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LDH assay 평가A+최고예요

LDH assayintroductionLDH assay objective-젖산탈수소효소의 활성을 측정한다.LDH 역할-세포질에 풍부하며 해당과정을 하는 세포에 필수적으로 들어있고 해당과정에서 lactate가 만들어지면 LDH가 젖산이 pyruvate로 산화될때 NAD+는 NADH로 환원하는 과정을 촉매하는 enzyme이다.LDH assay principle- 젖산탈수소효소는 일반적으로 세포막을 통과하지 못하여 세포 밖으로 배출되지 않으나, 세포막이 손상되거나 세포가 죽는 경우 media로 방출된다.이때 방출된 LDH는 세포가 죽어간다는 신호로써 산화환원반응에서 NAD+가 NADH로 환원되는 반응을 통해 NADH(340nm)흡광도를 잴수도 있지만 자외선 영역이므로 눈으로 볼수 없기 때문에 가시광선범위로 유도하는 coupling assay를 하여 WST(연노랑)물질을 WST-formazan(450nm)으로 전자를 받은 상황의 진한 노랑을 눈으로 확인하여 볼수 있는 전형적인 biochemical assay이다.cytotoxic treat1.rotenone-미토콘드리아 complex1의 inhibitor2.triton x 100-positive control로 사용되며 세포막을 투과시키게 해서 세포를 용해하고 단백질과 세포소기관을 추출할 때 사용한다.plate 구성하는 control group1.background control- media의 LDH를 측정한다. 보통 cell culture media에는 FBS가 들어있는데 이런 혈청들은 실험 결과에 많은 영향을 끼치며 FBS가 들어있지 않은 serum free media나 background control을 줘서 media에 함유된 LDH를 구해서 보정한다.2.volumn control-assay media 100 ul에 lysis solution 10 ul을 첨가해서 high control 에서 늘어난 volumn을 보정한다.3.low control-실험중 자연적으로 손상된 세포에서 방출되는 LDH를 측정4.hig도 있는지 순도를 알수 있다.효소활성 측정법end point assay-시작점과 특정시간 지난 사이를 측정하는 것으로 너무 초기일때는 반응값이 작아서 잘모를수 있고 너무 오래두면 log곡선 때문에 휘어져 나와 원래 효소활성보다 적은 값이 나올수 있다. 측정은 간단하나 상대적으로 오차의 가능성이 있는 단점이 있다.kinetic assay-전체 시간 동안 계속 측정을 하는 것으로 상대적으로 직선인부분의 속도와 곡선부분의 반응 추이를 본다.material&methodday1. cell seedingmaterial-serum free media DMEM ,PBS, Trypsin EDTA, DMEMmethod1. incubator에 culture flask를 가져와서 media를 수거한다2. serum free media로 wash해준다. (지금 사용하는 세포가 민감해서 바로 PBS로 wash를 하면 손상을 줄수 있기 때문이다.)3. PBS로 한번 더 wash한다.(media에 있는 성분들이 trypsin EDTA의 활성을 방해하기 때문에 세포가 flask에서 잘 떨어지지 않을수 있기 때문이다.)4. PBS를 수거하고 trypsin EDTA를 넣어줘서 incubator에 반응 시킨다.5. 떨어진 세포를 새로운 media에 넣어주기 위해서 새로운 tube에 media를 담아준다. (media에는 FBS가 함유되어 있는데 FBS는 trypsin EDTA활성을 중단시켜서 세포가 flask에서 떨어진 후에도 세포에 damage를 줄 수 있다.) 세포가 떨어지기 시작하면 pipetting하여 세포가 flask에서 떨어지게 한 뒤 FBS가 들어있는 media로 옮겨준뒤 원심분리 한다.6. 세포를 새로운 곳으로 옮겨주기 위해서 새로운 flask와 실험에 사용할 96 well plate를 준비한다. 세포를 counting 하여 세포수를 맞추어 seeding해야하기 떄문에 세포 수를 셀수 있는 hemato cytolysis를 준비한다.7. 원심분리가 끝나면 세포의 pallet이 보이고ialrotenone, triton x 100,method1. serum free media를 이용해서 각 물질들을 원하는 농도로 준비한다. triton이 끈적거리므로 1%농도로 먼저 만든후 희석해서 나머지 농도를 맞추어준다. (tip을 넣어 속으로 10초정도 생각하여 원하는 volumn을 얻고 겉에 있는 triton도 제거해야 원하는 농도로 희석이 가능하다. ) voltexing하여 triton을 잘 섞어준다.2. 사용하는 로테논은 10mmol로 미리 희석한 용액 media를 이용해서 원하는 농도로 희석한다. 물질들을 voltexing하여 잘 섞는다.3. incubator에서 사용할 plate를 꺼내서 배지를 제거하고 serum free media로 wash 해준다. media 는 100 ul씩 well에 넣어준다. 다시 배지를 제거하고 물질을 처리한 구간에는 serum free media를 50 ul씩 넣어주고 control구간에는 serum free media 100ul 씩 넣어준다.4. 물질을 50ul 씩처리한다. 이때 wash하거나 물질 처리시 주의한다. 피펫을 세포가 있는 부분에 너무 세게 넣으면 세포가 벗겨질 가능성이 있기 때문에 벽면을 향해서 넣어준다.5. 모든 물질들을 넣어주면 세포를 seeding 할 때처럼 plate 네 모퉁이를 쳐서 섞익[ 하고 co2 incubator에서 24 시간 배양한다.day3. LDH 측정materaillysis buffer, centrifuge, wst substrate mix, plate readermethod1. cell lysis solution을 인위적으로 세포를 죽여 최대 LDH방출량 알기 위해서 high control과 volumn 이 늘어난 high control을 보정하는 volumn control에 well 당 10ul씩 넣어주고 세포가 들어있는 high control 부분에 pipetting해준다. 상온에서 5분간 반응시킨다.2. 떠 있는 세포를 침전시키기 위해서 centrifuge (60으로 reservoir 에 담아 well 당 100ul씩 넣어준다. (빛을 보면 안되기 때문에 바로 호일로 감싸 빛을 차단시켜 상온에서 30분간 반응시킨다.6. 기기 setting한다. 흡광도 450nm설정하고 plate type을 clear로 되어있는지 확인한후 sample에 있는 위치를 지정해준다. 30분간 10분마다의 간격으로 설정하고 흡광도를 측정하기 전에 shaking 해야하므로 첫 shaking 과 중간 마다 shaking을 해주도록 한다. 기계에 넣어 작동여부를 확인한후 30분간 기다린다.7. cytotoxicity를 계산한다.resultcytotoxicity를 계산하여 비교해보았다.(experiment-background control)-(low control-background control) /(high control- volume control)-(low control-background control)에 대입하여 tritone X 100만 처리하였을 때 농도별로 구해보았다.1%2.3331-0.6282/2.3318-0.6282(1.704)약 100%0.1%2.4086-0.6282/2.3318-0.6282약 104.7%0.01%2.3595-0.6282/2.3318-0.6282약 101.7%0.001%0.6181-0.6282/2.3318-0.6282약 ?1%control약 ?1%같은 식에 대입하여 rotenone 만 처리하였을 때 농도별로 구해보았다.00.7542-0.6282/1.704약 7.39%251.1951-0.6282/1.704약 33.27%501.4933-0.6282/1.704약 50.7%1001.8387-0.6282/1.704약 71.1%이번에는 rotenone과 triton(1%)을 같이 처리한 경우이다control-1%T + RO O2.3495-0.6282/1.704101.1%T + RO 252.3759-0.6282/1.704102.5% 약 103%T + RO 502.3963-0.6282/1.704103.7% 약 104%T + RO 1를 죽게 하는 독성물질 넣어서 세포를 사멸시켜 LDH가 나오겠금했다. 그 후 샘플 에서 흘러나온 배양액의 일부를 well 에 옮겨 효소반응시작을 하였는데 NAD+와 WST를 추가해서 반응을 보았다. 이것은 산화 환원 반응을 통해서 LDH에 의해 NAD+가 NADH로 환원되고 NADH의 전자를 받아서 WST가 formazan 이라는 발색물질을 생성하기 때문에 450nm에서 흡광도를 측정하여 보기 위함이었다. 흡광도를 측정하여 LDH의 활성이 높고 낮은 정도를 볼수 있는데 이것은 LDH활성이 높으면 정상세포에 비해서 세포가 많이 죽은 것을 나타내므로 흡광정도도 많아지고 세포생존률이 줄어드는 결과를 나타내게 된다. DAY1에서 한 실험에서 background control은 media 의 LDH를 측정하는것인데 이것은 cell culture media에 FBS가 들어가있으므로 이것이 실험결과에 영향을 끼쳐서 serum free media나 background control을 한다고 하셨다. FBS는 소태아혈청으로 배지에 주로 포함되어있다고 한다. DAY2에서 한 실험에서 우리는 control group에서 세포를 강제로 죽여 LDH를 구하는 high control이 있는데도 triton을 처리하였는데 그 이유는 LDH assay를 할 때 어떠한 화합물은 방해를 할수 있어서 세포가 죽었지만 negative control처럼 수치가 적게 나오는경우가 있다고 한다. 또한 로테논은 실험에서 처음 사용하는 것이라서 어떻게 나올지 몰라서 tritone과 로테논 각각 농도별로 넣고 triton은 positive control이라서 세포가 죽은 상태지만 로테논도 같이 처리함으로써 negative로 나오는지 보기 위해서 둘이 섞은 군 까지 총 3개의 실험군을 두었다. DAY3에서 LDH를 측정하는 과정에서 우리는 LDH reaction mix를 만들고 빛을 차단해야해서 호일로 감싸는 과정이 있었는데 이것은 아마도 흡광도를 측정하는데 있어 해당하는 흡광도외의 영역에서 영향받는 것을 되었다.

자연과학| 2021.06.01| 5페이지| 4,000원| 조회(705)

흡광도, 실험 레포트, LDH ASSAY

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western blot

western blot Introductionobjective단백질 혼합물로부터 분리된 특정 단백질을 identificationprincipleelectro transfer-sds-page로 크기대로 분리한 단백질 그대로 Nitrocellulose membrane에 electro transfer하는것으로 gel과 밀착시켜 앞뒤로 전기를 걸어주면 gel에 있는 단백질들이 앞 또는 뒤로 빠져나와 membrane에 붙는다.이때 transfer buffer는 (Tris-base, glycine, 20% methanol)인데 20%methanol이 들어가는 이유는 gel에서 membrane으로 단백질이 잘 빠지도록 돕고 남아있는sds-detergent가 떨어져나와 membrane에 단백질이 순수하게 흡착되도록 한다.blocking, 항원-항체반응-AP단백질만을 인식하는 항체를 membrane에 붙여서 확인한다. 만약 항체가 AP에 특이적이라면 band가 보일 것이다.항체도 단백질이기 때문에 막에 단백질들 사이 빈자리에 비특이적으로 붙을수 있기 때문에 빈 부분을 비특이적인 단백질(skin milk, bovine serum)을 이용해서 코팅하고 항체가 자기의 항원 ( AP) 에만 특이적으로 결합하게 한다.BSA는 혈장 내에 다량 함유되어 있는 단백질로서 총단백질의 약 60%를 차지하고 있다. skim milk는 우유에서 지방을 제거한 우유이다. BSA는 여러 단백질보다는 항체가 반응하지 않는 한가지 단백질로 blocking을 할 때 사용하며 skim mlik는 casein이라는 단백질이 들어있는데 casein은 phosphorylation된 형태로 존재하기 때문에 Phospho form specific antibody가 binding 할 가능성이 많다. 또한 skim milk에는 단백질 뿐만 아니라 여러종류의 carbohydrate가 들어있기 때문에 이들이 일부 antibody의 antigen과의 recognition site를 masking할 가능성이 있다.Antiboduffer가 새지 않도록 잘 맞추어준다.gel 판을 고정한다.3. 조립된 assembly를 buffer tank에 넣어준다.4. sds gel running 에는 1x sds buffer(running buffer)가 들어간다. 이 조성에는 tris-glycine-sds)가 있다. 조립한 gel의 안쪽부터 넣어준다. 이때 tank가 절반정도 잠기도록 충분히 넣어준다.5. sample을 loading 할 준비를 한다. sample을 voltex로 섞고 centrifuge에 넣는다. centrifuge할때는 sample간 balance를 맞추는 것이 중요하다. spin down으로 cooking하는데 이것은 뚜껑에 붙은 수증기를 down 시키기 위함이다.6. sample loading한다. (protein marker 2ul를 따서 gel의 well에 먼저 loading한다. 단백질 크기를 알수 있도록 marker를 사용)다음으로 sample을 차례대로 15ul씩 loading한다. 첫 번째 protein mixture, 두 번째 flow through 30-1~200-2까지 동일하게 loading후 sample이 들어가지 않은 well 에는 volumn을 맞추기 위해 1x sample buffer 15ul를 넣어준다. protein marker가 들어간 well에는 13ul를 loading시켜 맞추어준다.7. loading 끝난후 running을 시작한다. electrode assembly에 ? 극과 +극을 잘 확인 한후 뚜껑을 닫는다. 80v까지 올리고 running시작한다. running시작하고 assembly에서 백금에 bubble이 올라오는 것을 꼭 확인한다. 15분정도 지나면 marker가 분리된 것이 확인된다. 120v까지 올리면 또다시 bubble이 올라오는 것을 확인하고 중간에 band가 어디까지 내려왔는지 확인한다.(running 동안 buffer가 중간에 새거나 전극에 오류가 있을 수도 있으므로 error날 수 있으니 잘 관찰한다)파란색 ban셔야한다. membrane이 마르지 않도록 buffer를 뿌린다.4.buffer tank에서 assembly를 꺼내어 gel을 분리한다. gel releaser를 이용해서 앞판 뒷판 사이를 벌려서 유리판을 분리한다. gel releaser를 이용해서 stacking gel부분을 제거하고 sample gel이 없는 가장 밑부분도 잘라낸다. gel 이 찢어지지 않도록 주의해서 유리판에서 gel을 분리한다.5.gel을 들어올려서 marker가 왼쪽으로 오도록 뒤집어서 buffer에 넣어준다. 이때 sds buffer가 transfer에 방해될수 있으므로 gel을transfer buffer에 충분히 닦아준다.6.gel을 들어서 membrane에 올리고 buffer를 뿌려준다.gel releaser를 이용해서 gel 과 membrane 사이에 bubble이 들어가지 않도록 살살 밀어준다.7.나머지 3m paper한장을 buffer에 적셔서 gel위에 올려준다. gel releaser로 gel과 membrane이 잘 밀착되도록 밀어준다.8.스펀지를 buffer에 충분히 적시고 3m paper위에 올린다9.검은판(-)을 덮고 cassette를 완성한다. transfer과정에서 열이 발생하므로 4도 냉장실에서 진행한다. 완성된 cassette를 전극을 잘 확인후 transfer tank에 넣어준다. 전극을 연결하고 80v에서 2시간 동안 transfer를 진행한다.10.transfer가 끝나면 기계를 끄고 cassette를 꺼낸다. cassette를 열어서 membrane을 꺼낸다. membrane에 marker가 잘 넘어갔는지 확인한다.11.미리 준비한 dw3차 증류수에 membrane을 넣고 transfer buffer로 씻어준다.12.ponceau S를 준비한다. 이것은 cummassi blue처럼 모든 단백질을 염색하지만 보다 더 destaining이 쉬워서 transfer가 잘 질행되었는지 확인할 때 주로 사용한다.ponceau S를 membrane에 넣고 염색시킨 않았는지 확인할수 있다.blocking metarialdestaining하는 동안 blocking solution(5% Skim milk)을 만든다. 보통 BSA 나 Skim milk를 사용, 1g skim milk, 20ml0.05% TBSTblocking method1.skim milk가 들어있는 conical tube에 0.05%TBST넣어준다.2.skim milk와 TBST가 들어간 conical tube를 rocker에 올려서 skim milk가 녹을 때까지 섞어준다.3.ponseau S가 다 빠진 것을 destaining 통해서 확인하고 만들어둔 5% skim milk를 4ml넣고 rocker에서 1시간동안 blocking 한다.cf. blocking은 단백질이 붙어있지 않은 membrane 부분을 덮어줌으로써 antibody에 non specific binding을 줄이는 과정이다. 이때membrane에 blocking solution 을 골고루 묻힌후 실온에서 한시간동안 blocking한다.4.blocking에서 사용한 skim milk를 버리고 다시 5% skim milk를 4ml넣어준다.5.primary antibody를 준비한다. 우리 실험에서는 alkaline phospate antibody사용하는데 skim milk 에 1:3000으로 희석하여 처리한다. (antibody 1.3ul: skim milk 4ml)이때 희석시키는 비율은 항체의 종류에 따라서 달라질수 있다.6.상온서 2시간 동안 incubation 시킨다. 끝난면 wash를 진행한다. 1차 항체가 들어있는 skim milk 버려주고 다시 0.05% TBST를 4ml넣고 5분동안 rocker에서 wash를 4번 반복 진행한다. 이때 TBST가 막에 직접적으로 닿지 않게 벽면을 통해서 뿌려주는 것이 좋다7.wash 끝나면 TBST버려주고 5% skim milk를 4 ml넣어준다.8.secondary antibody HRP 가 conjugated된 rabbit antibody사용비교해서 내가 원하는 size에 나왔는지 check한다.resultDiscussion우리는 blotting할 때 사용할 막으로 nitrocellulose membrane을 사용하였다. 이것은 비특이 항체에 대해 결합차단이 빠르고 효율적이라서 또 다른 PVDF membrane보다 실험실에서 더 많이 사용된다고 한다. transfer과정에서 gel쪽을 (-)극에 붙도록 조립하여 membrane(+)극에 전기적 성질로 이동하겠금 했다. 조립과정에 있어 스펀지와 3mpaper를 사용하였는데 이때 스펀지와 filter paper의역할은gel과 membrane을 고정시키는 기능을 했다. 전기적성질로 gel 이 membrane에 이동하는 것은 이해되었는데 스펀지를 왜 사용하는지 궁금했다. 스펀지을 buffer에 충분히 적셔서 위에 올리는 과정이 있었는데 이과정은 gel이 membrane이동시 잘 흡착되도록 모세관현상을 이용한 것이라고 조사과정중 알게 되었다. transfer를 할 때 4도 냉장실에서 진행을 하는데 이것은 transfer동안 전류의 흐름으로 인해 열이 발생하고 온도가 올라가게 되면 gel 과 membrane사이 air bubble이 생길수 있어 실험에 영향을 줄수 있기 때문이다. 우리는 blocking 과정에서 bsa대신 skim milk를 사용하였다. phospho 항체들은 조사한 바로는 skim milk의 카제인 때문에 오히려 bsa를 쓰는 것이 좋다고 했는데 실제 실험실에서는 non specific binding을 차단에도 효과적이고 경제적인면에서 skim milk를 사용한다고 한다. blocking 후 antibody reaction에서는 TBST를 넣고 wash를 여러번 반복하는 과정이 있었는데 이 과정은 더 자주 세척함으로써 나중에 detection에서 나올 backgroud를 줄이기 위함인 것 같았다. 실험 결과사진에서 보면 band가 size marker와 비교했을 때 분석하고자 하는 단백질의 크기와 비교적 일치했음을 보였다. 전에 했던 실험에 같다.

자연과학| 2021.06.01| 5페이지| 2,500원| 조회(471)

전기영동, 실험 레포트, 웨스턴 블랏

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면역 침강법 immunoprecipitation

cell culture& counting실험 목적 및 원리세포를 배양하여 살아있는 세포와 죽은세포의 counting을 통해서 세포의 생존률을 계산한다.실험재료cell, medium, PBS, 1%Trypsin-EDTA, 15ml tube, culture dish, pipette, 6well10ul tripan blue, Hemocytometer,현미경실험방법1. 소독을 완벽히 처리한 상태에서 기구를 준비한다.2. media에 labeling한다.( 10% FBS와 antibiotics를 넣을 것) 날짜를 기입한다. FBS50ml 10%를 넣어줄것이므로 media 50ml을 덜고 FBS를 media에 넣어준다. antibiotics는 1% 5ml넣어준다. 이때 pipet aid로 넣어주고 흔들어서 섞는다.3.HEK 293 T cell을 incubator에서 가져오고 10cm dish에 있는 것을 사용하는데 기울여서 suction 한다. PBS를 사용하여 wash 하고 다시 기울여서 suction한 후 pipet aid로 Trpsin을 넣어준다. 1ml를 dish에 천천히 sjRrh 기울여서 전체적으로 펴지도록 한다.4. cell 이 떨어지는 동안 cell counting에 필요한 물품을 준비하고 cell떨어뜨려서 잠시 보관할 15mltube를 준비한다. 떨어진 세포는 counting을 위해 옮긴다.5. 만들었던 media 4ml을 집어넣고 분주한다.6.pipeting 후 15ml tube에 담는다 . counting한다.7.15ml tube에서 10 p pipet으로 10ml를 추출하여 1.5ml tube에 담고 trypan blue를 10ul추출하여 1.5ml tube에 넣어 pipeting 한다.8.coverglass를 hemocytosis 에 넣어주고 현미경으로 밝기를 잘 조절하여 관찰한다.transfection실험 목적 및 원리외부로 들어온 plasmid DNA가 자체 SV40 Origin을 가져 T-antigen이 그 부위를 활성화시킴으로써 plasmipipette, plasmid( Flag-A) PEI실험방법1. 4개의 FLAG A 단백질 plasmid와 A가 빠진 FLAG를 가진 공백vector를 준비한다.2. SF DMEM serum free media를 200ul 씩 각 tube에 넣어주고 한쪽에는 FLAG 공백VECTOR에 5ul넣어준다. FLAG A plasmid 5ul 넣어준다.3. PEI는 1:2의 비율로 10ul 2번 넣어준다.4. 10분후 culture안에 dish 2개 준비하여 FLAG A , FLAG vector labelling한다.5. 모든 시료를 따서 살짝 기울여서 dish에 넣어준다.6. 천천히 흔들어서 37도 incubaor에서 배양한다.IP(IMMUNOPRECIPITATION)실험목적 및 원리bead는 눈에 보이는 agarose구슬인데 여기에 항체를 달아주어 미지시료에 존재하는 여러 단백질중에서 FLAG를 가진 A단백질만 당겨온다.실험재료cell plate, 1% NP40 IP buffer, 0.1% NP40 IP washing buffer, FLAG bead, 1.5ml tube, pipette, rotator, centrifuge, voltex, ice실험방법1. 키우고 있던 배지를 제거한 후 PBS 2ml로 washing 한다. pipet aid로 PBS를 제거한다.2. FLAG A vector 와 공vector를 labeling 하고 PBS를 1ml씩 dish에 넣어준다. 각 dish를 긁어서 labelling한 곳에 넣어준다3. harvest된 tip에서 세포만 down시키기 위해 상층액은 버린다.4. 4도씨 centrifuge 1000rpm 3분 시킨다. 바닥에 하얗게 깔리 세포를 확인한 후 상층액을 따낸다. 이때 pipette로 조심히 상층액을 따내는데 밑에 부분의 세포는 lysis시켜서 세포막이 분해 되고 단백질을 추출한다. IP buffer 1%로 lysis하는데 pallet의 상태를 보고 대략 300ul 정도 IP lysis buffer를 넣어준다. pipe6. 얻은 단백질 시료를 bead 이용해서 우리가 원하는 단백질인 FLAG A단백질만 얻도록 IP를 수행한다.7. FLAG antibody가 conjugation된 bead를 이용해서 FLAG A만 끼운다. 이때 FLAG A가 들어가지 않은 단백질은 control로 작용한다.8. 준비한 FLAG bead( 아래층) PBS(상층) 1:1로 만든 것을 자체로 50ul사용하고 FLAG bead는 25 ul사용한다.9. tip을 살짝 가위로 잘라 tip구멍이 좀 넓어지면 이 상태로 FLAG bead를 pipetting 하여 넣어주고 rotator돌려 반응시킨다.10. 0.1% IP buffer를 이용해서 1ml정도 넣어준다.11. 3시간 overnight 반응 시키는데 단백질 시료여서 4도씨 반응 시킨다. 3시간 후 bead만 얻어낸다. 상층제거시 1000tip에 10p를 꽂아서 bead가 딸려오지 않겠금 천천히 제거한다.12. washing buffer를 500ul정도 넣어주고 washing 한다.13. 약하게 voltexing 후 20 초 동안 spin down시킨다. 3번 반복.14. 우리가 원하는 bead를 추출하여 가시적으로 확인위해 western blot진행한다.western blot진행 위해서 sample 제작1. 2x buffer를 25 ul 씩 넣어준다. 약하게 tapping후 voltexing한다2. 95 도씨에서 5분간 boiling 한다.western blot1. loading ( marker negative control FLAG SAMPLE)순으로 한다.2. stacking gel 에서 3분간 70v running gel에서 1시간 110v로 running 시키고 transfer3. membrane 꺼내서 확인 후 말려서 단백질 A표시하고 PBTF membrane 에서 불필요한 부분 제거하고 western blot .실험 결과cell counting- 우리의 box내의 cell 평균개수는 60개로 cell count 공식에 대입하여 60 * 살아있는 세포는 trpan blue로 염색이 안되기 떄문에 반짝거리는 부분을 볼수 있었고 검은얼룩은 죽은 세포로 염색된 부분이 보였고 쪼그라들어 있었다. 투명한 부분을 세서 확인한다.western blot 결과 FLAG A 단백질의 size는 110kda 근처에서 나왔는데 IP가 잘 진행 되었음을 볼수 있었다. 또한 70Kda근처에서 2줄이 나왔는데 그 부분은 nonspecific한 단백질이었다고 추측할수 있다. 50 kda 에서와 26 kda에서 는 각각 heavy chain 과 light chain이 나왔음을 알수 있는데 이것은 FLAG bead에 붙어있던 antibody가 단백질의 특성상 열에 약하기 때문에 95도 boiling 할 때 bead 에 붙은 antibody가 heavy chain 과 light chain으로 나누어지면서 떨어진 현상이다. 이는 western blotting이 IP를 이용한 결과라고 증명이 될수 있었다.discussion이번 실험은 immunoprecipitation을 통해 단백질의 위치를 눈으로 확인하도록 western blotting을 진행했다. 이과정에서 먼저 세포배양을 실시했다. cell culture 하면서 PBS로 washing을 하는데 PBS는 생리식염수로 세포를 세정시 사용한다. 이때 물로 사용하지 않는 이유는 세포를 물로 세척시 삼투압으로 동물세포는 터질수 있기 때문에 삼투압을 안정시키면서 이물질을 깨끗하게 제거하고자 함이었다. 그 후 분주 하는 과정에서 media에 trypsin을 처리하였는데 이것은 기본적으로 실험실에서 쓰는 많은 세포주들이 plate 바닥에서 붙어서 살아가는데 일부 면역세포나 stem cell같은 경우 배지에 부유한 상태로 살아가기도 하지만 우리가 다룬 hek293 T cell의 경우 부착해서 살아가므로 trypsin으로 배양용기벽에서 세포를 뗴어주는 과정이 필요했다. 세포를 couting 할때는 trpan blue와 cell media를 총 1:1로 총 20ul pipetting하였기에 희counting 후에는 trasfection을 진행하였다. 이때 우리는 FLAG A 가 있는 plasmid와 A가 없는 공벡터를 따로 준비하였는데 그것은 western blot 확인 시 A가 있는 쪽의 SAMPLE에 A 만 나오는 것을 확인하기 위함이었고 공벡터 부위는 A 단백질이 검출안되는 것을 확인하기 위한 negative control을 보기 위해 각각을 준비하였다. 이후 과정에서 시료를 dish에넣을 때 살짝 기울여서 진행하였는데 이것은 세포쪽으로 바로 싸버리면 세포가 약하게 붙어있어서 압력 때문에 떨어질수 있어서 기울여서 천천히 진행했다. 그 다음으로 IP를 진행했다. 1% NP40 IP buffer를 사용하는데 이것은 detergent 로 세포막을 분해시켜서 세포내 내용물을 밖으로 용출하기 위한 역을 하여 세포를 lysis하기 위해 이용하였고 0.1% NP40 IP washing buffer는 NP40과 조성은 비슷하지만 0.1%들어가서 약하게 detergent 시키는 washing을 위함이었다. FLAG bead 단백질을 rotator돌릴 때 IP buffer 0.1% 이용해서 1ml정도 넣어주었는데 volunm이 너무 작으면 bead 가 벽면에 붙을 수 있어서 처리하였다. rotator후 상층에 단백질 제거하는데 우리가 원하는 bead에 붙은 단백질만 보기위한 것으로 상층에 단백질 lysis시킨 sample이 모두 들어있어서 제거를 잘해주는 것이 필요했다. 다음에 washing buffer를 처리하는데 남아있는 bead와 nonspecific하게 붙은 단백질들을 떨어뜨리기 위해 진행한것이었다. spin down 후에도 어느정도 bead에 이물질이 남아있을 수 있어서 주사기를 이용해서 끝까지 다 빨아드리는 과정을 진행했다. 마지막으로 western blotting으로 가시적으로 bead에 원하는 단백질이 붙어있는지 그 size를 이용하여 보기 위해서 진행하고 실험이 마무리되었다. 결과에서는 IP 로 진행하였기 때문에 항체를 사용했으므로 항체를 이루 .

자연과학| 2021.06.01| 5페이지| 2,500원| 조회(222)

실험결과, 생명과학실험, 면역 침강법

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Using the UCSC Genome browserNGS( Next Generation Sequencing)- Sanger Sequencing과 달리 대량의 병렬 데이터 생산(Massive parallel sequencing)으로 유전체의 염기서열을 고속으로 분석(Highthroughput sequencing) 하는 기술로, 하나의 유전체를 수많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽은 후 전산기술을 이용하여 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하는 방법.Human Genome Project-사람의 30억개 base pair모든 염기서열을 알아내고자 하는 목적으로 1990~2003년까지 진행된 대형 프로젝트로 염기서열 뿐만 아니라 유전자 종류, 기능도 밝히고자 했고 이 프로젝트의 결과로 환자와 정상인 사이 유전자 차이를 찾고 개인별 맞춤 의료에 적용하는 등 다방면으로 활용이 가능 하다는데 큰 의의가있다. 이 프로젝트는 미국 주도하에 영국, 일본, 프랑스, 독일, 중국 과 같은 나라들이 모여 함께 진행하였고 중간 Next generation sequencing( NGS)같은 기술의 발전으로 좀 더 빠른속도로 서열을 분석할수 있게 되어 15년으로 예상했던 프로젝트를 2년 단축시켜 2003년에 종료할수 있었다. 서열을 알아내는 것은 이해할수 없는 언어로 쓰인 책을 읽는 것과 같아서 human genome을 더욱 더 이해 하기 위해서 human genome project이후에도 다양한 인종으로 구성된 인간1000명의 유전체를 해독하는 1000 Genome project 나 인간 유전체의 functional element를 알아내는 ENCODE PROJECT 등의 다양한 프로젝트들이 진행되었다.ENCODE PROJECT는 전체적으로 게놈을 이해하려는 노력의 일환으로 제안된 프로젝트이다. ENCODE란 ‘Encyclopedia of DNA Elements’의 약어로서 유전자의 구조나 형태, 프로모터 부위에 대한 분석을 포함하여 DNA가 감고 있는 히스톤 단백rough draft가 나온 것은 2000년이고, 그당시 정확도가 99.99%라 했지만 몇 년 뒤 기술발전 등의 이유로 다시 확인해 보니 아직 몇몇 군데 비어있는 것을 확인하고 2009년 genome reference consortium을 만들어서 human genome의 계속된 version을 update하여 진행하였다. 이렇게 알게된 human genome sequence의 first draft를 좀 더 많은 사람들과 공유하고 다양하게 분석하도록 적용하여 개발된 것이 UCSC Genome Browser이다.UCSC Genome Browser는 2000년 UCSC Genomics institue에서 만들었고 human genome project에서 조각난 sequence를 assemble하는 program을 개발하여 human genome sequence를 만들어 구성하는데 큰 공을 세운 james kent가 funding을 받아 만들었다. UCSC Browser에서는 다양한 종의 sequence정보를 graphical 하게 볼수 있고 다양한 annotation정보도 확인가능하다. 원하는 정보분석이 가능하도록 여러 가지 tool들이 함께 탑재되어있다.BRCA는 유방암 유발성 유전자(breast cancer susceptibility gene)를 뜻하며 유방암 외에도 난소암과 밀접한 관계를 가지고 있다. BRCA 유전자에는 두 종의 다른 유전자인 BRCA1 과 BRCA2가 포함된다. BRCA1 과 BRCA2는 염기서열이나 단백질 서열 상 완전히 다른 유전자이나 둘 다 종양억제유전자(tumor suppressor gene)로서 변이가 일어날 경우 유방암과 난소암의 발병률이 높아지는 것이 공통점이다. BRCA1과 BRCA2 유전자는 유방과 유방상피세포를 포함한 다양한 조직과 세포에서 발현된다. 이들이 암호화하는 단백질의 가장 잘 알려진 역할은 손상된 DNA의 수선과 회복이다. 유전자의 염기서열 또는 단백질의 기능에 결손이 있을 경우 암이 발생하는 이유가 여기에 있해 만들어졌다.GTFx Transcript track?각각 transcripton별로 발현을 보는 track으로 어떤식으로 splicing 되고 translating되는지에 따라서 isoform이 다르므로 id가 각각 붙고 같은 gene이지만 transcripton id는 다를수 있다.ENCODE track-여러 cell type에서 transcription level을 보여주는 track으로 transcription factor clusters는 chip- seq를 통해 알아낸 DNA 의 transcription factor binding site가 어디인지, protein 이 어디에 봍는지 볼수 있다. transcription 색깔마다 다른 cell line들이 어느정도인지 보인다.conservation track- human 이외 다른 100가지 종에 의해 conserved된 sequence를 종들끼리 비교하면 어느부분이 conserved되어 있는지 표시해주는 track이다.variation section에서 dbsnp153 모든 사람이 같은 genome은 아니므로 polymorphism이 있듯이 다른것들을 정리해 놓은 databasemethod가설: brca2유전자는 종양억제유전자로 돌연변이시 유방암이 나타날 수 있는데 이와관련하여 유방과 유방상피세포에서 주로 발현될것이라고 가정.확인하기 위해 GTFx gene track 과 GTFx transcript track을 사용한다.1. UCSC genome browser에 접속한다.2. 가장 많이 쓰이는 version 인 GRCH38을 사용하였다3. 가장 기본적인 것부터 configuration 해준다4. 하단 track별로 모아둔 table형식을 확인하여 track을 조정한다.5. 조직별로 발현하는 정도를 알고 싶었기에 transcription track을 사용했고 그 외 추가적인 정보들을 알아보기위해 나머지 tool을 사용했다.GTFx track configuration1.발현하는 정도만 보기쉽게 우선 hl3. 비교를 위해서 GTEx gene/transcription을 full4. target으로 정해지지않은 부위만 다시 searchresultdiscussionUCSC Genome browser를 이용해서 알고 싶은 유전자의 정보를 여러 가지 tool을 이용해서 알아보는 실험이었다. 여성암 1위인 유방암과 관련된 유전자를 알고싶어서 BRCA2를 조사하였다. 당연히 유방조직과 유방상피세포에서 발현이 가장 뚜렷 할 것이라고 생각했기 때문에 가설을 이에 맞게 유방조직세포에서 BRCA2 유전자가 가장 많이 발현될 것이다 라고 세웠다. expression section에서 사용한 GTEx gene track을 사용하였고 이것은 RNA seq를 통해 각각 조직별로 유전자가 얼만큼 발현되는지 보는 것이었다. 가설대로 라면 breast 부위에서 peak를 형성할 것이라는 결과가 나와야했지만 transformed lymphocyte와 fibroblast에서 주로 나왔다. BRCA는 종양억제유전자인데 암이 발생되는 것은 BRCA에 돌연변이가 생겼을 때 나타나는 것으로 따라서 평상시 정상적으로 작용할때는 BRCA가 DNA 수선에 관여하기 때문에 굳이 특정조직에 많이 있을 것이라는 내 가설은 틀렸음을 알수 있었다. 결과에서 transcript track을 같이 적용하여 보았는데 여기서는 여러개의 transcripton ID가 나왔음을 볼수 있다. 각 ID 별로 전사체도 다양한데 이것은 같은 BRCA유전자라도 alternative splicing을 하여 전사체가 다양하고 isoform이 다양해서 생긴 결과인 것 같다. 다음으로 regulation section에서 encode track을 적용했다. trascription을 보면 색깔이 다양하게 나왔는데 이것은 다른 cell line들임을 나타내고 어느정도 인지 색을 클릭하여 알수 있었다. 주로 주황색인GM12878/ 자주색 NHEK/NHLF cell line들에서 많이 나왔음을 확인했다. TF cluster를 통해 CEBPB fac분의 peak가 형성되는데 이부분은 phylop와 같이 보았을 때 phylop에서도 같은 패턴으로 peak가 형성되었다. 여러 종에서도 계속 나타나는 부위임을 알수 있었다. phylop값의 패턴과 transcript 의 부분을 비교해보고자 track을 같이 사용하여 나타내었는데 패턴이 다름을 볼 수 있다. 이부분은 중요한 부위는 아닌걸로 추측되었다. 마지막으로 variation section에서 dbsnp153 track을 사용하여 모든사람마다 가지고 있는 snp의 특징을 나타내는 형태를 볼수 있었다. 각 염기서열쌍 부위에 다양하게 존재하는 snp가 나타나는 것을 확인했다. 실험영상으로 염색체서열을 분석하는 프로그램을 직접 참여볼수 있는 기회가 주어졌지만 처음본 기술들이어서 그런지 적용이 쉽지만은 않았다. 평소 여성암에 대한 연구를 하고 싶었고 현재 1위로 갑상선 암과 함께 유방암이 선두를 하고 있기 때문에 많이 들어본 유전자를 선택했다. 실제 UCSC browser를 사용해보니 유전자를 이용한 맟춤치료가 개인별 가능하다는 것을 가시적으로 확인할수 있었다. 특히 아미노산의 순서를 지정해서 그부분만 확장시켜 연구하는 분야에서 굉장히 최적화된 방법으로 연구를 할수 있을것같았다. 아미노산 하나의 변화로도 돌연변이가 생길수 있는데 그에 맞는 아미노산이 몇 번째인지 찾아내고 search한다면 돌연변이의 표현형적변화뿐만 아니라 어떤 조직에서 가장 많이 발현되는지도 말이다. crispr track은 전체 인간(hG38) genome에 걸쳐 Cas9 효소를 사용하여 CRISPR RNA guide에 의해 표적이 가능한 DNA sequence를 볼수 있었는데 조직별로 비교한 GTEx track과 비교하여 보았다. 우선 crispr track에서 색별로 guide가 표적하는 정도가 달랐고 나는 그중에서도 회색과 진회색으로 나온 부위 (아무 표적이 안된부위)만 따로 search하여 GTEx track과 비교해보았다. 처음 설정했던 범위의 GTEx track에서는 조직별 고르게 발현

자연과학| 2021.06.01| 6페이지| 5,000원| 조회(187)

A+, 데이터생산, 유전체정보해독

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