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[결과레포트] In-sol digestion

[생화학실험 post-report]1. Subject: In-sol digestion4. Date & Experiment[전체 순서]① Denaturation → ② Reduction → ③ Alkylation → ④ Dilution → ⑤ Digestion[Buffer]Dilution buffer100mM ABC buffer (pH 8.0)Denaturation8M ureaReduction1M DTTAlkylation1M IAADigestionsample : trypsin = 50 : 1 의 trypsin suspension[Procedure]1) Denaturation(45min)① urea의 농도가 적어도 6M이 되도록 sample, ABC buffer ( pH 8.0 ) 와 혼합한다.제작 방법 : 100 μl solution = 75 μl 8M urea + 25 μl sample ( 90 μg )* volume이 최소 100 μl가 되어야 한다. ( 다음 step에서 1M DTT를 100배 희석하는 단계가 있기 때문이다.)② Sonication (10min), vortexting (30sec~1min), spindown의 과정을 3번 반복한다.(in RT)2) Reduction (1hr)① 위 용액에 1M DTT를 넣어 10mM의 농도가 되게 한다.DTT (154.3g/mol) → 4개 조 분량154.3g/mol`` TIMES `(1 TIMES 4 mu l)`` TIMES ` {1mol} over {1L} TIMES {10 ^{-6} L} over {1 mu l} = 0.6172 mg② at RT, 45min ~ 1hr 반응한다.3) Alkylation (30min)① 위 용액에 1M IAA를 넣어 30mM의 농도가 되게 한다.IAA (184.96g/mol) → 4개 조 분량184.96g/mol`` TIMES `(2 TIMES 4 mu l)`` TIMES ` {1mol} over {1L} TIMES {10 ^{-6} L} over {1 mu l} =1.ion하는 이유는 trypsin도 protein이기 때문에 urea에 의해 denaturation 되므로, 그것을 방지하기 위해 urea의 농도를 옅게 하는 것이다.5) Digestion① Sample의 양과 trypsin의 양이 50:1이 되도록 trypsin을 넣는다.sample : trypsin = 50 : 1 (w/w) = 90 μl : 1.8 μl20 μg trypsin = 80 μl ABC buffer에 용해 → 20 μg : 80 μl = 1.8 μg : 7.2 μl② 37°C, 12h 반응한다.*반응 후에는 quenching한다. (용액의 pH를 낮추어 trypsin의 활성을 멈춘다.)TFA를 0.1%가 되도록 첨가한다. → 하지만 보통 pH가 2~3정도 되도록 paper test 하면서 맞춘다.*speedvac. 단계 없이 바로 desalting 한다.5. Discussion: 이번 실험은 대표적인 digestion 방법인 in-sol digestion과 in-gel digestion의 원리를 살피고, In-sol digestion을 실험해봄으로써 bottom-up proteomics process의 기본을 익히는 과정이였다. in-sol digestion과 다른 digestion 방법을 비교하면?[A1] in-sol digestion vs filter-based method그림 1 Bottom-up process: 단백질 실험에서 detergent로 많이 쓰이는 SDS는 단백질을 쉽게 용해하기 때문에 많이 쓰인다. 그러나 SDS는 LC system을 오염시키고 질량 스펙트럼에 영향을 미치기 때문에 질량 분석에서는 매우 치명적인 요소이다. 이런 detergent를 제거하는 가장 유명한 digestion 방법은 Manza et al.의 spin filter를 사용하는 Filter-aided sample preparation (FASP)이 있다. 이 방법에서 SDS를 포함한 단백질 시료는 필터를 거치게 되고 8M urea로 SDS micelle이 법은 5%의 SDS에서 단백질을 용해시키고 phosphoric acid와 methanolic buffer solution을 첨가하여 단백질 입자 suspension을 형성시킨다. suspension은 필터에 가둬지고, 한 번의 세정 단계로 잔여 SDS가 씻겨져 나갈 수 있다. 질량 분석에서 S-trap 방법은 다른 filter-based 방법에 비해 시료 준비 단계가 적고, 시간이 덜 소요된다는 장점을 가지고 있다.▶ in-sol digestion- 소요 시간과 가격이 유리- 단백질 식별 정도가 낮고 정량 재현성이 낮음- urea 농도를 1.5M 아래로 낮추는 dilution 과정이 있기 때문에 trypsin의 효율도 급감할 수 있음.▶ FASP-base digestion- 효과적이지만 가격과 필터로 인한 추가 금액 및 소요 시간 발생- Urea-based와 SDS-based FASP는 필터의 균일성 부족으로 매우 다른 단백질 식별 결과를 보임.▶ S-Trap- 많은 수의 단백질 식별이 가능하고 정량적 재현성이 높음- 보통의 in-sol digestion보다 적은 시간을 필요로 하고 SDS을 사용할 때 유용함.- lysis 조건에 관계 없이 3가지 중 최적의 방법- Trypsin의 missed cleavage 면에서 S-trap이 가장 trypsin의 효율이 좋음.그림 2 실험 Workflow( 위 자료는 Katelyn R. Ludwig, Monica M. Schroll, and Amanda B. Hummon의 Comparison of In-Solution, FASP, and S?Trap Based Digestion Methods for Bottom-Up Proteomic Studies를 바탕으로 기술하였습니다.)[A2] in-sol digestion vs in-gel digestionin-sol digestionin-gel digestion특징- 용액에 포함된 단백질을 digestion- 다량의 단백질의 동시 digestion 가능- sample을 gel ele 오염 확률이 더 작음.- detergent와 buffer의 제거가 용이- gel electrophoresis에서 단백질이 크기에 따라 밴드를 형성하며 분리되기 때문에 선택적인 band 분석이 가능단점- 불순물 제거가 어려움.- 원하는 단백질의 선택적 분석이 불가능- 추가적인 desalting 단계가 필요- gel에 단백질을 여과하고 빼내는 작업이 필요해 loss가 크고 yield가 낮음.- 효소와 gel의 phase가 다르기 때문에 컨디션 유지가 중요함.- gel을 다루는 과정 중에 오염 위험 존재- trypsin이 다량 필요 desalting 이란?그림 3 desalting 예시: desalting이란 용해성 거대 분자를 보다 작은 분자에서 분리하는 것을 말한다. 일반적으로 물로 교환하여 buffer salt를 제거하는 것을 목표로 할 때 desalting이라고 한다. desalting의 응용은 단백질 용액에서 salt 제거, 핵산 조제용 물질에서 phenol 또는 비통합 nucleotide 제거, 과도한 crosslinking, labeling 또는 derivatization reagent와 결합 단백질 분리에 응용된다.단백질 샘플이 porous resin 컬럼을 통과하면 buffer exchange 및 desalting을 할 수 있다. 아래 그림에서 원래 샘플(빨간색)의 작은 분자는 구슬 구멍으로 들어가 단백질(노란색)보다 컬럼을 통과하는 경로가 길고 느려진다. 그 결과 단백질은 원래의 buffer salt에서 분리되어 컬럼 buffer로 교환된다. TFA란?그림 4 Trifluoroacetic acid ( TFA ): TFA는 아세트산보다 더 강한 산으로 약 34,000배 더 높은 pKa 0.23이다. 저농도의 TFA는 유기 화합물, 특히 펩타이드 및 작은 단백질의 분리를 위해서 흔히 HPLC에서 ion pairing reagent로 사용된다. 이동상의 pH를 조절하여 용출력에 영향을 끼친다. 하지만 MS에서 사용시 강한 이온 억제 효과와 LC-M매도 제거할 수 있으며 과열 현상의 일종으로, 액체가 끓는점 이상에서 핵 형성 작용(이물질의 유입 등에 의해)이 생기는 경우 갑자기 끓어 올라 용기 외부로 액체를 내뿜는 현상인 돌비 현상이 일어나지 않아 시료를 안전하게 처리할 수 있다.그림 5 Speedvac (Thermo Scientific) 이번 실험에서 denaturation reagent로 urea가 쓰인 이유는?: urea는 desalting 과정에서 쉽게 제거될 수 있으나 yield가 낮고 denaturation 효과가 비교적 작다. 그러나 실험에서는 detergent인 SDS와 urea의 수율이 거의 비슷하고 불순물을 urea가 더 잘 제거할 수 있다. 또한 SDS는 denaturation 효과는 우수하나 desalting 과정에서 잘 제거되기 어려워 MS spectrum에 영향을 미칠 수도 있고 컬럼 내에서 굳어버릴 수도 있다. Digestion 효율을 높이는 방법은?: 먼저 온도의 증가를 꼽을 수 있다. thermostable protease의 경우는 thermal denaturation에 의해 digestion의 속도를 상승시킨다. 예를 들어 trypsin의 reductive methylation은 2차 구조의 강직성을 증가시켜 thermostability를 증가 시키고 따라서 온도가 상승함에 따라 반응 속도가 더 빨라진다.다음으로는 유기 반응 가속에 효율적이라고 알려진 microwave irradiation이 있다. protease degradation 없이 protein 분해를 가속화 시킴이 이미 증명되었고 산 가수분해의 경우 높은 온도에서 몇 시간 소요되기 때문에 microwave를 이용하기 적합하다. microwave-assisted acid digest은 electrochemistry-MS와 함께 하여 tryptic digestion과 비슷한 수준으로 분해가 가능해진다.초음파 역시 digestion 효율을 높이는데 일조한다. 초음파는 55°C 이하의 온도에서 효과적이고 본래 bath당한다.

자연과학| 2021.07.16| 8페이지| 2,500원| 조회(158)

포스트, 생화학실험, 결과, in-sol digestion, in-gel dig..

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$HPLC fractionation$

HPLC fractionation

[생화학실험 report]1. Sμbject 실험 제목: HPLC fractionation3. Object 실험 목표: 널리 이용되는 HPLC의 기본 원리를 이해하고 high pH에서의 HPLC를 실험한다.4. Principle & Discussion 실험 원리 및 고찰1) 크로마토그래피 분리의 평가(1) 분리능: 2개의 접근한 peak의 분리의 정도를 나타내기 위하여 분리계수 및 분리도를 다음과 같이 정량적으로 정의하여 사용한다.분리계수(d) = t_R2 over t_R1분리도(R) = {2(t_R2 - t_R1 )} over {W_1 + W_2 }t_R1: 도입점으로부터 peak 1의 최고점까지의 길이t_R2:시료 도입점으로부터 peak 2의 최고점까지의 길이W1 : 피이크 1의 좌우 변곡점에서의 접선이 자르는 바탕선의 길이W2 : 피이크 2의 좌우 변곡점에서의 접선이 자르는 바탕선의 길이해상도가 좋을수록 두 peak들의 겹침이 적어진다. 분리는 오직 두 peak 최정점(a) 사이의 거리와 시간일 뿐이다. 해상도는 a와 peak들의 폭을 설명할 수 있다. 기준선 해상도는 1.50의 해상도수를 가질 때 발생하지만, 두 peak들 사이에는 기준선이 없다. 1.50보다 큰 수들은 peak들 사이에 기준선이 있음을 나타내며, 1.50보다 작은 수들은 어느 정도의 합용리가 존재함을 의미한다. 그림 2.에 예들이 있다.그림 2 Resolution Examples(분리도 예)(2) 분리관효율: 분리관 효율은 보통 이론 단수 또는 이론 단에 해당하는 분리관의 길이 HETP(Height Equivalent to a Theoretical Plate)로 표시하며, 크로마토그램 상의 peak로 부터 다음 식에 의하여 구한다.이론단수rm N=16({{{t_r} } over {W })^2 },H~=~ { L} over {N }~=~ { L} over {16 } { ( { W} over { { t}_{R } }) }^{2 }tr : 시료도입점으로부터 피크 최고점까지의 길이(유지시간)over D_L CDOT ud_f: 충전제 입자 위의 정지상 액체의 막 두께DL : 성분 분자의 정지상 액체 중에서의 확산계수위와 같은 요소를 모두 더하면 컬럼 효율과 관련된 Van Deemter 식을 구할 수 있다.H = A+ {B over u} + C CDOT u: Van Deemter 식실제론 이 식으로부터 HETP를 계산하지 않으며 H를 적게 하기 위해서 어떤 크로마토그래피의 조건을 선택하면 되는지를 나타내는 식이다. Van Deemter 식을 도식화 하면 다음과 같다.그림 5 컬럼 효율과 운반 기체의 유속H를 극소로 하는 운반 기체의 선속도가 존재하고, u는 극소점보다 클 때가 작을 때보다 유리하다. df가 작을수록 극소점 오른쪽의 기울기가 작아지며 입자가 가는 충전제를 채우면, H축의 절편이 작아져서 확산계수가 큰 운반 기체에는 적당하지 않다. 충진제 액상은 확산계수가 큰 것이 좋다.그림 6 수소, 헬륨, 질소 등의 운반 가스수소는 가장 빠른 운반 가스로서 (uopt), 최적의 선속도인 40cm/sec를 가지며 가장 평형에 가까운 Van Deemter 도표를 보여준다. 선속도 20cm/sec를 가지는 헬륨이 차후 선택된다. 질소의 성능은 capillary 컬럼에서는 좀 질이 떨어지는데, 12cm/sec에 달하는 느린 선속도 때문이다. 아르곤-메탄 혼합가스는 질소보다 좀 더 낮은 선속도를 가지고 있으며, capillary 컬럼의 운반 가스로는 적합치 않다. 공기 또한 운반 가스로 적합하지 않은데, 정지상의 산화(stationary phase oxidation)을 유발할 수 있기 때문이다.모세관 컬럼의 경우는 충전 컬럼과는 다르다. 모세관(ro : 0.1~0.15mm의 가는 관) 안쪽에 두께 df의 액상을 코팅했다고 하자.H = 2D_g over u + {1+6k'+11k'^2} over 24(1+k')^2 + r_o^2 over D_G CDOT u + 2 over 3 CDOT k' over (1-k')^2 CDOT d_f^2 over D_L CDOT on), 강력한 초음파를 이용하여 탈기하는 방법(ultra-sonication) 등이 사용된다.? 송액장치 - Pump: HPLC 시스템의 펌프의 역할은 이동상으로 사용되는 용매를 저장 용기로부터 시료주입기를 거쳐 컬럼으로 연속적으로 보내어 최종적으로는 검출기를 통과한 후 이동상인 용매와 시료 주입기를 통해 주입된 시료가 밖으로 나올 수 있도록 압력을 가해 주는 장치이다. 따라서, 펌프는 일정한 압력과 유속을 유지할 수 있도록 해야하며, 다양한 용매를 사용할 수 있으며, 또한 용매에 대한 내구성이 뛰어나야 한다. 펌프의 종류에는 Isocratic pump와 Gradient pump 가 있다. Isocratic pump(단일용매펌프)는 분석 시간 동안 이동상 용매 조성의 변화가 없고 Gradient pump는 분석 시간 동안 이동상 용매 조성의 변화를 조절할 수 있다.< Q > HPLC에서 이동상이 가져야 하는 적절한 조건은?< A > 이동상(용매)은 적합한 물리적 성질을 가져야 한다. 다음은 적합한 물리적 성질의 조건이다.① 유기용매는 매우 순수해야 하고, 물의 경우 저항도(Resistivity)가 18㏁ 이상이어야 한다.② 점도(viscosity)가 낮아야 한다. 점도가 높은 경우 펌프에 압력이 비이상적으로 높게 걸리는 결과를 가져온다.③ 시료와의 혼화성(miscibility)의 차이가 15보다 작아야 한다.④ 시료에는 Good-solvent, 정지상에는 Poor-solvent이어야 한다.⑤UV를 흡수하지 않아야 한다.⑥굴절률(Refractive Index)이 낮아야 한다.이동상(용매)은 시료를 너무 빨리 용출시키거나 너무 늦게 용출시키면 안되기 때문에,용매의 세기가 적당하더라도 각각의 시료 성분에 대해 용매 선택성이 있어야 한다. 마지막으로 적절한 Buffer를 사용하여 한다.- Solvent reservoirHPLC 유리병 또는 Erlenmeyer 플라스크 등 특별한 조건은 없으나 용매와 화학적인 상호작용이 없어야 한다.- Solvent Inlet fil를 비롯한 여러 detector의 특징(4) 분리 메커니즘에 따른 HPLC 분류① 흡착 크로마토그래피 (adsorption chromatography)흡착 크로마토그래피는 1203년 러시아의 식물학자 Tswstt가 식물색소의 분리에 이용한 데서 비롯되었으나 1930년대에 이르러 물질을 효과적으로 분리하는 방법으로 널리 이용되기 시작하였다. 흡착크로마토그래피에 있어서는 혼합물의 성분들이 흡착제의 층을 따라 이동하는 동안에, 각 성분의 흡착성의 차이로 말미암아 각각 일정한 자리에 흡착되면서 분리된다. 흡착제로서는 주로 알루미늄, 실리카겔, 활성탄, 수크로옷, 칼륨의 무기염[, ]등이 주로 쓰인다. 흡착제를 산으로 처리하거나 가열하면 그 흡착능력이 크게 증가되는 수가 있는데, 이를 흡착제의 활성화라고 부른다. 극성이 작거나 그다지 크지 않은 화합물은 흡착 크로마토그래피로 잘 분리되지만, 극성이 매우 큰 화합물을 분리하는데는 이 방법이 적당하지 않다.② 분배 크로마토그래피 (partion chromatography)분배 크로마토그래피에 의한 분리는 두 가지 종류의 서로 혼합되지 않는 용매 사이에서 혼합물들이 두 용매에 대한 분배계수가 다른 원리를 사용한다. 이때 한 용매는 정지상의 구실을 하고 다른 용매는 이동상의 구실을 하여 물질을 분리하는데, 이 때 정지상의 지지체에 따라 종이 크로마토그래피, 얇은막 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 억류분배 크로마토그래피 등으로 분류하며 용도에 따라 다양하게 여러 종류의 불질의 분리에 이용된다. 가장 많이 이용되는 방법으로 분자량이 3000 이하인 분석물질에 적용 가능하다.③ 이온교환 크로마토그래피 (ion exchange chromatography, IEC)IEC는 zeolite, 합성 유기수지 또는 합성 무기수지를 사용하여 시료와 수지 사이의 이온 강도에 의하여 성분을 분리시키는 것이다. 따라서 수지와 친화력에 있어 차이가 있으면 그 친화력의 차이를 이용하여 어떤 성분을 분리시킨다. IEC로 분석하는 대표적인 것이 아미노피를 선택하는 것이 바람직하다. 그러나 모든 분석 방법이 그렇듯이 절대적으로 좋은 방법은 없으며 수많은 여러 사람들의 보고와 실험자의 경험에 의하여 분석할 액체 크로마토그래피를 결정하는 것이 좋다.그림 18 시료의 특성에 따른 LC 선정 방법⑤ 친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography)시료가 컬럼을 통과할 때, 친화 리간드와 선택적으로 결합하는 분자만이 머무르게 되고, 결합하지 않는 분자는 이동상과 함께 컬럼을 통과한다. 리간드에 원하는 분석물질 분자가 강하게 결합, 원하지 않는 화학종은 제거되는 것이다. 원하지 않는 분자를 제거한 후, 머무른 분석물질은 리간드의 상호작용을 약화시키거나 제거하여 용리할 수 있다. 이는 pH나 ionstrength 등 이동상의 조건을 변화시킴으로써 가능하다. 항원-항체 반응으로 제조 과정 중의 생체 분자를 빠르게 분리하는 데 주로 사용된다.3) 2D-Chromatography: 포괄적 이차원 액체 크로마토그래피(2D-LC)는 LC x LC로 종종 표현되며 1D-LC 대비 훨씬 증가된 분리능을 제공할 수 있기 때문에 복잡한 샘플분석일수록 활용 가능성이 더 높다.1차원과 2차원 분리에 다양한 액체 크로마토그래피의 분리메커니즘을 적용할 수 있는데, RP x RP(역상 x 역상)의 조합이 대표적으로 사용된다. 1D-LC를 뛰어넘으면서 2D-LC를 통해 획득할 수 있는 분리능 향상을 극대화하기 위해서는 두 개의 분리가 서로에 대해 영향을 미치지 않는 ‘분리의 직교(orthogonality)가’ 이루어지는 것이 중요하다 (이것은 컬럼 2개를 직렬로 연결하는 것과는 엄연히 구분되는 하드웨어 및 분리 조건임을 기억해야 한다).그림 20 LC x LC에 대한 분리 메커니즘 조합별 비교4) Acetonitrile: Acetonitrile(ACN)은 용이한 liquid range와 38,8의 높은 유전 상수를 가지고 있다. 쌍극자 모멘트가 3.92D이기 때문에 광범위한 이온 및 비극성 화합물을 용해시키며 투명한 UV를 차단하

자연과학| 2021.07.16| 21페이지| 2,500원| 조회(391)

MS, HPLC, 생화학실험, high pH

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[예비레포트] in-sol digestion

[생화학실험 pre-report]1. Sμbject 실험 제목: In-solution Digestoin4. Object 실험 목표: 대표적인 digestion 방법인 in-sol digestion과 in-gel digestion의 원리를 살피고, In-sol digestion을 실험해봄으로써 bottom-up proteomics process의 기본을 익힐 수 있도록 한다.5. Principle 실험 원리(1) Proteomics: 유전자의 기능을 밝히는 총체적인 연구분야를 "Functional Genomics" (이하 유전체기능분석학) 라고 정의 하며, 여기에는 기술적으로 DNA 나 RNA를 시료로 사용하여 수행하는 지노믹스(Genomics: 이하 유전체학), 단백질을 대상으로 연구하여 유전자기능을 연구하는 프로테오믹스(Proteomics: 단백질체학-편의상 이하 프로테오믹스라고 칭한다), 그리고 이 두 분야를 지원하는 바이오인포매틱스(Bioinformatics: 이하 생물정보학)로 각각 구분된다.프로테옴(proteome) 이란 말은 어원적으로 단백질체 (protein-body (-some) 라고 풀이 할 수 있으나, 실제로는 게놈(Genome)의 상대어로서 의 합성어로 인식되고 있는 말 이다 (Williams K. & Hochstrasser DF, 1997). 프로테오믹스는 프로테옴(proteome)의 어미에 ∼학, ∼론을 의미하는 접미사 -ics 가 붙어 프로테옴을 연구하는 방법과 technique을 포괄적으로 의미하는 말로, 굳이 번역한다면 '프로테옴분석학' 이라고 해야 할 것이다. 즉, 단백질의 성질을 발현, post-translational modification, 다른 단백질과의 결합에 초점을 두어 연구하여 세포 내 변형과정과 네트웍 형성을 질병의 진행과정과 연계시켜 총괄적으로 이해 할 수 있는 연구 분야를 뜻한다.프로테오믹스의 목표를 나열하자면 다음과 같다. 첫째, 프로테오믹스는 기능을 갖는 단백질들의 발현을 종합적이고 정량적으로 측정하는 가장 된다. 이 접근법의 장애물은 다중 전하를 띤 생산 이온으로부터 생산 이온 질량을 결정하는 것이다. 이는 하향식 MS-MS 스펙트럼의 해석에 모호성을 유발할 수 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해서 두 가지 방식이 이용된다. 첫 번째는 기체 상 이온-이온 상호 작용을 통한 전하 상태 조작이고, 두 번째는 높은 자기장을 가진 FT-ICR과 같은 질량 측정 정확도 (MMA)가 높은 기기를 사용하는 것이다.ECD는 TDP에서 단백질의 MS-MS에 선호되는 기술이며 주로 FT-ICR 기기에서 구현된다. ECD의 주요 장점은 단편화 과정에서 PTM을 보존하여 부위 별 PTM 분석이 가능하다는 것이다. ETD는 기체 상 이온-이온 화학을 사용하는 ECD와 유사한 기술으로 단일 하전 된 음이온은 다중 하전 된 단백질 전구체 이온에 전달하여 단백질 backbone을 따라 조각화 시킨다. ECD와 ETD는 모두 상용 MS 기기에서 사용할 수 있다.TDP 의 주요 이점은 완전한 단백질 서열에 대한 잠재적 인 접근과 PTM을 찾고 특성화하는 능력이다. 또한 BUP에 필요한 시간 소모적인 단백질 분해가 필요하지 않기 때문에 걸리는 시간을 절약할 수 있으며, top-down 분석은 샘플 준비를 최소한으로 만들고 여러 PTM(post translational modification)의 손실을 예방한다. 단백질 isoforms, 서열 변이, 데이터 정규화 및 정량을 위한 단순화된 과정을 탐지할 수 있다. 따라서 분해 과정 없이 단백질 자체를 분석하는 TDP은 단백질의 번역후변형 또는 생체 내에서 일어나는 단백질 분해 과정 연구에 용이하다.TDP는 bottom-up proteomics에 비해 상대적으로 신생 분야이며 현재 몇 가지 한계가 있다. 첫째, 다중 하전 단백질에 의해 생성된 매우 복잡한 스펙트럼은 분리 된 단백질 또는 단순한 단백질 혼합물 정도만 사용할 수 있도록 제한한다. 둘째, 분석을 위한 기기 (FT-ICR, hybrid ion trap FT-ICR or hybrid ion 매와 함께 peptide digests의 고해상도 분리를 할 수 있으며. 역상 LC-ESI-MS-MS는 완전 자동화될 수 있으며 BUP에 거의 보편적으로 사용된다. 또한 여러 정량, 정석적 기술들과 기기들이 구비되어 있기 때문에 분석을 하는데 있어 편리하다.이런 BUP에는 몇 가지 근본적이고 실질적인 한계가 있는데, 먼저 단백질의 전체 펩타이드 중 극히 일부만이 확인된다. 따라서, 단백질 서열의 일부에 대한 정보만 얻을 수 있다. 또한 PTM에서 비롯되는 인산화, 글리코실화 같은 단계는 단백질 기능과 세포의 조절에 중요한 것으로 알려져 있는데, BUP의 제한된 서열 적용 범위로 인해 PTM에 대한 많은 정보가 손실된다. 또 복잡한 단백질을 분석하기 위해 역상 LC-MS-MS 분석을 하면 최대 15시간 이상의 긴 실행 시간이 필요하다. 비록 자동화될 수 있지만, 다차원 LC-MS-MS의 처리량은 상당히 제한적이다. 다른 문제로는 고농도의 단백질이 지배하는 질량 스펙트럼에서 저농도 펩타이드에 대한 정보가 손실될 수 있다.그림 2 proteomics methods : Top-down vs bottom-up(https://www.creative-proteomics.com/services/overview-of-top-down-proteomics.htm)표 1 Top-down과 bottom-up proteomics 비교ProteomicsBottom-upTop-downprotein digestionyesnodetection of PTMyesyesanalyzed sample formspeptide fragmentsfull-length proteinsdetection efficiencyrelatively lowsignificantly highstrengthwell-developed for analyzing small peptidessuperior method for protein level sequence and PTM identification(2) Digestion: Prigestion 전에 수행해주어야 한다. 단백질의 모양과 형태가 변하는 것이기 때문에 단백질 서열과 amino acid는 여전히 보존된다. 단백질을 가열하면 광학 활성, 점도, 자외선 흡수 등 단백질의 형태에 민감한 특성이 좁은 온도 범위에서 갑자기 변한다. 이와 같은 급격한 전이는 전체 폴리펩타이드가 협동적으로 즉, 동시에 풀리거나 녹는다는 것을 의미한다. 대부분 단백질의 녹는점은 100°C보다 훨씬 낮다 pH 변화는 단백질 곁사슬의 이온화 상태가 달라지게 만들어 단백질 전하 분포와 수소 결합 능력을 변화시킨다. 단백질의 무극성 잔기에 세제가 결합하면 단백질 구조 유지에 필요한 소수성 인력을 방해한다. 농도가 5~10M 정도인 guanidinium ion이나 urea같은 chaotropic agent는 가장 흔히 사용되는 단백질 변성제이다. chaotropic agent는 무극성 물질에 잘 녹게 해 주는 이온이나 작은 유기 분자이다. 이 분자들이 변성시킬 수 있는 이유는 이들이 소수성 인력을 깨뜨릴 수 있는 능력을 가지고 있기 때문이다.1) Urea: Urea는 다른 포유류와 유기체뿐만 아니라 인체의 다양한 생물학적 과정에 매우 활발하게 작용하는 화합물이다. 그것은 과도한 질소의 처리를 다루며 단백질의 변성작용을 하는 역할을 한다. Urea는 chaotropic agent로 알려진 화합물의 한 부류에 속하며, 원자 사이의 소수성 내부 비균형 결합을 불안정하게 하여 단백질의 3차 구조를 분해한다.단백질이 urea를 통해 변성되는 과정 중 하나는 수소 결합이 펩타이드 그룹과 같은 극화된 전하 영역에 직접적인 상호작용을 포함한다. 이러한 상호 영향은 분자간 결합과 상호작용을 약화시켜 전체적인 2차 및 3차 구조를 변화시킨다. 일단 이런 단백질 전개가 일어나면 물과 urea는 단백질의 소수성 내핵에 더 쉽게 접근할 수 있어 변성 과정을 가속화한다.urea는 또한 용매의 특성에 영향을 줌으로써 간접적으로 단백질을 변성시킬 수 있다. 혼합물에 비극성 용액을 넣는 것과 이하게 하기 위해 disulfide bond을 환원시킴으로써 단백질을 더욱 변성시키는 데 사용된다.그림 5 DTT를 이용한 desalting 예시(5) IAA와 IA를 이용한 Alkylation: -SH(thiol)은 매우 active한 functional group이다. 특히 ?SH는 ?SH끼리 만나 산화되어 disulfide bond를 형성하려는 경향이 강하기 때문에 비가역적 inhibitor인 IAA(Iodoacetamide)를 처리한다. 이는 cystein residue를 alkylation 하여 ?S-로 고정시켜 disulfide bond 형성을 억제한다. 즉, IAA는 alkylating agent로 cystein의 ?SH 활성을 차단한다. 산성 유도체인 IA(iodoacetate)와 비교했을 때, Iodoacetamide는 훨씬 더 빨리 반응한다.그림 6 IAA와 IA 구조그림 7 IAA의 alkylation(6) trypsin: 트립신은 인간과 다른 많은 척추동물의 소화기관에서 발견되는 세린 단백질 분해효소이다. 효소는 매우 특별한 기능을 가지고 있다. 아미노산 lysine의 카복실 쪽(K) 또는 arginine(R)의 카복실 C-terminal 에서 펩타이드 사슬을 분리한다. 다만, 둘 중 하나가 C-termical proline에 결합된 경우는 제외된다. 혼합물의 성분을 분리하고 각 성분을 식별하며 각 성분을 정량화하기 위해 사용되는 크로마토그래피 기법인 고성능 액체 크로마토그래피(High-performance Liquid Chromatography, HPLC) 등에서 trypsin digest는 sample의 단백질을 모든 K나 R로 쪼개는데 사용된다. 그리고 나서 이러한 펩타이드의 아미노산 서열은 질량 분석 방법에 의해 결정될 수 있다. 그러나 대부분의 장치는 아미노산 길이가 5에서 50 사이인 펩타이드의 아미노산 서열을 결정할 수 있는 검출 한계를 가지고 있다. 또한 단백질 사슬의 마지막 펩타이드가 K나 R로 끝나지 않으면 질량분석기에 .

자연과학| 2021.07.16| 12페이지| 2,500원| 조회(241)

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