Ligation & Trasferation4조21720158이소미Ⅰ. 실험제목 Ligation & TrasferationⅡ. 실험목적복제 개시점이 없어 자가 복제가 불가능한 plasmid DNA를 ligation과 trasferation을 활용하여 E.coil Top10 Cell 안에 삽입하여 DNA가 복제되는 것을 확인할 수 있다.Ⅲ. 실험원리미생물인 박테리아들은 접합을 통해 다른 개체와 직접적으로 연결되어 유전자를 주고 받을 뿐만 아니라, 주변 환경에 존재하는 다양한 DNA 조각들을 받아들여 이들을 마치 원래부터 가지고 있었던 것 마냥 자기 DNA에 끼워 넣어 이용하기도 한다. 이처럼 외부로부터 주어진 DNA를 받아들여 생물체의 유전적인 성질이 변하는 것을 형질전환 (Transformation)이라 한다. 세포의 DNA의 재조합, 형질의 발현이라는 일련의 과정이 필요하다. 이중, 세균내로 들어가는 것이 큰 장벽 있었지만 몇몇의 세균들은 일정한 배양조건에서 들어가는 능력(competent)을 쉽게 얻을 수 있게 되었다. 최근에는 Ca 혹은 Li 등의 처리에 의하여 대장균, 효모에서도 형질전환이 가능하게 되었고 세포벽을 제거한 원형질체를 사용하는 방법도 행해지고 있다. 또 미생물에 한정하지 않고 일반적으로 동식물세포의 DNA를 끼워 넣음으로써 세균의 성질을 변화시키고 있다.박테리아는 유전자 일부를 동일 세대의 이웃 박테리아에 전달할 수 있다. 후자와 같이, 수평적인 유전자 전달 방식으로 공여자 세포의 DNA 일부를 수용자 세포의 유전자로 통합하는 방식으로는 크게 3 가지가 있다. 즉, 형질전환(Transformation), 접합(Conjugation), 박테리오파지에 의한 형질도입(Transduction)이다. 형질전환은 두 박테리아 세포가 서로 직접적인 접촉을 통해서 유전물질을 전달하는 접합이나 박테리오파지와 같은 바이러스를 이용해서 숙주 박테리아로 외부 DNA를 주입하는 형질도입과 다르다. 형질전환에서는 박테리아에서 빠져나온 유전 물질이 흡수능력이 있는 수용자 박테리아에 의해서 받아들여지기 때문에 이 유전물질의 흡수여부는 전적으로 수용자 세포에 달려있다. 이러한 자연적인 유전물질의 이동 과정은 질병과는 아무런 연관이 없다.한 박테리아에서 다른 박테리아로의 DNA 이동을 위한 형질전환이 일어나기 위해서는 수용자 박테리아는 일시적으로 수용 가능한 상태(a state of competence)로 존재해야 하는데 자연계에서는 기아(starvation)나 세포 밀도(cell density)와 같은 환경적 변화로 인해 유도될 수 있고, 혹은 실험실에서 인위적으로 만들 수도 있다. 실험적 조건에서, 한 종류의 박테리아에서 추출된 DNA는 유전적 형질이 다른 박테리아에 삽입하여 수용한 박테리아의 유전형질을 변화시키는 것이다. 이러한 자연적인 유전물질의 이동 과정은 질병과는 아무런 연관이 없으며 박테리아가 여러 스트레스 상황에서 DNA 손상에 대한 재조합 수선(repair) 과정을 증강시키는 이로운 적응과정으로 생각되고 있다. 시험관 내에서의 형질전환을 위해서인위적인 수용성이 실험실에서 도입될 수 있다. 전형적으로 박테리아 세포들이 차가운 온도에서 2가 양이온(대체로 염화칼슘이 이용됨)을 포함하는 용액 내에 노출이 되면 DNA에 대해 수용적인 상태로 변한다. 염화칼슘은 세포막을 부분적으로 파괴하며 재조합 DNA가 숙주세포로 들어올 수 있도록 해 준다. 이후 열 충격(heat shock)을 가해 형질전환을 일으킨다. 염화칼슘과 같은 물질을 이용하여 박테리아 세포벽을 유연화시켜 DNA 흡수에 용이하도록 도와줄 수 있다.Ⅳ.실험 도구 및 재료UV spectrophotometerShaking incubatorwater bath37℃ incubatorCentrifugeClean benchAutoclaveLB(Luria-Bertani) broth50MLLB plate cintaining ampicillin200MLTransformation buffer18MLE.coli Top10 stock1mLLigation 된 gene300MLIPTG10MLX-gar20ML1)실험 도구 2)재료Ⅴ.실험과정① D.W 100m에 LB broth 2g과 agar 2g을 넣어 녹인 후, autoclave를 한다.② Autoclave 된 배지가 따뜻한 정도가 될 때까지 식혀준다.(ampicillin은 열에 약해 적당히 식힌다)③ 50㎍/ml ampicillin을 넣고, 4개의 petri dish에 적당히 나눠서 부어준다.(물방울이 생기지 않도록 조심한다)④ D,W 50mL에 LB broth 1.25g을 넣어 녹인 후, autoclave를 한다.⑤ E.coli Top10 stock 1mL을 autoclave된 LB broth 50mL에 접종한 후, 37℃ 1.5시간 배양한다⑥ 배양한 E.coli Top10을 4000g로 10분간 centrifuge 한 후, 상층액만 제거한다.⑦ pellet을 Transformation buffer 15mL에 부드럽게 풀어준 뒤, 얼음에 15분동안 넣어둔다.(15mL을 넣으면 Ca²?의 양을 5배 증가시킨다)⑧ 4000g로 10분간 centrifuge한 후, 상층액만 제거한다.⑨ pellet을 Transformation buffer 3mL에 부드럽게 풀어준 뒤, 얼음에 1시간동안 넣어둔다.(3mL을 넣어 농도를 높혀서 DNA와 Competent cell의 더 접촉되도록 함)⑩ competent cell 200㎛를 ligation cell에 넣고 잘 섞히도록 손으로 살짝 흔들어준다.⑪ 섞은 후 4℃ 얼음에 30분 보관한다.⑫ Heat-shock을 진행하여 먼저, 42℃ water-bath에서 2분간 둔다.⑬ water-bath에서 꺼낸 튜브를 바로 4℃ 얼음에 2분간 둔다.(Ca²로 벌어지고 흐물해진 세포를 그자체로 굳게 만들고 결합이 잘 되도록 하기위함)⑭ 얼음에서 꺼낸 튜브에 1ML LB배지를 넣고 37℃ 1시간동안 incubation한다.(세포 42℃에서 4℃로 온도변화로 인해 스트레스 받은 것을 LB배지로 영양분을 주고 휴식 취할 수 있도록 함)⑮ 4℃/4000G에서 10분동안 Centrifuge한다.? Competent cell 용액 중 500㎛을 따서 버린다.(농도를 진하게 만들기 위함)? LB배지 300ML을 넣어주고 피펫팅으로 뭉쳐져 있는 세포를 풀어준 후 고체배지에 넣는다.(colony가 고르게 퍼지도록 양을 늘리기 위해 넣음)? IPTG 10ML과 X-gal 20ML도 고체배지에 넣는다.
