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혈장 중 cholinesterase의 활성 측정

혈장 중 cholinesterase의 활성 측정 실험1. 서론Cholinesterase는 cholinester를 choline과 유기산으로 가수분해하는 효소이며, 다른 esterase와는 달리 4가 ammonium ion에 큰 친화성을 갖고 있다.Cholinesterase에는 Ⅰ형과 Ⅱ형 두가지 종류가 존재하는데, Ⅰ형은 acetylcholinesterase라고 불리며 척추 및 무척추동물의 모든 흥분성 조직(신경근접합부와 뇌의 회백질 등)에 존재한다. 또한 흥분성 조직 이외에도 적혈구막과 태반, 그리고 양수 등에도 존재한다. Acetylcholinesterase은 기질 특이성이 높다. 그리고 Ⅱ형은 butyrylcholinesterase, 혹은 pseudocholinesterase로 불리며 기질 특이성이 낮다. Pseudocholinesterase는 간, 뇌 회백질 및 혈장 등 여러 조직과 체액에 광범위하게 존재하는데, 이들 부위에서의 기능은 명확히 밝혀지지 않았다. Ⅱ형은 동물조직 이외에 식물 및 미생물에도 존재한다.다음은 실험에서 쓰이는 cholinesterase에 대한 설명이다.① PhysostigminePhysostigmine은 매우 독성이 강한 부교감신경과 유사한 알칼로이드로, 가역적 cholinesterase inihibitor이며 세포막을 통해 빠르게 흡수된다. physostigmine은 acetylcholine의 대사를 방해함으로써 시냅스에서 이용 가능한 acetylcholine이 증가함에 따라 니코틴성 수용체와 무스카린성 수용체를 간접적으로 자극한다. 이 약물은 녹내장 치료제로 사용되며, 혈액-뇌 장벽을 넘을 수 있으므로 심각한 항콜린성 독성의 치료, 아트로핀 과다복용 및 기타 항콜린제 과다복용 등 중추신경계 효과를 치료하는 데에도 사용된다. 이것은 중추 및 말초 모두의 항콜린성 반응을 역전시킬 수 있다. 부작용으로는 땀의 증가, 방광 조절의 상실, 근육 약화, 메스꺼움, 구토, 불규칙한 심장박동, 시야가 흐릿해지거나 멀어지는 등 시력의 변화, 눈의 통증 등이 있다.② DonepezilDonepezil은 가역적 cholinesterase inhibitor로, 주로 알츠하이머병 및 노인 치매 개선을 위해 사용되는 제제이다. 치료를 위해 사용되는 것 보다는 증상의 진행 및 경과를 늦추는데 주로 사용된다. 부작용으로는 오심, 구토, 피로, 설사 등이 있다. 과복용 시 소화기계의 부작용이 나타날 수 있다.③ ParathionParathion은 유기인산염 제제 중 하나이며 살충제로 이용된다. 이것은 비가역적 cholinesterase inhibitor로, 일반적으로 acetylcholinesterase에 간접적으로 작용하여 효소의 작용을 억제하여 신경계를 교란시킨다. 피부, 점막, 구강 등을 통해 체내로 흡수되며, 흡수된 후에는 이중황화결합의 황(S)이 산소(O)로 치환되어 paraoxon을 생성한다. paraoxon은 두통, 경련, 시력저하, 구토, 의식불명 등을 일으키며 더 심각하게는 폐 부종을 일으켜 호흡곤란을 야기할 수 있다. 이 독성물질의 증상은 장기간에 걸쳐 일어나며, 수개월 동안 지속되기도 한다. 매우 특이적인 해독제로는 아트로핀이 있으나, 아트로핀 역시 독성을 가지고 있으므로 소량을 사용해야 한다.④ PAMPAM은 pralidoxime이라고도 하며, 유기인산염 화학물질에 대한 해독제이므로, 유기인산염 제제 중 하나인 parathion의 작용 역시 PAM을 이용하여 해독할 수 있다. 유기인산염 노출 후 24시간 이내에 PAM을 투여하면, 이 약물은 유기인산염과 acetylcholinesterase 사이에 형성된 인산염-ester 결합을 분리하여 acetylcholinesterase를 재활성화시킨다. 그러면 분해되지 않고 신경근 접합부에 축적되어 있던 acetylcholine의 파괴가 진행될 수 있으며 신경근 접합은 다시 정상적으로 기능할 수 있다. 또한, PAM은 직접적인 화학적 반응에 의해 특정 유기인산염을 해독한다. 따라서 호흡근의 마비를 완화하는데 결정적인 영향을 미친다.2. 실험 개요(1) 동물에 약물 투여Acetylcholinesterase inhibitor인 physostigmine (0.1 mg/kg, i.p.)과 donepezil (5mg/kg, i.p.), parathion (1 mg/kg, i.p.)을, 그리고 parathion과 5분후에 PAM (50 mg/kg, i.p.)을 각각 실험군에 투여한다. 이때 대조군으로서는 saline을 투여한다. 투약 30분 후에 ether 마취 하에 심장 혹은 복대정맥으로부터 채혈한다.(2) 실험 원리Acetylthiocholine이 효소에 의하여 thiocholine과 초산 혹은 유기산으로 분해된다.(CH3)3N+CH2CH2SCOR + H2O → RCOOH + (CH3)3N+CH2CH2SH이 반응액에 Ellman 시약 (DTNB, 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid)을 첨가하면 노란색의 음이온인 5-thio-2-nitrobenzoic acid(thiol기와 반응해 노란색으로 발색됨)가 형성된다. 이것의 흡광도를 410 nm에서 측정하면 thiocholine의 생성정도를 알 수 있다.Ellman 시약은 빛에 민감하므로 시약을 제조하고 바로 알루미늄 호일로 차광해야 한다.(3) 시약- 100mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)- Ellman 시약 : DTNB 39.6 mg을 10ml의 phosphate buffer (pH 7.0)에 녹인 다음 15 mg의 NaHCO3를 첨가하여 녹인다.- 75 mM Acetylthiocholine iodide(4) 실험 방법① 5개의 group으로 나눈 mouse 2마리씩에 각각의 약물을 투여한다.② 30분 뒤 주사기를 이용해 채혈한 후 3000 rpm에서 15분간 원심분리를 해 상층액을 혈장으로 취한다. 이를 증류수로 10배 희석하여 혈장중의 pseudocholinesterase로 한다.③ 각각의 시험관에 phosphate buffer 2.7ml, DTNB 시약 0.1 ml, acetylthiocholine 용액 0.1 ml를 취하여 25℃에서 5분가량 incubation하고, 마지막으로 혈장 효소표품 0.1ml를 가하여 mixing 한 후 10분간 incubation한 후, 즉시 spectrophotometer에 의하여 410 nm에서의 흡광도를 측정한다.④ 흡광도로부터 5-thio-2-nitrobenzoic acid의 흡광계수 1.36/mM/ml를 이용하여 1ml에 존재하는 pseudocholinesterase의 기질에 대한 활성도를 구한다.3. 실험 결과번호그룹흡광도(O.D)-1흡광도(O.D)-21Control2.7862.7742Control2.7592.7723Physostigmine (0.1mg/kg)1.9731.9214Physostigmine (0.1mg/kg)2.2422.2735Donezepil (5mg/kg)1.5651.4966Donezepil (5mg/kg)1.7011.7187Parathion (1mg/kg)0.9020.9818Parathion (1mg/kg)0.9240.9089Parathion (1mg/kg) + PAM (50 mg/kg)2.0422.00610Parathion (1mg/kg) + PAM (50 mg/kg)1.9421.9275-thio-2-nitrobenzoic acid의 흡광계수 1.36/mM/ml은 이 용액이 lmM/ml 의 양이 있을 때 흡광도가 1.36이라는 뜻이다. 여기서 구하고자 하는 것은 혈장 1ml이 1분동안 분해할 수 있는 효소의 활성도이다. 이를 구하기 위해서는 특정 그룹의 흡광도의 평균을 위 표를 통해 구한 후 그 값()을 흡광계수인 1.36/Mm/mol 로 나누어 준 후, 희석배율과 혈장 효소표퓸, 그리고 반응시간을 고려해 계산해야 한다.2.72 10 umol / 0.1 ml / 10min위 식을 통해 나온 결과를 표와 그래프로 정리하면 다음과 같다.혈장 1 ml에 존재하는 pseudocholinesterase의기질에 대한 활성도평균값Control (Group A)을100으로 설정A. Control495.52970100.0043B. Physostigmine (0.1mg/kg)371.910875.8215C. Donezepil (5mg/kg)286.595658.4282D. Parathion (1mg/kg)164.305933.4971E. Parathion (1mg/kg)+ PAM (50 mg/kg)350.150871.38524. 고찰가역젹 효소 억제제인 Physostigmine을 투여한 Group B는 Saline을 투여한 control group인 Group A보다 효소 활성이 적게 나온 것을 알 수 있다. 마찬가지로 가역적 효소 억제제인 donezepil을 투여한 Group C도 control group보다 더 낮은 값을 가지며, donezepil이 physostigmine보다 높은 효소 억제 경향을 갖는 것을 알 수 있다. 그리고 훨씬 더 강력한 비가역적 효소 억제제인 parathion을 투여한 Group D의 효소 활성도가 가장 낮으며, Group E는 parathion을 투여했으나, 해독제인 PAM을 같이 투여했기 때문에 Group 4보다 더 높은 효소 활성을 회복하였음을 확인할 수 있다. 효소 억제 능력은 parathion, donezepil, physostigmine 순이다.5. 참고 문헌「치과약리학」 pp.83-90, 대한치과약리학교수협의회, 2010

의/약학| 2020.11.09| 5페이지| 1,500원| 조회(230)

약리학, Cholinesterase, 치과약리학

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