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서강대학교 현대생물학실험4(현생실4) 4차 풀레(A)-저온유도성 유전자 발현 조절

실험 04.CRISPR/Cas9를 이용한 애기장대 돌연변이 제작을 통한 저온유도성 유전자 발현 조절소속 학과분반담당 교수님학번 이름1. Abstract본 실험은 CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 애기장대에 저온 유도성 유전자인 CBF를 deletion 하고 그 결과를 확인하는 데 그 목적이 있다. 애기장대는 저온 스트레스에서 CBF1, CBF2, CBF3 유전자를 발현하는데, 이 세 유전자는 상호 보완적인 기능을 가진다. CRISPR/Cas9 시스템을 활용해 세 유전자를 deletion 시키기 위해 cas9 gene과 sgRNA gene이 담긴 binary vector와 helper plasmid만 가지는 agrobacterium을 애기장대에 whole seedling infiltration 한다. 이후 식물 세포벽과 세포막을 lysis 하고 다당류와 결합하는 CTAB buffer와 DNA 손상을 방지하는 β-Mercaptoethanol를 사용해 cell lysis를 진행하고 chloroform과 isopropanol을 사용해 genomic DNA를 확보한다. 이후 general PCR과 nested PCR을 진행해 CBF가 제대로 deletion 되었는지 DNA 형태로 이를 확인한다. nested PCR은 1차, 2차 PCR로 진행되는데 1차 PCR product와 더 좁은 영역의 primer를 사용하여 deletion 된 DNA를 특이성 높게 검출할 수 있다. 실험 결과 sample 1, 3, 4에서 0.4 kb 부근의 band를 확보하여 CBF123의 deletion이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 또한 luminescence imaging을 통해 실제로 CBF gene의 기능이 사라졌는지 확인한 결과 WT가 CBF123 deletion sample보다 높은 형광 intensity를 보여 CRISPR/Cas9 시스템이 정상적으로 작동했음을 확인하였다. luminescence imaging은 CBF에 의해 발현되는 RD29A gene promoter 용한다. general PCR은 목표하는 T-DNA 또는 특정 유전자가 존재할 경우 이를 증폭해 band를 확인하는 방법으로 빠르고 간편하다. 하지만 식물의 genomic DNA에는 방해물질이 많고 비특이적인 결합이 생기기 쉽기 때문에 band가 약하거나 비특이적 증폭이 발생할 수 있다. 이때 민감도와 정확성을 높이기 위해 Nested PCR이 사용된다. Nested PCR에서는 target gene의 바깥 primer로 1차 증폭한 후 그 산물을 주형으로 삼아 안쪽 영역을 target 하는 primer로 2차 증폭이 이루어진다. 1차 PCR product 중 목표 영역만 골라 다시 2차 증폭이 이루어지기 때문에 특이성이 높아지고 미량의 DNA도 검출할 수 있다.PCR 반응이 끝난 tube에는 target DNA뿜 아니라 primer, dNTP, 잔여 효소 등이 섞여 있기 때문에 agarose gel electrophoresis를 통해 target DNA를 분리한다. agarose gel에 sample을 loading 하고 전기를 걸어주면 크기가 작은 물질은 빨리 이동하고, 크기가 큰 물질은 천천히 이동하여 크기에 따른 band를 얻을 수 있다. gel 안에서 DNA를 시각화하기 위해 RedSafe나 EtBr과 같은 DNA 염색 시약을 사용한다. RedSafe는 EtBr보다 독성이 낮고 낮은 UV에서 붉은색/주황색 형광을 내는 시약이다. 이를 사용해 원하는 크기 위치에 band가 형성되었는지 확인할 수 있다.애기장대는 온대식물로 저온 스트레스 조건에서 반응하는 저온 반응성 유전자인 CBF(C-repeat Binding Factor)를 가진다. 세 개의 CBF 유전자(CBF1, CBF2, CBF3)가 있으며 이들은 서로 상호 중복되는 기능을 가지고 있어 세 가지 유전자의 기능이 모두 상실되어야 저온 반응성 유전자 발현을 억제할 수 있다. 저온 스트레스 조건에서 CBF에 의해 RD29A 유전자 발현이 유도된다. RB29A 유전자 프로모터를 분리한 후 Lucifer°C, 200 rpm, shaking incubator에서 배양한다. 실험 하루 전에 LB 항생제 배지에 2일 동안 키운 Agrobacterium을 200 ml 넣고 하루 동안 28°C, 200 rpm, shaking incubator에서 배양한다. 실험 당일에 Agrobacterium 배양액 200 ml를 oak ridge tube에 옮기고 15 min, 4000 rpm, 4 °C로 centrifuge 한다. 상층액을 제거하고 liquid MS media 2 ml를 넣어 pellet을 풀어준다. 분광광도계를 이용해 OD600 값을 측정한다. 이때, Agrobacterium 현탁액 50 μL에 liquid MS medium 950 μL를 넣어 희석한다.(1:20) liquid MS medium에 50 ml 기준 농도 0.005% silwet L-77, 200 μM acetosyringone이 되도록 infiltration buffer를 제작한다. Agrobacterium 현탁액을 50 ml 기준으로 OD600이 2가 되도록 infiltration buffer로 희석한다. 희석한 sample을 알루미늄 호일로 감싸 어두운 곳에 놓고 RT에서 30 min 동안 incubation 진행한다. 7일 동안 배양한 식물이 있는 6 well plate에 well 당 각각 3 ml의 Agrobacterium solution을 분주한다. 이때 식물의 잎이 solution에 충분히 적셔지도록 한다. 6 well plate를 vacuum desiccator에 넣고 vacuum pump를 사용하여 400 mbar의 압력을 1 min 동안 가한다. 압력을 빼고 vacuum desiccator의 뚜껑이 열리면, 500 mbar의 압력을 12 min 동안 가한다. pipette을 통해 Agrobacterium solution을 6 well plate에서 제거한다. 알루미늄 호일로 빛이 들어오지 않게 6 well plate를 감싸고 45 min 동안 RT에 둔다. 호일을 벗기고 22°C의 product를 autoclaved 로 1/100 희석한다. ice 위에서 희석한 DNA를 이용해 Table 1의 조성대로 PCR mixture를 제작한다. primer는 2nd PCR primer로 변경한다. 제작한 PCR mixture가 담긴 PCR tube를 vortexing 또는 손으로 tapping 하여 mixture를 잘 섞는다. 이후 이를 spin down 한 후 Table 2의 순서로 PCR을 진행한다.PCR이 완료되면 gel electrophoresis를 진행한다. 500 ml 플라스크에 1% gel 기준 5X TAE buffer 100 ml와 agarose 1 g을 계량해 넣는다. 50X TAE buffer의 조성은 Tris 242 g, Glacial acetic acid 57.1 ml. 0.5M EDTA(pH 8.0) 100 ml, Autoclaved water up to 1 L이다. 플라스크 안에 stirrer bar를 넣고 랩으로 뚜껑을 감싼 후 작은 구멍을 2,3개 뚫고 전자레인지를 이용해 agarose를 녹인다. agarose가 충분히 녹으면 stirrer 위에 플라스크를 올린다. gel이 골고루 식을 수 있게 stirrer bar를 회전시키면서 gel을 식히고 RedSafe를 넣는다. gel이 60 °C로 식으면 gel tray를 조립한다. 기포가 생기지 않게 gel을 붓고 굳힌다. gel이 굳는 동안 loading 하려는 sample에 6X DNA loading dye를 최종 농도가 1X가 되도록 넣고 섞는다. electrophoresis 탱크에 0.5X TAE buffer를 gel이 잠길 만큼 채운다. electrophoresis 탱크에 충분히 굳은 1% agarose gel을 넣고 sample을 loading 한다. gel을 135 V에서 25-30 min 동안 내린다. UV illuminator에 gel을 올리고 UV를 켜서 DNA band를 확인한다.luminescence imaging을 진행한다. luciferin soF3을 완전히 deletion 한 control이다. CBF123에서는 band가 관찰되지 않고 C24RDLUC와 Sample에서만 band가 관찰되었는데, 이는 general PCR에서 사용한 Forward primer와 Reverse primer의 결합 자리가 deletion 된 CBF2 부근이기 때문이다. 따라서 band가 관찰된 Sample은 CRISPR/Cas9이 제대로 작동하지 않아 CBF gene이 deletion 되지 않은 것이다. CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여도 모든 cell이 편집되는 것은 아니기 때문에 deletion이 된 cell의 수는 적을 수 있다. 이처럼 Large deletion이 되지 않았을 것이라 예상되는 실험의 경우 general PCR만으로 그 결과를 확인할 수 있다. CBF123 gene이 온전히 존재해 primer 결합 자리가 남아 있기 때문에 민감도를 높이는 nested PCR을 진행하지 않아도 강한 band를 관찰할 수 있기 때문이다. 그러나 이 결과만으로는 CBF gene이 전부 deletion 되지 않은 건지, deletion 된 DNA와 deletion 되지 않은 DNA가 섞여 있는 건지 정확히 확인할 수 없다.nested PCR은 정상 gene에서 deletion 된 fragment를 확인하기 위해 사용하는 방식이다. Large deletion이 발생하면 primer가 결합할 수 없거나 fragment가 너무 짧아져 general PCR로는 band를 확인하기 어렵기 때문에 nested PCR을 사용한다. nested 1st PCR product에서는 CBF123에서 2 kb 부근의 band가 관찰되고, nested 2nd PCR product에서는 CBF123, Sample1, Sample3, Sample4에서 0.4 kb 부근의 band가 관찰된다. 1st PCR에서 CBF123의 알려진 size는 1983 bp로 결과로 나온 2 kb의 band 값과 일치하고, 2nd PCR에서 CBF123의 알려.

자연과학| 2026.02.23| 9페이지| 3,500원| 조회(24)

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서강대학교 현대생물학실험4(현생실4) 1차 레포트(A)-cycloheximide chase assay

실험 01.Cycloheximide chase assay소속 학과분반담당 교수님학번 이름1. Abstract본 실험은 Cycloheximide chase assay를 통해 Cyclin D1의 half-life를 확인하는 데 그 목적이 있다. Cycloheximide는 진핵세포에서 단백질 번역 과정을 억제하여 단백질 합성을 막는 물질이다. 이러한 성질을 이용해 protein에 시간에 따라 Cycloheximide를 처리하고 분해 정도를 파악하는 방법을 Cycloheximide chase assay라고 한다. 단백질은 Ubiquitin-proteasome pathway와 Autophagy-Lysosome pathway를 통해 분해되며, 실험에 사용되는 Cyclin D1은 Cell cycle의 G1기에서 S기로의 진행에 관여하는 regulator이다. protein half-life는 protein이 초기 농도의 50%가 될 때까지 걸리는 시간을 의미하는데 이는 질병 특이적 protein degradation을 연구하는 데 중요하다. NCCIT cell에 Cycloheximide를 0, 15, 30, 60 min 마다 처리한 후 lysis 하고, bradford assay를 통해 농도를 측정한다. 이후 동일한 농도의 sample로 SDS PAGE, transfer, western blotting 한 후 얻은 band를 image J로 확인한다. 이때, α/β-tubulin의 band도 같이 구해 실험의 신뢰성을 높였다. 실험 결과 Cyclin D1의 half-life는 15-30 min으로 확인되었는데 이는 기존의 이론과 일치하는 결과이다.[1]2. IntroductionCell cycle은 핵과 세포질 모두에서 세포가 주기적으로 성장하고 분열하는 과정을 설명한다. 일반적으로 진핵 세포의 Cell cycle은 G1기, S기, G2기, M기(유사분열)의 네 단계를 거친다. G1기는 DNA 복제를 준비하는 시기로, 세포는 단백질과 RNA 합성을 통해 성장하며 DNA 함 protein half-life라 하는데, 이는 몇 분에서 며칠까지 다양하며, protein 기능에 있어 중요한 역할을 한다. 또한 Cell cycle, 신호 전달 등의 세포 과정에서 protein abundance를 조절하는 데 중요하다. protein half-life를 이용하여 질병 특이적 protein degradation을 제어하는 약물을 개발하거나 protein level과 관련된 저분자 화합물을 연구할 수 있다.Cycloheximide는 Streptomyces griseus가 생성하는 항생제로, 진핵 생물의 전위 과정을 차단함으로써 protein 번역을 억제한다. 이러한 억제는 세포 성장 중단과 세포 사멸을 초래한다. Cycloheximide는 진핵생물의 protein 합성만 억제할 수 있으며 원핵생물의 protein 합성은 억제할 수 없다. 비교적 작동이 간단하고 특이성 없이 모든 protein 합성을 차단하기에 현재 진행 중인 protein 합성 효과를 고려하지 않아도 된다. 또한 높은 처리량 스크리닝이 가능하다. 하지만 독성이 높은 특징이 있어 장기간 사용 시에 대규모의 세포 사멸을 발생시킬 수 있으므로 긴 half-life를 가지는 protein에는 적합하지 않다.Cycloheximide chase assay는 target protein에 Cycloheximide를 처리하여 protein 합성을 억제하고, 시간이 경과함에 따라 target protein의 양을 측정하여 protein 분해 정도를 파악하는 방법이다. 동일한 sample에 여러 시간에 걸쳐 Cycloheximide를 첨가하고 이후 Western Blotting을 통해 단백질 분해 정도를 파악한다. 긴 half-life를 가지는 protein보다 짧은 half-life를 가지는 protein이 시간이 경과함에 따라 빠르게 양이 감소한다. Pulse-chase assay 기법과는 달리 방사성 동위원소를 사용하지 않고 protein degradation 정도를 시각화할 수 있는 장비한다. 각 60 mm dish 당 약 100 μl의 lysis buffer가 요구된다. 0, 15, 30, 60 min 마다 cell을 scrapping 하여 라벨링 한 e-tube에 모으고 ice에 보관한다. cell을 모두 harvest 한 후 13,000 rpm, 3 min 조건으로 원심분리한다. 상층액을 제거한 후 남은 pellet의 크기에 따라 lysis buffer 30~50 μl를 첨가한 후 bubble이 생기지 않도록 주의하며 resuspension 한다. 15 min ice incubation 하여 세포를 완전히 용해시킨다. 4˚C, 15 min, 13,000 rpm 조건으로 원심분리한 후 상층액을 수집하여 라벨링 한 새 e-tube로 옮긴다.Table 1. Bradford assay 시약 조성.Table 1의 조성으로 Bradford protein assay kit를 사용해 정량하고 protein concentration을 확인한다. solution 100 μl*6=600 μl에 DIW 400 μl*6=2.4 ml를 넣어 total 3 ml의 Bradford solution(6x master mix)을 준비한다. sample이 들어있는 tube에 각각 500 μl씩 분주하고 vortexing 한다. 96 well plate에 sample tube 당 200 μl씩 duplication으로 분주하고 흡광도를 595 nm에서 측정한다. 확인한 lysate의 농도를 이용해 5 μg의 protein을 채취하고 6x loading dye와 Lysis buffer를 넣어 total 15 μl sample을 만든다. 이후 100˚C에서 5 min 동안 boiling 한 후 -80˚C에 보관한다.SDS-PAGE에 사용되는 running gel(12%)은 DIW 4.2 ml, 30% PAA 5 ml, 10% AP 250 μl, TEMED 3.15 μl, (pH8.8 1.5M Tris-HCl+SDS 0.4%) 3.15 ml의 조성이고, stacking gelprogram을 사용하여 western blotting 결과로 구한 protein의 band intensity를 정량화하고 αβ-tubulin에 상대적인 cyclin D1의 protein 양을 비교한다.4. ResultTable 2. BSA 농도에 따른 O.D값.BSA(1 mg/ml)O.D.0.50.16110.23120.51440.62480.941Figure 1. 농도-흡광도 관계를 보여주는 BSA standard curve.Table 3. O.D.에 따른 sample의 농도와 western blot 시약 조성.3XsampleO.D.AVGCONCSAMPLE(5ug)Lysis buffer6X dyeSAMPLE(5ug)Lysis buffer6X dye0 min0.69280.69975.160.9711.532.502.9134.597.500.706615 min0.49440.5033.191.5710.932.504.7132.797.500.511630 min0.74850.76455.810.8611.642.502.5834.927.500.78051 hr0.89790.67164.881.0211.482.503.0734.437.500.9071Figure 1에서 얻은 BSA standard curve의 y=0.0996x+0.1856 식과 sample의 O.D. 값을 통해 Lysate의 농도를 구하는 계산식은 다음과 같다.5.16 mg/ml의 sample에서 5 μg의 protein을 채취하기 위한 계산식은 다음과 같다.이후 total volume이 15 μl가 되도록 Lysis buffer 양을 구한다.Figure 2. α/β-tubulin과 Cyclin D1의 western band.Figure 2는 SDS PAGE, transfer를 거쳐 각각 α/β-tubulin과 Cyclin D1에 특이적인 1차 항체 처리 후 1차 항체에 특이적인 2차 항체를 처리해 western blotting을 완료한 결과이다. 검출된 α/β-tubulin은 55 kDa에서 size가 비슷한 band가 관보정한 후 average를 내서 사용하였다. blank를 먼저 뺀 후 average를 낸 이유는 그렇게 했을 때 outlier 확인이 용이하기 때문이다. 평균을 낸 후 blank를 나중에 빼게 되면, outlier가 다른 값과 섞여서 발견하기 어렵다. 이렇게 구한 평균 흡광도의 값과 BSA standard curve를 사용하여 sample의 농도를 구하였다. BSA standard curve는 정제되어 정확한 농도를 알고 있는 표준 단백질(BSA)을 사용하여 만든 O.D.-농도 기준선이다.[4] 실제 Lysate에는 많은 종류의 단백질이 혼합되어 있기 때문에 정확한 농도를 직접 계산하기 어렵다. 따라서 BSA standard curve을 기준으로 상대적인 단백질의 양을 계산하였다. 이때, BSA standard와 lysate를 같은 시약, 같은 반응 조건에서 처리하고 standard curve 범위 내의 O.D 값만 사용해야 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있다.농도를 확인한 Lysate를 이용해 western blot에서 사용할 sample을 3x master mix로 준비하였다. 이렇게 실제 사용한 sample보다 넉넉한 master mix를 준비한 이유는 모든 sample에 동일한 조성을 적용할 수 있어 실험의 재현성을 높일 수 있기 때문이다. 또한 소량으로 제작했을 때 발생할 수 있는 pipetting 오차를 줄이고, loading에서의 손실에 대비해 여유량을 확보할 수 있다.Cycloheximide는 진핵 세포에서 리보솜에 결합하여 번역 신장 단계를 중지시킴으로써 단백질 합성을 억제하는 물질이다. cell에 Cycloheximide를 처리하게 되면 새로운 단백질 합성이 중단되고 cell에는 기존에 존재했던 단백질만 남게 된다. 기존의 단백질들은 세포 내 단백질 분해 과정을 통해 분해되는데 이때, 시간이 지남에 따라 감소하는 단백질 양을 측정하면 protein half-life를 측정할 수 있다. [1]Figure 3에서 α/β-tubulin에 상대적으02.

자연과학| 2026.02.23| 9페이지| 3,500원| 조회(25)

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서강대학교 현대생물학실험4(현생실4) 3차 풀레(A)-electrophysiology

실험 03.Electrophysiology소속 학과분반담당 교수님학번 이름1. Abstract본 실험은 Dosbox를 이용해 neuron 프로그램을 실행해 세포의 막전위와 current를 확인하는 데 그 목적이 있다. c-clamp는 막전위를 확인할 수 있고, v-clamp는 일정한 막전위에서 current의 변화를 확인할 수 있다. ion 농도와 ion의 permeability, 주어지는 자극이 변화할 때 membrane potential을 살펴보았다. synapse를 통한 신호 전달을 확인하기 위해 neurotransmitter인 glutamate와 GABA가 처리되었을 때 각각 AMPA, NMDA와 GABAa, GABAb의 conductance를 확인하였다. 또한 ion의 농도, starting membrane potential, EPSP, IPSP를 조절했을 때 membrane potential과 receptor의 conductance 변화를 확인하였다. 실험 결과 receptor의 활성과 세포 내외부의 ion 농도 및 permeabiliby가 막전위에 변화를 주는 양상을 확인할 수 있었다.2. IntroductionC(Current)-clamp는 current를 정해진 값으로 고정하여 voltage 변화를 측정하는 방식이다. V(Voltage)-clamp는 membrane voltage를 일정하게 고정하여 membrane channel의 ion current를 측정하는 방식으로, membrane voltage는 membrane potential로 정의할 수 있다. membrane potential은 세포 내외부의 전하량 차이로 인해 형성된다. 본 실험에서는 c-clamp와 v-clamp를 사용해 Squid giant exon을 대신해 Dosbox를 통해 electrophysiology을 확인한다. Squid giant exon은 직경이 매우 커 전극 삽입이 쉽고 신호가 커서 측정이 쉽다는 특징을 가진다.cell의 membrane은 resting mem) Equilibrium potentialFigure 2. pKleak(1->0) 변화 후 membrane potential. O key -> REST.CCS -> B key -> R key -> pKleak(1->0) -> Y key탈분극이 일어나 막전위가 40 mV로 증가하였다.pKleak를 1에서 0으로 변화시키면 의 permeability가 사라지고 탈분극이 일어나 membrane potential이 channel의 equilibrium potential에 도달한다. Nernst equation을 통해 의 equilbrium potential을 구하면 , 즉 약 40 mV임을 확인할 수 있다.Figure 3. pNaleak(1->0) 변화 후 membrane potential. O key -> REST.CCS -> B key -> R key -> pNaleak(0.06->0) -> Y key과분극이 일어나 막전위가 -100 mV로 감소하였다.pNaleak를 0.06에서 0으로 변화시키면 의 permeability가 사라지고 과분극이 일어나 membrane potential이 channel의 equilibrium potential에 도달한다. Nernst equation을 통해 의 equilbrium potential을 구하면 , 즉 약 -100 mV임을 확인할 수 있다.(2) effects of changing ion concentrationsFigure 4. (3.1->135) 변화 후 membrane potential. -> R key -> (3.1->135) -> Y key탈분극이 일어나 막전위가 0 mV까지 증가하고 유지된다.세포 내외부의 농도를 동일하게 설정하면 net flux는 0이 된다. 이때 pNaleak을 0으로 설정하면 탈분극이 일어나 membrane potential은 0 mV가 된다. 이를 GHK equation을 통해 확인하면 다음과 같다.Figure 5. pKleak(1->10) 변화 후 membrane potential. O 자극이 주어지기 이전에 탈분극 상태가 나타나는 것을 확인할 수 있는데, 이는 정상적인 유입이 일어나지 않아 action potential이 발생하지 않지만 증가된 base current에 의해 막전위가 높게 유지되기 때문이다. 이후 전류 자극이 주어졌을 때 조금 더 탈분극이 일어났다가 재분극이 일어나 높은 막전위를 유지한다.Figure 18. (3.1->0.1) 변화 후 membrane potential. O key -> ACTIVE.CCS -> B key(control) -> R key -> (3.1->0.1) -> Y key전류 자극이 주어지기 전에 과분극이 발생하고 자극이 주어진 후에 탈분극이 점진적으로 일어난 후 재분극이 일어난다.전류 자극이 주어지기 이전에 과분극이 일어나고, 전류 자극이 주어진 후 탈분극이 일어나지만 action potential을 형성하지 못하고 재분극이 일어난다. 이는 passive membrane potential의 양상이다. 세포 외부의 농도가 감소함으로 인해 세포 내부에서 외부로 유출되려는 농도가 증가하여 막전위가 더 과분극된 상태이다. 이 상태에서 같은 크기의 자극이 들어와도 역치를 넘기지 못해 action potential이 형성되지 않는다.Figure 19. Base current(0->0.8) 변화 후 membrane potential. -> R key -> Base current(0->0.8) -> Y keyaction potential이 형성되고 과분극이 발생한 후 다시 action potential이 형성됨이 반복된다. Figure 18의 action potential과 비교해 봤을 때 action potential의 발생 빈도수가 증가하였고, peak의 높이 차이가 감소하였고, 재분극이 발생하였다.추가적인 base current로 인해 세포가 조금 더 탈분극 된 상태가 되고, 역치에 도달하기 쉬워지기 때문에 action potential이 발생한다. 외부 농도가 감소한 상태이기 때문에 세포 외부로 유출되려는 이l의 활성화 정도(mNa)와 비활성화 정도(hNA)를 확인할 수 있다.탈분극시에 유입이 빠르게 일어나고 voltage-gated channel이 inactivation 되면서 의 유입이 감소한다. 이때 에 의한 inward current가 형성된다. 이후 의 유출로 인한 재분극이 일어나면서 outward current가 형성된다. 이는 voltage-gated channel은 inactivation 되지 않기 때문에 천천히 current가 감소한다. 의 current가 최대일 때, 의 current에서 굴곡을 관찰할 수 있는데 이는 재분극 단계에서 membrane potential이 감소하고, 일시적으로 의 driving force가 증가하기 때문에 형성된다. 비활성화된 voltage-gated channel에 의해 탈분극까지 증가하지 못하고 다시 재분극 된다.(11) effects of postsynaptic potentials on the nueronFigure 30. Postsynaptic potential on the neuron. O key -> EP_IPSP.CCS -> B key-55 mV에서 탈분극이 일어나고 과분극이 일어난 후 휴지 전위로 돌아오려는 재분극이 일어나다가 다시 과분극이 일어나고 재분극이 일어난다.탈분극, 과분극, 재분극, 과분극, 재분극이 일어나지만 gNa와 gK를 모두 0으로 설정한 상태이기 때문에 action potential은 발생하지 않는다. g-AMPA, g-NMDA, g-GABAa, g-GABAb의 conductance를 통해 형성된 postsynaptic potential을 분석하면 다음과 같다. 우선 AMPA가 활성화되면서 이 막 안으로 유입되면서 탈분극이 발생한다. 다음으로 NMDA와 GABAa가 활성화된다. NMDA는 가 결합된 상태로 존재하는데 AMPAM로 인해 높아진 막전위로 인해 가 조금 떨어져 나가 conductance가 약간 증가한다. 그러나 AMPA에 비해 약 1/30배 낮은 conductance를 가에서 current가 0이 되었다가 outward current가 증가하며 형성된다.voltage가 가해진 후 current가 형성되는 데까지 delay가 발생하는 이유는 glutamate가 NMDA receptor에 결합하는 데 시간이 소요되기 때문이다. 세포 외부 의 농도를 낮추자 더 많은 NMDA receptor가 활성화되어 -100 mV 막전위일 때 처음 형성된 current가 -1.0 nA 부근으로 증가한다. 또한 inward current의 크기가 증가하고, 막전위가 양의 값으로 가까워짐에 따라 가 더 많이 제거되어 inward current의 크기가 최대가 되는 막전위가 -50 mV로 감소한다. 이후에는 driving force에 따라 inward current가 감소하다가 0 mV 막전위에서 reversal potential을 보이고, outward current가 형성된다. reversal potential은 receptor 자체의 특성이기 때문에 변하지 않는다.Figure 43. (0.05->0.01) 변화 후 NMDA receptor current.-> (0.05->0.01) -> I key(좌)는 각 voltage를 고정했을 때 나타나는 NMDA current이고, (우)는 membrane potential에 따른 NMDA current 변화이다. 낮은 막전위에서 inward current가 크게 형성되고, -70 mV 막전위에서 최대 inward current가 형성된다. 0 mV에서 current가 0이 되었다가 outward current가 형성된다.세포 외부 의 농도가 더 감소함에 따라 NMDA receptor가 더 많이 활성화되어 -100 mV 막전위에서 current가 -3 nA로 증가한다. 또한 낮은 막전위에서 inward current가 크게 형성되고, -70 mV에서 최대 inward current가 형성된다. 이후 0 mV에서 current가 0이 되었다가 outward current가 형성된다.Figure 44. (0.

자연과학| 2026.02.23| 37페이지| 4,000원| 조회(26)

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서강대학교 현대생물학실험4(현생실4) 2차 풀레(A)-Wnt/b-catenin

실험 02.Wnt/β-catenin signaling activation소속 학과분반담당 교수님학번 이름1. Abstract본 실험은 β-catenin plasmid vector(GFP tagged)를 HEK29T cell로 transfection 하고 하나의 plate에만 LiCl을 처리한 후 lysis, western blot, visualization 하여 β-catenin 발현량을 확인하는 데에 그 목적이 있다. Transfection은 진핵세포 내로 외부 유전물질을 도입하는 과정을 말하며, 본 실험에서는 membrane과 DNA 간의 반발력을 중화하는 PEI를 사용해 transfection 하였다. lysis는 세포막을 파괴함으로써 cell 구성요소를 노출시켜 lysate를 얻는 과정이고 bradford assay로 이렇게 얻은 lysate의 농도를 구한 후 western blot을 통해 protein의 발현 여부와 양을 확인할 수 있다. LiCl은 Wnt signal pathway에서 β-catenin의 분해를 유도하는 destruction complex의 구성 효소 중 하나인 GSK3를 저해하는 물질로, LiCl을 cell에 처리하면 β-catenin의 발현량이 증가하게 된다. 실험 결과 LiCl을 처리한 cell이 처리하지 않은 cell보다 2.7배 높게 β-catenin이 발현된 것을 확인할 수 있었고, 광학현미경을 통해 확인한 결과에서도 LiCl이 처리된 cell에서 GFP의 발광 정도가 강한 것을 확인할 수 있었다.. 본 실험에서는 BCIP/NBT 결과로 얻은 β-catenin 양을 Ponceau S staining 결과로 얻은 모든 protein의 양으로 나누어 normalization 하였는데, 이를 통해 loading 시에 생기는 protein의 양 차이를 보정할 수 있다.2. IntroductionWnt signaling은 세포 성장, 분화, 줄기세포 유지 등 다양한 발달 과정과 항상성 유지에 중요한 신호 전달 경로이다. Axin, 방법이다. 단백질의 크기와 특성을 분석하거나 발현 양상을 확인하기 위해 사용된다. Western blotting은 gel electrophoresis, transfer, bloking, visualization 순서로 진행된다. SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-acrylamide Gel Electrophoresis)에서는 acrylamide와 Bis-acrylamide의 공유결합으로 만들어진 다공형 구조의 PAGE gel을 사용하여 sample을 크기별로 분리한다. 이때 SDS는 protein sample에 동일한 negative charge/molecular weight 비율을 부여하고 linear form으로 만들어 크기에 따라서만 분리되게 한다. 음전하를 띠게 된 protein은 전기장에서 양극으로 이동한다. transfer 과정에서는 크기에 따라 분리된 protein을 membrane으로 이동시켜 단백질을 검출하고 visualization 할 수 있는 형태로 만든다. PVDF(Polyvinylidene difuoride) 또는 NC(Nitrocellulose) membrane이 사용된다. PVDF membrane은 소수성이어서 hydrophobic interaction으로 protein과 결합하고, NC membrane은 친수성이어서 hydrogen bond로 protein과 결합한다. 소수성인 PVDF는 protein과 잘 결합하지 않기 때문에 methanol activation을 통해 표면을 습윤화하여 protein과 상호작용할 수 있게 해야 한다. Blocking 과정은 membrane에 항체가 비특이적으로 결합하여 visualization noise가 생기는 것을 방지하는 단계로 BSA(Bovine Serum Albumin)나 Non-fat-dried milk를 TBS-T 또는 PBS-T에 녹여서 사용한다. Visualization 단계에서는 시각화하고자 하는 protien을 targeting 하는 primary ant500 mM EDTA 500 μl, DIW up to 500 ml의 조성을 이룬다. 이를 vortexing 한 다음 spin down 하여 ice에 보관한다. 배양 중인 plate의 media를 pipette으로 제거한다. 500 μl PBS buffer를 각각의 plate 벽면에 대고 조심히 넣는다. PBS로 cell 표면을 wash 한 다음 PBS buffer를 제거하고, lysis buffer를 200 μl씩 세포에 골고루 퍼지게 넣는다. scraper로 cell과 lysis buffer를 긁어 새 e-tube에 모은 뒤 ice에서 보관한다. sample을 wet ice에 박아 둔 상태에서 80회 이상 강하게 pipetting 한다. sample을 microcentrifuge를 통해 4°C, 13000 rpm에서 20 min 동안 centrifuge 한다.Table 1. Bradford assay 96 well 조성WellDIWWellDIWA110 μlA29.5 μlB110 μlB29.5 μlC110 μlC29.5 μlD110 μlD29.5 μlE110 μlF110 μlG110 μlH110 μl96 well에 Table 1의 조성대로 DIW를 넣는다. A1 well에 BSA(2 mg/ml) standard protein을 10 μl 넣은 다음 기포가 생기지 않게 유의하며 pipetting 하여 잘 섞어준 후 그중 10 μl를 B1 well에 넣고 pipetting 하여 잘 섞는다. 이 과정을 G1까지 진행하고 G1의 10 μl는 버린다. centrifuge가 완료된 sample을 A2-D2 well에 0.5 μl씩 넣는다. 모든 well에 각각 bradford assay reagent를 200 μl씩 넣고 Multi-reader로 595 nm에서의 흡광도를 측정한다. 측정된 결과를 바탕으로 BSA standard curve를 그린 후 sample의 total 농도를 정량한다. 새로운 e-tube에 남은 sample을 옮기고 5X Lammeli bufferIP/NBT solution 250 μl를 분주한 다음 AP에 의한 발색을 확인한다. membrane이 완전히 마르면 사진을 찍는다.Image J를 사용해 Ponceau S staining으로 얻은 date와 western blotting 결과로 얻은 date를 가지고 β-catenin을 정량화한다. 정량된 값을 통해 LiCl(+) sample과 LiCl(-) sample 간의 β-catenin ratio 차이를 확인한다.4. ResultFigure 1. LiCl-(왼)와 LiCl+(오) transfection plate의 형광현미경 관찰 결과. LiCl-보다 LiCl+에서 강한 형광이 확인된다.HEK293T cell에 plasmid vector(Human GFP tagged β-catenin plasmid)를 transfection 시킨 후 GFP filter로 설정된 형광현미경으로 plate를 관찰한 결과이다. LiCl이 함유되지 않은 plate보다 LiCl이 함유된 plate에 있는 GFP의 발광 정도가 강한 것을 보아 transfection이 효율적으로 되었음을 확인할 수 있다.Figure 2. BSA standard curve.Table 2. western blotting loading 양. Blank의 O.D. 값은 0.3265이다.LiClO.D.O.D.-Blankμgμg/μl30 μg5X LBtotal loading(μg)-0.81080.48434.95419.99083.02770.75693.78+0.77700.45054.50489.00963.32970.83244.16western blotting 시에 사용할 sample의 loading 양을 구하는 방법은 다음과 같다. Bradford assay 결과 나온 sample의 O.D. 값에 DIW만 넣은 well에서 나온 흡광도 값을 빼서 값을 보정한다. BSA standard curve의 x 값에 넣어 농도를 구하고, well에 sample을 0.5 μg 분주했으므로 0.5로 나누어준다. loading생하는 것에 대비해 Ponseau S staining 결과를 internal control로 사용한 것이다. 이러한 방법을 사용하면 well에 들어간 단백질 양이나 transfer 효율로 인해 생길 수 있는 오차를 보정할 수 있다. normalization에는 β-actin, GAPDH, tubulin 등의 housekeeping protein을 사용할 수도 있다. housekeeping protein을 사용하면 sample 간의 protein loading 양을 보정할 수 있고, 실험 결과 얻은 band가 protein의 양에 의한 것인지, 발현 정도에 의한 것인지 구분할 수 있다.[4]cell lysis 후에 brandford assay를 통해 protein의 양을 정량화 한 이유는 동일한 양의 protein을 loading 하기 위함이다. 동일한 실험 과정을 거쳐도 sample의 lysate에 동일한 protein의 양이 들어있다고 볼 수 없기 때문에 각 sample의 농도를 구해 일관된 결과를 얻어야 한다. 이때 BSA standard curve를 이용해 sample의 농도를 확인할 수 있다.western blot을 완료한 membrane에 BCIP/NBT를 처리하여 얻은 band에서 LiCl + sample 2의 band가 위로 번진 것을 확인할 수 있다. (Figure 4) 다른 sample은 정상적인 것에 비해 LiCl + sample 2의 band만 번져서 나타난 것으로 보아 sample의 준비 과정에서 문제가 생겼을 것이라 예상한다. sample에 lammeli buffer를 넣고 boiling 하는 과정에서 protein이 불완전하게 변성되어 풀리지 않으면 gel에서 제대로 분리되지 않고 퍼져 보이는 band를 형성할 수 있다.transfer 과정에서 PVDF membrane을 methanol에 activation 하였다. PVDF membrane은 소수성이기 때문에 protein과 같은 극성 분자가 쉽게 흡착되지 않는다. protein을 g65.

자연과학| 2026.02.23| 11페이지| 3,000원| 조회(26)

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일반물리실험1 12주차 열의 일당량 측정(A+)

일반 물리 실험I열의 일당량 측정담당 교수 :담당 조교 :학과 :학번 이름 :1. 실험 목적전류와 전기 에너지의 열 작용으로 발생한 열량을 측정하여 열의 일당량을 구한다.2. 데이터 정리1) 열량계의 물당량상온의 물질량48.2 g온도24.7°C끓인 물질량82.2 g온도40.9°C최종 평형 상태의 온도35.9°C열량계의 물당량 M25.8 gTable 1. 열량계의 물당량 측정 데이터2) 열의 일당량물의 질량 m50.5 g처음 물의 온도24.3°C나중 물의 온도34.5°C평균 전압 V8.745 V전류 i0.8592 A시간 t446 Sec열의 일당량 J4.31 J/calTable 2. 열의 일당량 측정 데이터3. 결과 분석1) 열의 물당량(M)물체가 특정 열량을 흡수하거나 방출할 때, 이와 동일한 값의 열량을 물이 흡수하거나 방출하기 위해 얼마만큼의 열용량이 필요한지 물의 질량으로 환산하여 계산한 값이다. 즉, 어떤 물체가 흡수하거나 방출하는 열의 열용량을 물의 질량으로 바꿔 표현한 값이다. 온도가 인 g의 물을 열량계에 추가한 후 까지 물을 가열하고(열량계의 질량 ), 상온의 물을 섞어준 후의 온도가 이 되었을 때, g이 열을 흡수한 정도는 다음과 같다.이때 의 물이 담긴 열량계가 열을 방출한 정도는 다음과 같다.두 식이 같음을 이용해 열량계의 물당량을 구하면 다음과 같다.2) 열의 일당량(J)일(W)과 열(Q)의 관계를 나타내는 값으로, 특정 열량이 얼마만큼의 일로 변환되는지 나타낸다. 이는 W=JQ의 식으로부터 유도할 수 있다. 전기 에너지로부터 발생한 열은 질량이 열량계 속 질량 m인 물과 용기 온도를 에서 까지 상승시키고, 이때의 열의 일당량은 다음과 같다.[J/cal]C는 물의 비열로 1의 값을 가지고, M은 전체 물당량을 의미한다.3) 분석본 실험에서는 열량계의 물당량 M을 측정하고, 함수발생기를 이용하여 전기 에너지와 전류를 발생시킴으로써 발생한 열량을 측정하여 열의 일당량을 계산하였다. 실험을 통해 도출한 열의 일당량은 4.31 J/cal로 이론값인 4.184 J/cal과 3.01%의 오차율을 가진다. 이를 통해 실험에서 구한 열의 일당량이 이론을 잘 반영하고 있다고 생각할 수 있다.4. 토의본 실험에서는 온도가 다른 두 물의 평형을 통해 열량계의 물당량을 구하였다. 또한 함수발생기를 통해 발생시킨 열량을 통해 열의 일당량을 측정하였다. 실험에서 발생한 오차의 원인은 다음과 같다. 전압과 전류의 값을 대략적인 평균을 통해 구하였기 때문에 실제 발생한 값과 차이가 있을 수 있다. 이러한 오차를 줄이기 위해 PASCO capstone으로 매 시간마다의 값을 구하고 이 값의 평균을 사용할 수 있을 것이다. 또한 완전히 닫힌 열량계가 아니었기 때문에 계 안으로 들어가는 열량이 있었을 수 있다. 이러한 오차를 줄이기 위해서는 단열이 잘 되는 열량계를 사용할 수 있다.본 실험에서는 전기에너지를 열에너지로 변환하였는데, 역학적인 일을 열에너지로 변환하는 실험을 추가적으로 구상할 수 있다.열과 에너지 사이의 변환은 연료나 발전소에서 확인할 수 있다.5. 참고문헌1) 일반물리실험 메뉴얼, 서강대학교 물리학과, 12주차2) 데이비드 할리데이, 일반물리학, 2021, 11판, 텍스트북스, p473-4853) 물리학백과, 열의 일당량, HYPERLINK "https://terms.naver.com/entry.naver?docId=4390101&cid=60217&categoryId=60217" https://terms.naver.com/entry.naver?docId=4390101&cid=60217&categoryId=60217

자연과학| 2025.09.05| 4페이지| 2,500원| 조회(56)

A+, 열의일당량, 일반물리실험1, 서강대학교

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