레스테롤은 탄소로 이루어진 4개의 소수성 고리를 가진 형태로 존재하며, 한쪽에 친수성 수산기를 가지는 특징이 있다. 콜레스테롤의 구조는 아래 그림과 같다.[그림 1] 콜레스테롤 구조콜레스테롤은 간에서 생성되며, 간에서 나와 혈액을 통해 운반되기 위해서 지단백질 형태로 존재한다. 지단백질은 단백질이 많으면 고밀도, 단백질이 적으면 저밀도로 분류할 수 있고, 지질의 일부인 콜레스테롤은 저밀도지단백질과 초저밀도지단백질에 많이 분포한다.콜레스테롤은 인지질과 함께 세포막을 구성하는 주요 성분으로, 세포 내로 이물질이 들어오는 것을 막고, 세포의 물질 교환, 신호 전달을 쉽게 하며, 세포막의 강도를 결정한다. 체내에서 정상적으로 대사가 되면 담즙산, 성호르몬, 부신피질호르몬 등 생리활성물질로 전환된다. 콜레스테롤은 이러한 중요한 역할을 담당하지만, 혈액 내에 농도가 지나치게 높아지면 문제를 유발할 수 있다. 건강검진 기준에 따르면 혈중 콜레스테롤 농도가 240mg/dL를 초과화면 고농도로 판정하며, 이 경우 혈액의 흐름을 원활하지 못하게 하여 관상동맥질환, 뇌경색 등 죽상 경화성 혈관질환을 유발할 수 있다. 따라서디기토닌을 넣어 유리형 콜레스테롤을 디기토니드로 침전하게 유도하고 빙초산으로 녹여 아세트산 무수물과 진한 황산을 넣어 발색 반응을 하여 정량하는 방법이다. 세 번째로 적정법이다. 이는 일정한 농도의 적혈구 부유액으로 디기토닌 용액을 적정하고 적혈구 내부의 콜레스테롤과 디기토닌이 완전히 결합해 적혈구가 용혈을 일으키지 않을 때까지 기다린 뒤 같은 용액에 피검 콜레스테롤을 넣고 다시 적혈구 부유액으로 적정하고, 적정에 필요한 적혈구 부유액의 부피 차로 혈액의 콜레스테롤을 측정하는 방법이다. 네 번째 방법으로, 이번 실험에서 활용한 분광광도계와 비색법을 이용하는 방법이다.비색법(Colorimetric analysis)이란 색을 측정하여 물질의 유무, 양 등을 파악하는 실험이다. 색은 시료가 흡수하지 않고 반사한 빛으로, 물질의 중요한 특성이며, 흡수율과 투과율과 관련되어 정성, 정량을 위한 실험에 이용할 수 있다. 측정하려는 시료에 색상이 있는 경우 본래의 색을 이용하고, 시료가 투명하여 색상이 없는 경우에는 다른 시약을 가해서 착색해 색을 나타나게 한 색상을 사용한다. 색상을 통해 투과광이나 반사광으로 양자의 농도나 색조를 비교하여 정성, 정량할 수 있다. 이번 실험에서는 콜레스테롤을 정량할 것인데, 콜레스테롤은 투명하기 때문에 착색을 진행해야 한다.비색법을 활용하기 위해서 물질의 흡수율과 투과율을 측정할 수 있는 분광광도계(spectrophotometer)를 이용할 수 있다. 이는 일정 파장의 빛만을 시료에 투과하여 흡수된 정도를 측정하는 장치이다. 광원인 램프에서 일정 범위의 파장으로 빛을 방출하면 단색화 장치에서 프리즘과 슬릿을 적당히 조합해 백색광에서 원하는 단색광을 꺼내어 시료에 특정 파장만이 지나가도록 한다. 시료에 단색광을 쏘면 그 반대 방향에서는 시료에 의해 흡수되지 않고 투과된 빛이 지나고, 이를 검출기에서 측정할 수 있다. 시료의 농도가 높을수록 흡광도가 높고, 투과율이 낮다. Beer-Lambert Law에 따르면 흡광도와 농도는 비례하기 때문로부터 미지 시료의 콜레스테롤 함량을 추정할 것이다.2. 시료, 시약 및 기구[시료, 시약]초산에틸(Ethyl Acetate) 30mL에탄올 용액 30mL0.04mmol FeCl3 용액 7mL콜레스테롤 100mg진한 황산 7mL미지의 콜레스테롤 sample 0.5 mL[기구]원심분리기 - 원심분리에 사용한다.분광 광도계 - 흡광도 측정에 사용한다.96 well plate - 흡광도 측정에 사용한다.파이펫 - 시료를 옮길 때 사용한다.시험관 - 시료 보관에 이용한다.흄 후드 - 진한 황산을 다룰 때 흄 후드 내부에서 진행한다.유리 파이펫 - 진한 황산을 다룰 때 이용한다.3. 실험 방법이번 실험에서는 콜레스테롤 정량을 시행하였다. 실험은 크게 2단계로 분류할 수 있는데, 첫 번째로 표준 정량 곡선을 도출하였고, 두 번째로 콜레스테롤 정량을 수행하였다.첫 번째로 표준 정량 곡선을 그리기 위해서 6종류의 농도(0mg/mL, 0.1mg/mL, 0.25mg/mL, 0.36mg/mL, 0.45mg/mL, 0.55mg/mL)의 콜레스테롤 표준 용액을 제작하였다. 표준 용액을 진한 황산을 이용해 착색하고 흡광도를 측정해 표준 곡선을 그렸다. 해당 식을 통해 미지의 시료의 콜레스테롤 수치를 비교함으로써 콜레스테롤 함량을 추정하였다. 자세한 내용은 아래와 같다.1) 초산에틸과 에탄올 용액을 1:1로 혼합한다. (초산에틸-에탄올 혼합액)초산에틸-에탄올 혼합액을 제작하기 위해서, 초산에틸에 동일한 부피의 에탄올을 넣는다. 실험에서는 25mL의 초산에틸을 사용했고, 따라서 25mL의 에탄올을 사용했다.2) 콜레스테롤 25mg을 초산에틸 에탄올 용액에 녹여 25mL를 만든다. (콜레스테롤 표준 용액)콜레스테롤 표준 용액 25mL을 제작하기 위해 1)에서 제작한 초산에틸-에탄올 혼합 용액을 25mL 측정하여 튜브에 넣고, 콜레스테롤 25mg을 측정하여 용액에 넣는다.3) 표준 곡선을 구하기 위해 시험관에 아래 표와 같이 콜레스테롤 표준 용액, 초산에틸 에탄올 혼합액, 증류수를 넣고 잘 무게중심이 맞게 배치해야 하고, 3,000rpm, 4℃의 환경에서 5분간 진행한다.4) 상층액 0.5mL를 시험관에 각각 취한다.센트리퓨즈를 마친 시료는 상층액 0.5mL를 따서 새로운 유리병으로 옮긴다.5) 0.04mmol FeCl3 용액 1mL를 가하고 잘 섞는다.0.04mmol FeCl3 용액을 제작하기 위한 조성을 살펴보면 FeCl3의 분자량은 162.2g/mol이므로 0.04mmol, 즉 0.0004mol의 FeCl3는 0.0645g이다. FeCl3 0.0645g을 glacial acetic acid 100mL에 혼합하면 0.04mmol FeCl3를 제작할 수 있다. 이렇게 제작된 0.04mmol FeCl3 용액을 시험관별로 1mL씩 넣고, 시료와 FeCl3이 잘 섞일 수 있도록 vortexing을 통해서 섞는다.6) 진한 황산 1mL를 가하여 즉시 섞고 상온에서 냉각시킨다.진한 황산은 매우 유독하고 반응성이 좋은 물질이므로 다룰 때는 항상 흄 후드 내에서 작업해야 하고, 유리파이펫을 사용하여 옮겨야 한다. 진한 황산을 유리파이펫을 이용해 샘플마다 1mL씩 넣는다. 진한 황산을 넣으면 실린더 내부에서 발열반응이 일어나기 때문에 상온에서 이 발열반응이 식을 때까지 냉각한다. 또한 황산과 콜레스테롤 표준 용액이 잘 섞일 수 있도록 유리관의 윗부분을 잡고 흔들어 주면 반응하는 샘플들이 잘 섞이는 것을 확인할 수 있다.7) 96 well에 200uL씩 각각 분주하여 550nm에서 흡광도를 측정한다.제작한 콜레스테롤 표준 용액을 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.8) 흡광도 값을 이용하여 표준 곡선을 그린다.흡광도 데이터는 엑셀 형태로 기록되며, 엑셀 내 기능을 이용해 콜레스테롤 표준 정량곡선을 그릴 수 있다. 콜레스테롤 농도를 x축, 흡광도를 y축으로 둔 분산형 그래프를 그리고, 분산형 그래프에 대한 직선형 추세선을 도출한다. 그 후 추세선에 대한 1차 함수와 함수의 설명력을 나타내는 결정계수 값을 구한다. 결정계수 값이 0.95 이상이면 그 함수한다. 센트리퓨즈를 마친 미지 시료의 상층액 0.5mL를 따서 새로운 유리병으로 옮기고, 0.04mmol의 FeCl3 용액 1mL를 담고, 두 시료가 잘 섞일 수 있도록 vortexing을 진행한다. 마지막으로 진한 황산을 1mL 첨가하는데, 진한 황산은 유독성 물질이므로 흄 후드 내에서 작업해야 한다다. 또한 황산이 잘 섞일 수 있도록 시험관 위를 잡고 흔들어주고 상온에서 냉각시킨다. 제작된 시료의 흡광도를 측정하고, 앞서 도출한 표준 정량곡선에 대입하면 미지의 시료의 콜레스테롤 농도를 구할 수 있다.4. 실험 결과먼저, 콜레스테롤 표준 용액을 이용해 콜레스테롤 표준 정량 곡선을 도출하였다. 이를 위해 6종류의 농도(0mg/mL, 0.1mg/mL, 0.25mg/mL, 0.36mg/mL, 0.45mg/mL, 0.55mg/ml)의 콜레스테롤 표준 용액을 제작하였다. spectrophotometer를 이용하여 각 용액의 흡광도를 측정하였고, 결괏값은 아래와 같다.[표 2] 흡광도 측정 결과다음으로 표준 정량 곡선을 그리기 위해서 x축에 활용할 콜레스테롤 농도 값과 y축에 활용할 흡광도 값을 표로 제작하였다.[표 3] 콜레스테롤 농도와 흡광도 값위의 표를 활용하여 콜레스테롤 농도를 x 값, 흡광도를 y값으로 정하여 표준 정량 곡선을 그리고, 추세선 1차 함수식과 결정계수 값을 도출하였다. 결과는 아래 그래프와 같다.[그래프 1] 콜레스테롤 표준 정량 곡선그래프의 결정계수가 0.9917로 높게 도출되었고, 이는 신뢰할 수 있는 수치이다. 이 추세선에서 나온 일차식인 'y=1.625x+0.0533'을 활용하여 농도를 구하고자 하는 미지 시료의 콜레스테롤 농도를 구할 수 있다.미지 시료의 흡광도 값은 0.1127이므로 이 값을 y값에 대입하면 x값인 콜레스테롤의 농도는 0.037mg/ml이다. 즉 이번 실험의 목표였던 미지 시료의 콜레스테롤 농도를 도출해낸 것이다.5. 고찰이번 실험에서는 콜레스테롤 표준 용액을 활용하여 콜레스테롤 표준 정량 곡선을 그리고, 미지의 시료의다.

자연과학| 2020.06.05| 8페이지| 1,000원| 조회(410)

초산에틸, 콜레스테롤, 비색법

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[생화학] cDNA 제작

10주. cDNA 제작실험 일시: 2020년 5월 27일 수요일1. 실험 목적 및 원리10주 차 실험으로 cDNA를 제작하는 실험을 진행하였다. cDNA란 상보적 DNA (complementary DNA)로 전령 RNA (messenger RNA)에 상보적 배열을 가진 DNA이다. 즉 cDNA는 RNA 서열을 기반으로 합성한 DNA이다. DNA 서열을 기반으로 RNA를 합성하는 전사는 체내에서 일반적으로 발생하지만, RNA 서열을 기반으로 DNA를 합성하는 과정은 사람의 체내에서 일반적으로 일어나지 않는 과정이다. 이는 ‘역전사’라고 한다. 과거에는 역전사는 발생하지 않으리라 생각했는데, 유전 정보는 DNA -> RNA -> 단백질의 단일 흐름으로만 전달된다고 생각했기 때문이다. 따라서 역전사는 굉장히 흥미로운 과정이다.유전 정보의 흐름 경로는 1950년대 영국의 분자생물학자 크릭(Francis Crick)이 주장한 '중심원리(Central Dogma)'가 정설로 받아지고 있다. mRNA의 서열은 RNA 분자의 주형이며, RNA는 세포질에서 단백질 아미노산의 배열을 결정한다는 가설이다. 그 과정은 아래 사진과 같다.[그림 1] 센트럴 도그마그림에서 화살표는 유전 정보의 이동 방향을 나타낸다. DNA는 자가 복제를 할 수 있고, 이 과정은 복제(Replication)라고 부른다. DNA를 주형으로 RNA를 합성할 수 있고, 이것은 전사(Transcription)이다. 마지막으로 전사를 거쳐 형성된 RNA 주형에 따라 단백질이 합성되고, 이는 번역(Translation) 과정이다. 센트럴 도그마에서 중요한 것은 화살표가 한쪽으로 흐른다는 것이다. DNA 주형에 의해 RNA가 만들어질 수는 있지만, RNA 주형에 의해 DNA가 만들어질 수는 없다고 믿어졌다. 그리고 단백질에 의해 RNA가 만들어질 수도 없다. 센트럴 도그마는 현재까지도 대부분 맞으나, RNA 사슬은 가끔 상보적인 DNA 사슬의 주형 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 몇 바이러스에서 전사의 반대과정, 즉 발현 흐름은 RNA -> DNA -> RNA -> 단백질 순이다. 특이하게 RNA에서 DNA로 흐르는 역전사의 과정을 거치는 것을 발견한 것이다.역전사를 발견한 것은 RNA -> DNA의 유전정보 흐름을 밝혔다는 점에서도 매우 의의가 있으며, 또한 역전사효소를 이용해 시험관 내에서 mRNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 만들 수 있게 되어 핵산 연구의 새로운 지평을 열었다는 점에서도 의미가 있다. 이를 통해 DNA 서열이 없어도 RNA로부터 DNA를 합성할 수 있게 되었다. 이중나선으로 이루어져 복잡하고 안정되게 구성된 DNA보다, 생성되고 없어지고를 반복하며 단일나선으로 존재하는 RNA는 조작이 용이하다. RNA를 쉽게 조작함으로써 원하는 DNA를 만들어내는 유전자 편집 기술까지 도달할 수 있게 된 것이다. 이처럼 RNA로부터 cDNA를 만드는 것은 매우 중요한 실험이며, 이번 실험에서는 해당 실험을 진행하여 원리를 이해하고 cDNA 농도를 도출하였다. 실험에 앞서서 역전사에 대해서 더 알아보자.역전사 과정에 관여하는 인자로 역전사 효소(Reverse Transcriptase)가 있다. 이는 RNA를 주형으로 단일 가닥 DNA를 합성하는 효소이다. RNA의 서열을 기반으로 역전사하므로 RNA 의존성 DNA 중합효소라고도 부른다. 또한 역전사 과정에는 Primer도 이용된다. 핵산을 만드는 과정으로 DNA 정보로 DNA를 만드는 복제, DNA 정보로 RNA를 만드는 전사가 있는데, DNA를 만들기 위해서는 Primer가 필요하고, RNA를 만들기 위해서는 필요하지 않다. 따라서 Primer는 복제에서는 필요하나 전사에서는 필요하지 않다. 그러나 역전사는 RNA를 기반으로 DNA를 만드는 과정이므로, 결국 생성되는 산물이 DNA이기 때문에 Primer가 필요하다는 특징이 있다.실험에서 역전사를 위한 Primer를 넣어줘야 하는데, 실험실에서 사용하는 역전사 Primer에는 크게 3종류가 있다. 첫 번째로 Oligo(dT)s (or anchored oligo(P, 효소 활성을 위한 적절한 Buffer도 필요하다.이러한 재료들을 사용해 역전사를 유발하여 생성된 cDNA는 일반적인 DNA와 차이가 있다. 먼저 cDNA는 단일 가닥 형태이기 때문에 이중 가닥의 DNA보다 안정하지 못하다. 따라서 구조적 변형이 쉽게 일어나고, 선형이나 필라멘트 형태를 띠는 이중 가닥 DNA와 달리 cDNA는 별 모양을 띤다. 또한 이중 가닥 DNA는 염기 간 결합을 이루므로 A와 T, G와 C의 비율은 1이다. 그러나 base pairing을 이루지 않는 cDNA의 A:T 비율은 0.77, G:C의 비율은 1.3으로 1이 아니라는 특징을 갖는다.이처럼 cDNA는 일반적인 DNA와 다른데, cDNA는 역전사 과정을 거쳐 단일 가닥으로 생성되었기 때문이다. 이번 실험에서는 역전사 과정을 거쳐 cDNA를 제작함으로써 역전사를 이해하고, RNA를 기반으로 단일 가닥의 cDNA를 제작할 수 있다.2. 시료, 시약 및 기구[시료, 시약]RNA sample 2.13uL0.1% DEPC water 8.47uLRandom primer 1uL5x reaction buffer 4uL25mM MgCl2 2.4uL10mM dNTP MIX 1uL (25umol dATP, 25umol dCTP, 25umol dGTP, 25umol dTTP, in autoclaved water)Reverse Transcriptase 1uL[기구]PCR tubeSpin-down 기기3. 실험 방법이번 실험에서는 지난 실험에서 추출한 RNA로부터 세포의 cDNA를 제작하였다. 역전사를 위한 시료를 RNA sample과 섞고 PCR 기계를 이용해 온도를 적절하게 조절함으로써 역전사를 일으켜 cDNA를 제작하였다.PCR이란 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)이며 2개의 primer 사이에 낀 핵산을 제작하는 방법이다. 이번 실험에서는 Random primer를 이용해 사이에 낀 RNA 가닥을 기반으로 cDNA를 합성하였다. PCR 기계를 이용하므로, 시료는 13uL가 필요한 것을 계산을 통해 구할 수 있다. 표 1에서 RNA 용량은 X uL로 되어있는데, 이번 실험에서 X값은 2.13이 되는 것이다. DEPC Water와 RNA의 총량이 10.6uL가 되어야 하므로 DEPC Water는 8.47uL가 필요하다. 따라서 DEPC Water 10.6uL을 준비하고, 여기에 RNA Sample 2.13uL를 희석한다.2) Random Primer 1uL를 첨가한다.RNA를 희석한 DEPC water에 Random Primer 1uL를 더하여 총 부피를 11.6uL로 만든다.3) Spin-down을 진행한다.본격적인 cDNA 합성을 시작하기 전, DEPC water에 RNA가 잘 녹고 Random Primer와 잘 섞일 수 있도록 PCR 튜브를 스핀다운 기기를 사용해서 섞는다.4) PCR 기계에 넣고 스텝 1을 수행한다.스핀 다운이 완료되면 PCR을 진행한다. PCR 기계에 넣고 역전사를 위한 온도와 시간으로 설정한다. 스텝은 총 여섯 가지가 있으며 아래 표와 같다.Step온도시간1단계70℃5분2단계4℃30분3단계25℃5분4단계42℃1시간5단계70℃15분6단계4℃∞[표 2] PCR 기계 설정표의 온도와 시간으로 PCR 기계를 설정하고 기계를 실행한다.5) Master Mix를 제작한다.역전사를 위한 재료로 RNA template, Reverse Transcriptase, Primers, dNTPs, Buffer가 필요한데, 앞서 RNA template, Primer, Buffer를 넣었으므로 Reverse Transcriptase, Primers를 넣어야 한다. 또한 역전사 과정을 돕는 마그네슘이 필요하므로 MgCl2를 넣고, reaction buffer도 넣는다. 따라서 Master Mix는 10mM dNTP MIX 1uL, Reverse Transcriptase 1uL, 5x reaction buffer 4uL, 25mM MgCl2 2.4uL로 구성된다.주의해야 할 사항으로, 역전사효소는 온도에 매우 민감하다. 따라PCR 기계에 놓는다. 앞서 식히는 과정을 진행했으므로 step 2를 스킵하고 step 3부터 다시 시작한다. 이후 step이 수행되면서 역전사가 이루어진다.모든 step이 완료되면 샘플을 꺼내 얼음 위에 두고 PCR 기계의 작업을 취소하고, 홈 화면으로 세팅한 뒤 전원을 끈다.8) 제작된 cDNA를 autoclaved water에 녹인다.PCR 기계의 모든 step을 수행하면 역전사가 완료되어 cDNA가 제작된다. 제작된 cDNA를 autoclaved water에 녹여서 희석한다. 제작된 cDNA는 20uL이며, autoclaved water는 180uL를 넣어 총 부피를 200uL로 맞춘다.9) cDNA의 농도를 측정한다.Spectrophotometer와 나노퀀트플레이트를 사용하여 cDNA의 농도를 측정한다. Autoclaved water에 cDNA를 녹였으므로 블랭크 값은 autoclaved water로 측정한다. 다음으로 제작한 cDNA를 2uL씩 세 군데에 분주하고 농도를 측정한다.4, 실험 결과cDNA 제작 실험의 결과는 아래 표와 같다.cDNA260 O.D.280 O.D.Conc. ng/uLRatio1반복0.08130.045553.661.792반복0.07980.043452.671.863반복0.08040.044653.031.8평균0.08050.044553.121.82[표 3] 실험 결과샘플을 2uL 씩 3개의 well에서 흡광도를 측정하였으므로 3개의 결괏값이 나왔다. 세 결괏값의 평균값이 제작한 cDNA의 결과이다. 260nm에서 흡광도는 0.0805, 280nm에서 흡광도는 0.0445로 측정되었다. cDNA 농도는 53.12ng/ul이고, A260/A280 비율은 1.82이다.5. 고찰cDNA를 제작하는 이번 실험은 PCR 기계를 사용해 이루어졌다. PCR 기계에 적절한 시간과 온도를 설정하여 역전사를 가능한 환경을 만들었는데, 그 그래프는 아래와 같다.[그래프 1] PCR 기기 설정단계별로 시간과 온도를 설정한 이유를 알아봄으로써 cDNA 합괴한다.

자연과학| 2020.06.05| 8페이지| 1,000원| 조회(327)

PCR, cDNA, 역전사, 역전사 효소

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[생화학] 세포의 RNA 추출 평가A+최고예요

9주. 세포의 RNA 추출실험 일시: 2020년 5월 20일 수요일1. 실험 목적 및 원리9주 차 실험으로 세포의 RNA를 추출하는 실험을 진행하였다. RNA는 유전자 정보를 매개하고, 유전자 발현의 조절 등에 관여하는 핵산이다. 생명체의 DNA에 유전자가 보관되어 있지만, DNA의 정보는 RNA의 형태가 되어야 단백질을 생산할 수 있다. RNA는 유전자 발현에 필수적인 역할을 하므로 매우 중요한 핵산이며, RNA에 관한 많은 실험이 이루어져 센트럴 도그마를 비롯한 유전자 발현 과정을 자세히 규명하게 되었다. RNA를 활용한 실험을 위해 세포 내부의 RNA를 추출하는 과정이 필수적이지만, RNA는 RNase의 작용으로 분리가 DNA보다 까다롭다. 이번 실험에서는 RNase를 억제하면서 손상되지 않은 RNA를 추출하는 방법을 알아봄으로써 유전자 발현에서 중요한 역할을 하는 RNA를 추출하는 방법을 이해하고, DNA 추출과의 비교를 통해 차이점을 파악하고 차이점이 발생한 이유를 분석할 수 있다.RNA(Ribonucleic acids)는 Ribonucleotide 들의 phosphodiester 결합으로 형성된 polymer이다. Ribonucleotide는 ‘ribose’라는 5탄당과 A, C, G, U로 구성된 염기, 인산이 결합한 단량체이고, 이들이 결합해 RNA가 된다. RNA는 매우 중요한데, 그 이유는 RNA가 유전 정보 발현에 관여하기 때문이다. DNA에 저장된 유전 정보가 어떤 과정을 거쳐 발현되는지를 살펴보면, DNA의 염기서열이 상보적 염기서열로 바뀌어 RNA 분자에 기록되는 전사 과정, RNA 서열에 따라 아미노산을 운반해 리보솜에서 단백질이 생산되는 번역 과정을 거친다. 즉 DNA의 정보는 바로 단백질로 발현되지 않고, RNA를 거쳐야만 유전자 발현이 이루어질 수 있다.RNA에는 다양한 종류가 존재하고, 다양한 기능을 수행한다. 앞서 소개한 단백질의 아미노산 서열을 지정하는 RNA는 mRNA이다. 유전자 발현에 관여하는 다른 중요한 RNA로 t하다. 세포막을 파괴해서 핵산이 나오게 하는 과정은 비슷하나, DNA와 RNA 추출 실험의 가장 큰 차이는 RNA 추출 실험에는 RNase 오염이 발생할 수 있다는 점이다. RNase는 RNA를 분해하는 효소로, RNA를 오염시켜 degradation을 유발할 수 있다. 따라서 정확한 실험을 위해서 RNase를 억제해야 하는데, 용액에 Diethyl pyrocarbonate(DEPC)를 첨가함으로써 억제할 수 있다. DEPC는 R그룹을 다른 물질에 붙이는 Alkylating agent의 일종으로, 단백질 잔기의 변형을 유발하여 RNase를 억제한다. DEPC의 존재는 변화를 원하지 않는 다른 성분도 변형시킬 수 있어서 RNase의 억제가 충분히 이루어지면 없애줘야 한다. 가압멸균을 통해 DEPC를 CO2와 에탄올로 분해할 수 있다.세포는 핵과 핵 외의 부분인 세포질로 나뉜다. RNA 분리에는 두 종류가 있는데, 핵 외의 세포질의 RNA만 분리하는 경우, 핵과 세포질 모두, 즉 전체 세포 RNA를 분리하는 경우이다. 세포질 RNA를 분리하면 주로 rRNA, tRNA를 얻고, 핵에서 나와 세포질에 존재하는 가공이 완료된 mRNA를 얻는다. 전체 세포의 RNA를 분리하면 핵 안에 존재하는 초기의 mRNA도 함께 얻는다.세포질 RNA 분리는 세포막을 파괴해서 세포질이 나오게 하는 방법으로 이루어진다. 세포나 원핵생물을 저삼투압 용액으로 용해해서 세포막을 파괴할 수 있다. 원심분리를 하여 세포질 외의 찌꺼기 부분과 핵막으로 둘러싸인 핵을 제거한다. RNase 억제를 위해 SDS를 추가하고, Proteinase K를 이용해 리보솜으로부터 rRNA를 분리한다. Phenol-chloroform 추출로 오염 단백질을 제거하고, 에탄올을 첨가해 RNA를 침전시키면 RNA 분리가 완료된다.전체 세포 RNA 분리는 핵막까지 파괴해야 하기 때문에 격렬한 cell lysis가 요구된다. 또한 전체 세포 RNA 분리는 Caesium chloride를 이용해 원심분리하는데, 이때 세포질 하층에는 유기층이 형성된다. 분리된 sample에서 isopropanol은 수성층의 RNA를 침전하는 역할을 하고, 바닥의 펠릿을 활용해 RNA를 추출할 수 있다.RNA를 분리한 뒤 분리된 RNA의 순도를 평가할 수 있다. 260nm에서의 흡광도를 280nm에서의 흡광도로 나눈 값이 2.0 이상이면 순도가 높고, 1.6 이하이면 순도가 낮다고 판단한다.RNA는 유전자 발현 과정에서 중요한 역할을 하므로 체내에서 매우 중요한 성분이다. 이번 실험을 통해 RNA를 깊게 이해할 수 있고, RNA와 관련된 실험의 핵심 과정인 세포의 RNA 추출 실험을 진행할 수 있다.2. 시료, 시약 및 기구[시료, 시약]RNA sample(조직, 세포, 혈액)0.1% DEPC75% EtOH in DEPCTrizol reagentchloroformisopropanolcold PBS[기구]스파츌라 - 세포를 긁어낸다.원심분리 기기 - 세 차례의 원심분리를 실행한다.Spectrophotometer - 흡광도를 측정하여 핵산의 양을 구한다.나노퀀트플레이트 - 핵산의 양이 적으므로 흡광도를 측정할 때, 적은 양을 위한 plate를 사용한다.3. 실험 방법이번 실험에서는 세포의 RNA를 추출하는 실험을 하였다. 유전자 발현과 그 기능을 조사하는 첫 번째 단계인 RNA 추출 방법을 익히고, 같은 핵산인 DNA 추출 방법과 실험 방법이 다른 이유를 이해할 수 있다. Trizol reagent를 이용하였고, 원심분리를 통해 RNA를 추출하였다.RNA는 DNA처럼 안정한 상태가 아닌 단일 가닥의 불안정한 상태이기 때문에 변화가 쉽게 일어나므로 주의해야 한다. 이를 위해서 RNA 추출에 사용되는 모든 공간, 기기 파이펫 등을 70% EtOH를 이용해 닦아야 한다. 또한 RNase에 의한 손상을 막기 위해 튜브나 파이펫 팁 등 사용하는 모든 제품은 Nuclease-free lab ware를 사용한다. reagent 또한 RNase-free reagents를 사용한다. 사람의 피부에도 RNase가 분비되 담아 실험에 이용한다. ep-tube에 chloroform 100uL을 넣고 inverting 하여 잘 섞어준다.3) 얼음 위에 2~3분 정치 후 4℃, 12,000g, 15min의 조건으로 원심분리한다.섞은 ep-tube는 얼음에서 2~3분간 정치한 뒤, 원심분리를 진행한다. 12,000rcf, 4℃의 환경에서 15분간 원심분리를 진행한다.4) 상층액을 취해 다른 ep-tube에 옮긴 후 isopropanol 250uL를 넣고 10회 inverting 한다.원심분리가 완료된 샘플은 Chloroform에 의해 상층인 수성층과 하층인 유기층으로 분리된 형태이다. 수성층에 RNA가 녹아있으므로, 상층을 따서 새로운 ep-tube로 옮긴다. 수성층과 유기층 사이에 하얀색의 경계 부분이 있는데, 이 부분과 유기층은 팁에 닿지 않도록 하여 수성층만 분리한다. 이후 Isopropanol을 250uL 넣고 잘 섞이도록 inverting 한다.5) 얼음 위 10분 정치 후, 4℃, 12,000g, 10min 조건으로 원심분리한다.inverting을 마치고 얼음 위에서 10분간 샘플을 정치하고, 12,000 rfc, 4℃에서 10분간 원심분리를 진행한다.6) 상층액을 조심스럽게 제거하고, 75% ethanol in DEPC water 500uL을 넣고 inverting 한다. (washing 단계)앞서 첨가한 Isopropanol은 수성층에 존재하는 RNA를 침전하게 한다. 따라서 원심분리가 완료되면 아랫부분에 RNA가 모이게 되고, 펠릿이 형성된다. RNA는 아래쪽에 모여있으므로 상층액 부분은 제거한다. 이후 세포를 washing 해주기 위해 75% ethanol in DEPC water를 넣는다. DEPC는 RNase를 억제하고, 에탄올은 RNA 침전을 돕는다.7) 4℃, 7,500g, 5min 조건으로 원심분리한다.7,500rcf, 4℃에서 5분간 원심분리를 진행한다.8) 상층액만 조심스럽게 제거 후, 실험용 티슈를 이용하여 남은 물기를 제거한다.에탄올에 의해 RNA가C를 이용해 희석한다.4. 실험 결과9주 차 실험으로 Trizol reagent를 이용해 RNA를 추출하였다. RNA를 추출하고 Spectrophotometer를 활용해 도출한 결과는 아래 표와 같다.[표 1] RNA 추출 결과샘플을 2uL 씩 3개의 well에서 흡광도를 측정하였으므로 A1, A2, B1 well에서의 결과 값이 나왔다. 세 결과 값의 평균값이 샘플의 RNA를 추출한 결과이다. 260nm에서 흡광도는 0.5865, 280nm에서 흡광도는 0.3203으로 측정되었다. RNA 농도는 469.25ng/ul이고, A260/A280 비율은 1.83이다.5. 고찰이번 실험에서는 세포에서 RNA를 추출하였다. 실험 과정에서 원심분리 3번의 의미, 실험 결과 값인 흡광도와 농도의 관계, A260/A280 ratio의 의미, DNA 추출과의 비교 순으로 실험의 의미를 고찰하였다.실험에서는 3번의 원심분리를 진행했는데, 첫 번째 원심분리를 한 뒤에는 상층액을 사용하고, 두 번째와 세 번째 원심분리를 한 뒤에는 가라앉은 펠릿을 사용한다. 이러한 차이는 어떤 시료를 넣고 원심분리를 진행했는가에 따른 차이이다. 원심 분리 세 번은 Chloroform을 넣은 뒤, Isopropanol을 넣은 뒤, 75% ethanol in DEPC water를 넣은 뒤의 과정에서 진행하였다. 첫 번째로 Chloroform을 첨가하면 추출물을 상층인 수성층과 하층인 유기층으로 분리한다. 따라서 RNA는 상층에 위치하므로 상층만을 따서 실험에 활용한다. 두 번째로 Isopropanol은 수성층에 존재하는 RNA를 침전시키는 역할을 하므로, 가라앉은 펠릿만을 실험에 사용하기 위해서 상층액 부분은 제거한다. 세 번째로 75% ethanol in DEPC water는 에탄올이 Isopropanol과 유사하게 RNA를 침전하는 역할을 하므로 이때도 가라앉은 펠릿만을 이용하기 위해 상층액을 제거한다. 펠릿을 따서 RNase를 억제하는 DEPC water에 넣으면 세포에서 RNA의 추출이 완료된다다.

자연과학| 2020.06.05| 8페이지| 1,000원| 조회(1,504)

RNA, RNA 추출, Trizol, EtOH, RNAase

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[생화학] Agarose Gel 제작 및 DNA 분리

8주. Agarose Gel 제작 및 DNA 분리실험 일시: 2020년 5월 13일1. 실험 목적 및 원리8주 차 실험으로 Agarose gel을 제작하고 DNA를 분리하는 실험을 진행하였다. DNA는 유전 정보를 담고 있어 매우 중요한 물질로, DNA를 분석하고 이해하는 것은 매우 중요하다. DNA 분석을 위한 첫 단계로, DNA의 크기를 파악하는 과정이 필요하다. 이번 실험에서는 Agarose gel을 만들고 전기영동을 진행하여 DNA를 분리해 DNA의 양을 파악하였다. 실험을 통해 DNA 분리 과정을 이해하고 DNA 분리를 위해 적절히 DNA를 조작하는 방법을 파악함으로써 DNA를 이해할 수 있다.DNA 분리 실험은 첫 번째로 DNA를 젤에 넣는 DNA loading, 두 번째로 전류를 가해서 DNA가 양전하 방향으로 이동하도록 하는 전기영동, 세 번째로 크기별로 DNA가 젤 상에서 다르게 이동함으로써 크기에 따라 분리되는 DNA의 절단 및 분리, 네 번째로 DNA의 분리 결과를 확인하는 DNA band 관찰의 과정을 거쳐 진행된다.실험에서 제작한 Agarose gel은 DNA 분리 실험의 첫 번째 단계인 DNA loading 과정을 위해 필요한 겔이다. 겔은 DNA가 분리되는 전기영동 상의 matrix이다. 아가로스 겔은 한천을 이용해 제조하며, 3차원 구조를 띤다. 한천이란 우뭇가사리과의 해초를 활용해 일련의 과정(추출, 농축, 냉각, 응고, 동결, 용융)을 거치고 건조해 만든 것이다. 한천의 주성분은 아가로스로, 그 70%를 차지한다. 아가로스는 유연하면서 단단한 구조를 이루고, 물에 녹는 다양한 물질을 잡아두는 성질이 있어 겔로 사용된다. 아가로스를 buffer에 용해한 후 가열하여 녹이고, 이를 식히면 아가로스 겔이 된다. 이때 가운데 구멍이 생겨서 크기에 따라 분자가 통과할 수 있도록 한다. 이 구멍을 이용하여 DNA를 분리할 수 있다.아가로스 겔을 전기영동에 활용하면 전하, 크기, 모양을 토대로 분자를 분리할 수 있다. 이 방법은 DNA, Rell의 순서에 따라 1, 2, 3… lane으로 부르며, 각 well에 DNA를 loading 한다. DNA를 로딩할 때는 DNA Loading Dye를 사용한다. DNA가 색상이 없어 보이지 않아 겔 상에서 얼마나 이동했는지 확인이 어려워 dye를 활용해 DNA의 이동을 시각으로 확인하고자 함이다. 또한 순수한 DNA 시료는 전기영동 버퍼보다 밀도가 작아서 아가로스 well에 잘 들어가지 않아 밀도를 높여 well에 잘 가라앉도록 하기 위한 목적도 있다. 즉 DNA loading dye는 색상을 입히고 밀도를 높이는 역할을 하는 것이다. 색상을 입히기 위해 시료로 Bromophenol blue, Xylene cyanol FF 등을 이용하고, 밀도를 높이기 위해 Glycerol을 이용한다. 또한 DNA를 로딩할 때, DNA sample만을 로딩하는 것이 아니고 마커의 용도인 DNA ladder를 함께 로딩한다. 이미 크기를 알고 있는 DNA 조각을 활용해 이동한 정도를 확인함으로써 크기를 알고자 하는 미지의 DNA가 어느 크기를 가진 것과 유사하게 이동하는지 관찰하여 크기를 파악하고자 함이다.DNA 분리의 두 번째 단계는 젤 전기영동(Gel Electrophoresis)이다. 전기장에서 전하를 띤 분자들이 가지고 있는 전하와 반대 방향으로 이동하는 원리를 이용한다. DNA를 아가로스 겔에 로딩하고 전기영동 시키면 음전하를 띠는 DNA는 양전하로 이동한다. 이때 DNA는 Agarose gel에 의해 크기별로 다른 속도로 이동하므로 DNA 분리가 가능하다. 크기가 작을수록 겔에 의한 방해가 적어 빠르게 이동하고, 멀리 간다.DNA 분리의 세 번째 단계는 DNA의 절단 및 분리이다. 인간의 DNA는 약 30억 염기쌍으로 이루어져 있고, DNA가 비교적 짧은 박테리아도 13만~1,400만 염기쌍의 길이를 가지므로 실험이 어렵다. 염기쌍의 길이가 길면 분석이 어려우므로 실험에서는 길이가 짧은 DNA를 주로 활용하고, 길이가 짧은 대표적인 DNA로 Plasmid DNA서 많이 사용하는 염색약으로 EtBr(Ethidum Bromide)가 있다. 이는 DNA 이중가닥 사이에 들어가서 결합하며 UV에 노출되었을 때 가시광선으로 변한다. 그러나 EtBr는 발암물질로 위험하기 때문에 최근에는 비슷한 작용으로 작동하는 Red Safe를 사용한다. Red Safe도 DNA 이중가닥 사이에 결합하며, UV에 노출되면 녹색 형광을 발색한다는 특징이 있다. 시료를 염색하고 전기영동한 후 UV를 쬐어주며 Band를 관찰할 수 있다. 앞서 샘플과 같이 로딩한 ladder와 비교해 크기를 확인한다. 또한 Band가 두꺼울수록 DNA의 양이 상대적으로 많은 것으로, 양적인 비교도 가능하다.이처럼 DNA 분리는 DNA Loading, 젤 전기영동, DNA의 절단 및 분리, DNA Band 관찰 과정을 통해 이뤄지며, 이번 실험에서도 이 방식으로 DNA 분리를 진행하였다. 먼저 Agarose Gel을 제작하였고, 제한효소를 사용해 DNA를 자르는 등의 조절을 진행하였다. 다음으로 겔에 크기를 알고자 하는 DNA를 로딩하고 젤 전기영동을 수행하여 결과를 도출하였다.2. 시료, 시약 및 기구[시료, 시약]0.5x TAE buffer 100mL- 2M Tris Acetate- 0.05M EDTA- 증류수Agarose 0.75gRed Safe 5μL증류수6x DNA loading buffer1Kb DNA ladder10x Ez buffer ⅡgDNAplasmid vector(PLKO-Tet-puro)제한효소 AgeⅠ제한효소 EcoRⅠ[기구]heat block 기계 - 제한효소와 plasmid vector 작용 도움전기영동 기계 - 전기영동 수행Ex Capture - UV 조사3. 실험 방법8주 차 실험으로 Agarose Gel을 제작하고 DNA를 분리하는 실험을 진행하였다. gDNA와 Plasmid를 Agarose gel을 이용해 전기영동 하여 분석하는 것을 목적으로 한다.[Agarose Gel 제작]1) Agarose 0.75%(w/v)를 저울로 재어 플라였다. 벡터란 유전자를 실어 나르는 운반체로, plasmid vector는 플라스미드로 이루어진 유전자 운반체를 의미한다. 아무것도 처리하지 않은 plasmid vector와 제한 효소를 한 가지만 처리한 plasmid vector, 제한 효소를 두 가지 처리한 plasmid vector로 나눠서 실험을 진행하였다. plasmid vector로는 PLKO-Tet-puro를 이용하였고, 사이즈는 약 만 염기쌍 크기이다.아무것도 처리하지 않은 plasmid vector는 3μL plasmid vector와 증류수 7μL로 제작하였다. 제한효소를 처리한 plasmid vector 제작을 위해 사용된 제한 효소는 AgeⅠ과 EcoRⅠ두 가지이다. 또한 제한효소를 처리했다면 10x Ez buffer Ⅱ를 넣어 제한효소가 제대로 반응할 수 있도록 돕는다.제한효소를 처리한 plasmid vector는 37℃ heat block에서 2시간 반응 시켜 plasmid vector가 잘 절단될 수 있도록 한다.2) 전기영동 장치에 0.5x TAE buffer를 채우고, 만들어 놓은 agarose gel을 넣는다.앞서 제작한 Agarose gel이 상온에서 다 굳으면 원하는 크기를 선택해서 실험에 이용할 수 있다. 이번 실험에서는 5개의 홈이 필요하기 때문에 작은 것을 사용했다. 이후 전기영동 장치를 0.5 TAE buffer로 채우고, 겔을 전기영동 버퍼에 충분히 담기게 둔다.3) 6X loading buffer를 DNA sample에 2μL씩 섞어 준 후, agarose gel에 10μL씩 loading하고 50V에서 전기영동 한다.각 sample을 10μL씩 분주하고, DNA 밀도를 높여 well에 잘 가라앉도록 하기 위해 DNA loading buffer를 2μL씩 분주한다. 준비가 완료되었으면 Agarose gel 홈에 시료를 분주하는데, DNA 크기 추정을 위해 1Kb dna ladder를 넣고, sample을 10μL씩 홈에 분주한다.voltage는 full(100V) plasmid에 제한 효소 2개가 작용을 하도록 하면 plasmid가 두 개로 분리되는 것이다. 더 큰 plasmid는 약 9,000개 염기쌍, 작은 plasmid는 약 2,000개 염기쌍 크기로 이루어져 있음을 관측할 수 있다. 실험 결과를 표로 정리하면 아래와 같다.lanesample홈과 band의 거리크기11Kb ladder-200bp, 500bp, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 Kb2gDNA가장 짧음1만 염기쌍 이상3plasmid짧음1만 염기쌍 이상4plasmid + 제한효소 1짧으나3 lane보다 김1만 염기쌍 이상5plasmid + 제한효소 2하나는 매우 길고, 다른 하나도 긴 편2,000 염기쌍,9,000 염기쌍[표 1] 실험 결과 정리5. 고찰8주 차 실험으로 Agarose Gel을 제작하고, DNA 분리를 실시하였다. 실험 과정에서 몇 단계와 시료의 의미를 파악해보자. 먼저 Agarose Gel 제작 과정에서 Agarose Gel은 0.75% 농도로 제작되었다. 보통 1% 농도의 Agarose Gel을 사용하는데, 1% 농도에서는 500-5000 염기쌍 범위를 분리한다. 이번 실험에서 사용한 시료는 1만 bp 정도이기 때문에, 더 낮은 농도를 사용해 더 큰 범위의 DNA를 분리하고자 함이다. 0.8%를 기준으로 1000~7000개 염기쌍 범위를 분리하는데, 0.75%도 비슷한 범위이며, 조금 더 큰 DNA도 분리할 수 있다.Agarose Gel을 제작할 때 TAE buffer를 사용하는데, TAE는 Tris-acetate-EDTA buffer이다. Tris는 양이온을 공급하여 Agarose gel이 양전하를 띠게 하고, 전기 영동을 할 때 음전하를 띠는 DNA와 반대방향으로 이동하게 하여 DNA 분자를 더 효과적으로 방해하며 크기에 따라 잘 분리될 수 있도록 한다. 또한 pH가 높으면 DNA가 해리되기 때문에 Acetate를 사용해 pH를 낮춘다. EDTA는 2가 이온을 잡아 묶어서 효소를 불활성화 하여 실험 과정에서 DNA가 D한다.

자연과학| 2020.06.05| 10페이지| 1,000원| 조회(1,471)

제한효소, 전기영동, plasmid, dna 분리, Electrophoresis, 아가로스

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