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생명공학실험 TLC anaylsis

Abstract균주의 GAD, Protease, Cellulase, Amylase 효소 활성 여부를 TLC assay와 skim milk, CMC, starch배지를 이용한 Plate assay를 통해 판단하고 기능성 미생물을 찾아내는 것을 목적으로 한다. TLC assay에서는 TLC plate에 MSG, GABA, sample 2개의 균주를 찍고 sample에서의 MSG와 GABA 유무를 관찰했다. 이를 통해 GAD 효소의 활성을 갖는 균주를 분리한다. Plate assay에서는 MBLB1270, KIGAM252, KIGAM275, KIGAM416 균주에서 protease, cellulase, amylase 효소 활성을 갖는지 관찰한다. 각각의 효소는 skim milk, CMC, starch 배지에서의 균주 배양을 통해 관찰하고 효소 활성을 갖는 균주를 분리한다.Introduction1) TLC analysis: Silica gel 상의 sample이 올라가는 용매와 반응하면서 극성의 차이에 의해 여러 층으로 분리된다. TLC plate에서 MSG, GABA, sample의 층 분리를 통해 MSG, GABA의 유무를 확인하고, GAD의 활성여부를 판단할 수 있다. Sample의 층 분리에서 MSG와 GABA가 관찰된다면 일부 기질로써 사용되는 MSG가 decarboxylation 되어 GABA를 생성하고 일부는 미생물이 가지고 있는 효소에 의해 반응이 다 이루어지지 않았다고 볼 수 있다.2) Protease 활성 test: Skim milk 배지에 Protease 활성을 갖는 균주를 배양하면 배지에 존재하는 casein이 Protease에 의해 분해되어 clear zone을 형성한다. Clear zone의 생성여부로 Protease 활성 유무를 판단한다.3) Cellulase 활성 test: CMC 배지의 cellulose는 congo red와 수소결합을 통해 붉은색으로 염색이 된다. 1M NaCl 용액을 이용하여 탈색 시 colony 주변의 색 변화를 통ongo red 염색 시약, 1M NaCl 탈색 시약, Starch agar plate, Lugol’s iodine 염색 시약, Microorganisms (MBLB1270, KIGAM252, KIGAM275, KIGAM416), Needle, 알코올 램프2) Method-GABA production TLC analysis: TLC plate에 연필로 MSG, GABA, sample(MJF012, HYE1)의 위치를 기록하고 각 위치에 Plain capillary tube를 이용해 spot을 찍어준다. Chamber에 전개용매를 담고 silica gel paper를 약 50분간 담근다. 드라이기를 이용해 말린 TCL plate를 Ninhydrin 용액으로 염색하고 또 다시 드라이기로 말린 후 spot 변화를 관찰한다.-Protease activity test: Skim milk 배지를 4분면으로 나누고, 각부분에 균 이름을 적어 공간을 구분한다. 오염이 없도록 Clean bench 안에서 배지의 각 부분에 균을 접종하고, 30℃ incubator에서 48시간 동안 배양한다. 배양 후 형성된 colony와 clear zone의 지름을 측정한다. 서로 다른 방향으로 3번 측정한 후 평균을 계산한다. Relative ratio (= Clear zone의 지름/Colony의 지름 값)을 도출한다.-Cellulase activity test: 위의 과정과 동일하게 균주 배양을 진행한 후, 형성된 colony의 지름 측정한다. 배양된 plate 위에 congo red 용액을 떨어뜨려 20분간 염색한다. 20분 후, 1M NaCl 용액을 넣어 30분간 탈색한다. 탈색 후 형성된 clear zone의 지름 측정한다. 서로 다른 세 방향의 평균을 낸 후, Relative ratio 값을 도출한다.-Amylase activity test: 위의 과정과 동일하게 균주 배양을 진행한 후, 형성된 colony의 지름 측정한다. 배양된 plate 위에 Lugol’s iodine 용액을함. KIGAM252, KIGAM275는 colony와 clear zone이 관측되지 않음.Amylase 활성 plate,MBLB1270과 KIGAM416에서 colony와 clear zone이 관측 가능함. KIGAM252와 KIGAM275는 colony 형성은 관측되지만 clear zone이 관측되지 않음.2-2) 각 활성 측정값- Skim milk 배지MBLB1270KIGAM252KIGAM275KIGAM416Colony 지름 (1차,2차,3차)0.4, 0.5, 0.80.3, 0.2, 0.20.2, 0.1, 0.10.1, 0.03, 0.05Clear zone 지름 (1차,2차,3차)0.9, 1.0, 1.30.3, 0.2, 0.2Clear Zone 지름평균 / Colony 지름평균1.1 / 0.60.23 / 0.06Relative ratio1.83.83-CMC 배지MBLB1270KIGAM252KIGAM275KIGAM416Colony 지름 (1차,2차,3차)1.0, 1.2, 1.0관찰 안됨관찰 안됨육안으로 관찰 가능Clear zone 지름 (1차,2차,3차)2.0, 2.1, 2.0Clear Zone 지름평균 / Colony 지름평균2.1 / 1.1Relative ratio1.9-Starch 배지MBLB1270KIGAM252KIGAM275KIGAM416Colony 지름 (1차,2차,3차)1.1, 1.1, 1.20.3, 0.3, 0.30.2, 0.3, 0.20.4, 0.2, 0.3Clear zone 지름 (1차,2차,3차)2.1, 2.3, 2.41.2, 1.0, 1.1Clear Zone 지름평균 / Colony 지름평균2.3 / 1.21.1 / 0.3Relative ratio1.93.7DiscussionTLC plate를 이용한 GAD 활성 실험에서 HYE1은 GABA와 비슷한 위치의 spot이 관찰되기에 GAD의 활성을 갖는다. MSG도 관찰되기에 기질로써 사용되는 MSG의 일부는 decarboxylation 되어 GABA를 생성하고 일부는 미생물이 가지고 있는ellulase 활성 모두 존재하지 않는다. Starch 배지를 통한 amylase 활성 실험에서는 MBLB1270과 KIGAM416 균주가 amylase 활성을 갖는다. Relative Ratio를 측정한 결과, Skim milk 배지에서 MBLB1270의 값은 1.8, KIGAM416의 값은 3.83이므로 protease의 활성이 KIGAM416에서 더 높다. 또한 clear zone이 관찰되지 않은 KIGAM252와 KIGAM275의 활성도 = 0이다. CMC 배지에서는 MBLB1270에서만 1.9로 유효한 값이 나왔으므로 이 균주에서 cellulase의 활성이 유일하고 KIGAM416, KIGAM252, KIGAM275에서 활성도 = 0이다. Starch 배지에서는 MBLB1270의 값이 1.9, KIGAM416의 값이 3.7로 KIGAM416에서 amylase의 활성이 더 크게 나타난다. 마찬가지로 KIGAM252와 KIGAM275의 활성도 = 0 이다. 실험 결과, MBLB1270은 protease, cellulase, amylase에서 모두 활성을 갖지만 KIGAM416과 비교해보면 각 효소의 활성은 크지 않다고 판단할 수 있었다. 또한 KIGAM416은 protease와 amylase만의 활성을 크게 갖는 균주임을 알 수 있었다.이 실험에서 눈에 띄는 오류는 아니었지만, skim milk 배지에서 MBLB1270의 모양이 중복되는 오류가 있었다. 균주의 배양 모양이 중복되었으므로 이러한 오류가 균주를 접종할 때 생겼다고 판단했다. 이번 실험에서는 MBLB1270과 KIGAM416 활성도 차이가 컸기 때문에 Relative ratio 비교에 어려움이 없었지만, 활성도 차이가 크지 않다면 ratio를 비교하는데 어려움이 있었을 것이다. 균주를 배양을 위해 tooth-picking법을 실시할 때는 한 번 접종하거나 같은 위치에만 접종하는 방법을 이용하여 활성도 차이를 정확하게 비교할 수 있게 하여 오류를 줄여야 할 것이다.Industrial enzymidase, 단백질의 중간을 자르는 endopeptidased 이 두 가지 작용 기작이 존재한다. Protease는 매우 다양한 생물체에서 생산된다. 박테리아의 경우, protease를 세포 밖으로 분비하여 외부 host의 단백질을 아미노산으로 분해하는 역할을 한다. 식물의 protease는 대부분 식물의 발달 조절이나 광합성에 작용한다. 바이러스의 경우, protease는 바이러스 유전체에서 발현되는 단백질을 분해해 여러 기능의 단백질을 만든다. Cellulase는 처음 큰 분자의 cellulose를 분해하는 기작과, 어느 정도 작아진 cellulose를 glucose로 분해하는 기작이 함께 작용한다. Cellulase는 곰팡이, 박테리아, 연체동물 등에서 생산된다. 곰팡이와 세균의 경우, 균체 밖으로 cellulase를 분비하여 외부의 cellulose를 분해하여 흡수하게 한다. 연체동물에서 cellulase는 소화효소로 작용한다. Amylase는 작용 기작에 따라 α-amylase,β-amylase, γ-amylase로 구분한다. α-amylase는 녹말 사슬을 따라 임의의 위치에서 작용함으로써 분해한다. β- amylase는 한 번에 두개의 포도당을 분해한다. γ-amylase는 산성의 환경에서 활성을 갖고 녹말을 분해한다.GABA를 생산하는 미생물은 우리 몸의 장에도 존재한다. 장내 미생물에서 metabolite인 GABA를 생산하여 뇌 신경계에 영향을 준다. 장내 미생물 중 대표적으로 Lactobacillus 균, Bifidobacterium 균이 GABA를 생산한다.ConclusionMetabolite(GABA)를 생합성하는 미생물을 분리하기 위해 TLC plate 상에서 sample(MJF012, HYE1)의 층 분리를 관찰했다. HYE1에서는 MSG와 GABA가 모두 보였기에 GDA의 활성이 일어났음을 알 수 있다. Industrial enzyme인 protease, cellulase, amylase를 생산하는 미생물을 분리하기 위해 Skim 238)

공학/기술| 2022.12.02| 6페이지| 3,000원| 조회(441)

생명, 실험, 생명공학실험

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