미생물 실험 결과 레포트1) IPTG의 단백질 발현(expression) 원리에 대해 조사 (Keyword : T7 promoter, lac operon)플라스미드 벡터는 오페론과 젖당유도체를 사용하는 pET 시스템입니다. 숙주 대장균의 lac repressor는 원래 pET 벡터 시스템의 T7 RNA 중합효소를 억제하고 있지만 젖당(혹은 젖당 유도체)이 lac repressor에 결합하면 T7 중합효소가 발현되고, 이는 벡터 시스템의 T7 프로모터에 결합해 목표 유전자가 발현되도록 만듭니다. pET vector는 protein over expression을 위하여 제작된 vector로, T7 promoter의하여 조절됩니다. 이 promoter바로 앞에 target gene을 쉽게 넣을 수 있는 MCS (Multiple Cloning Site)를 가지고 있습니다. 이 T7 promotor가 작동하기 위해서는 T7 RNA polymerase가 필요합니다. 왜냐하면 이 T7 RNA polymerase가 T7 promoter에 부착되어야 T7 promoter가 작동을 시작하고 target gene은 발현될 수 있습니다. 그런데 E.coli를 배양하는 배지에는 lactose가 결핍되어 있습니다. pET vector에는 lac repressor(억제자)를 생성하는 lac I gene이 존재하기 때문입니다. 이 lac I gene은 lactose(젖당)이 없을 시 lac repressor를 생산해 버립니다. 이 repressor는 T7 promoter의 operon부분에 붙어서 T7 polymerase가 결합할 자리가 부족하게 됩니다. 따라서 배지에 lactose의 유사물질인 IPTG를 넣어주면 됩니다. Lactose 또는 IPTG존재 하에서 lac I gene은 더 이상 repressor를 생성하지 못하고 이제 T7 polymerase가 결합할 자리가 만들어집니다. 따라서 전사가 시작되고, 이 프로모터의 downsteam에 있는 유전자들의 전사가 일어나므로 목표 유전자 (target gene)를 T7 promoter의 downstream에 끼워 넣으면, 목표 유전자도 함께 전사됩니다. 따라서 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 는 젖당 분해 억제 단백질(lac repressor)에 결합하여 젖당 작동부위(lac operator)에서 알로스테릭한 방법으로 4량체의 억제제를 분비하는 것이고, 이 화합물 젖당 대사물(lactose metabolite)로서 락 오페론(lac operon)의 전사를 개시합니다. 이러한 이유로, 유전자가 lac operon 통제 하에 있을 때 단백질 발현을 유도하는데 쓰입니다. 대장균은 젖당을 가수분해할 수 있는 β-galactosidase라는 효소를 가지고 있습니다. 젖당을 사용해서 발현 유도를 한다면 처음에는 발현 유도가 활발하게 일어나지만, 나중에 가면 젖당이 분해되어 버려서 발현유도가 어려워집니다. 그러나 IPTG의 경우, 젖당과 같은 단백질 발현 유도 역할을 하지만 β-galactosidase에 의해 가수분해 되지 않습니다. 따라서 IPTG의 농도는 처음에 넣어준 만큼 그대로 유지될 것이고, 이는 매우 강력한 단백질 발현 유도 효과를 얻게 해줍니다.2) cell growth curve에 대해 설명주로 세포를 배양 할 때 회분배양법이 주로 사용되는데 이는 용기 내에 일정량의 배지를 넣고 세포를 접종하여 일정한 시간동안 배양하는 방법입니다. 이때 세포의 생장 상태를 관찰해보면 총 4가지 단계로 이루어져 있습니다. cell growth curve의 각 단계별 특성은 다음과 같습니다.(1) 유도기 (lag phase)는 미생물 개체군이 신선한 매질에 접종되었을 때 성장이 바로 나타나는 것이 아니라 유도기라고 불리는 시간이 지난 후 일어납니다. 세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 RNA, 효소 및 기타 물질들을 생합성하고 있는 준비기간으로 대사활동이 왕성하고 세포는 커지지만 분열은 하지 않습니다. 유도기는 미생물의 종류, 배지와 생육환경에 따라 다르고, 대수성장기의 배지를 같은 성장환경에 있는 매질에 접종하면 유도기가 나타나지 않는 경우도 있습니다.(2) 대수 성장기 (exponential phase) : 유도기를 거쳐 새로운 배지에 적응된 미생물의 세포가 최대 속도로 분열 증식하는 시기입니다. 미생물 세포수가 증가하는 속도와 전체 미생물 세포의 질량이 증가하는 속도가 같은 균형성장을 하는 시기이며, 이 시기는 각 세포의 평균 구성비가 거의 일정하게 유지되며 영양 농도가 크기 때문에 성장속도는 영양 농도의 영향을 받지 않습니다.(3) 정상기, 정지기 (stationary phase) : 보통 세포분열을 계속하던 세포들이 일정한 수에 이르면 세포분열을 멈추게 됩니다. 즉, 전체적인 세포 개체수의 증가나 감소가 없는 시기로 영양소의 고갈이나 생육저해물질의 축적, 공간의 부족 등 개체군의 성장을 제한하는 요소들에 의해 대수성장이 저하되는 시기이며, 정상기의 미생물 세포는 대수증식기의 세포보다 크기는 작으나 저항성이 강하며 세포 외 효소의 생산과 배출이 활발합니다. 또한 항생물질이나 독소 등의 2차 대사산물을 생산하며 내생포자 형성균의 경우 이 시기에 포자를 형성합니다.(4) 감소기 (death phase) : 정지기에 세포분열을 멈추고 있던 세포들은 결국 시간이 지남에ㄸㆍ라 죽게 되어 세포 수의 수적 감소를 보이는 감소기에 이르게 됩니다. 이는 에너지의 고갈, 세포 구조의 파괴 및 세포 구성물질의 분해, 효소의 불활성화 등으로 인한 재생능력 상실로 세포수가 감소하는 시기입니다.
