실험 주제흰쥐의 해부동물의 조직 관찰결과레포트과목명생물학및실험2실험 목적흰쥐를 해부하는 방법을 배우고 흰쥐를 해부하여 내부 기관의 모양과 위치, 기능을 안다. 그리고 해부를 통해 얻은 근육 조직을 관찰하고 각 특성을 비교한다.실험 결과흰쥐의 해부 결과해부 순서대로 사진을 게시하였다.각 장기를 분류하면 다음과 같다.Thymus 위에 분류되어 있는 것은 뇌가 아닌 흉선이다.또한 맹장 옆에 분류되어 있는 것은 생식기관으로 추정된다.동물의 조직 관찰 결과심장근은 제대로 관찰되지 않아 결과사진을 첨부하지 못함.골격근내장근좌측의 사진은 관찰된 원본, 우측은 각 근육의 결이 식별되는 곳의 결을 표시한 것이다.고찰골격근 샘플 사진(출처. HYPERLINK "https://teaching.ncl.ac.uk/bms/wiki/index.php/Skeletal_muscle" https://teaching.ncl.ac.uk/bms/wiki/index.php/Skeletal_muscle)골격근의 경우 제대로 근육의 결과 핵이 관찰되지는 않았지만 샘플 사진과 유사한 골격근의 특징인 가로무늬(횡문)이 관찰되었다.활주설을 설명하는 그림(출처. https://teaching.ncl.ac.uk/bms/wiki/index.php/Skeletal_muscle)골격근의 움직임은 위의 그림과 같은 필라멘트 활주설로 설명된다. 이는 근육 원섬유들을 이루는 마이오신 단백질의 결합체인 굵은 필라멘트(마이오신 필라멘트)와 액틴 단백질로 구성된 가는 필라멘트(액틴 필라멘트)간 교차결합으로 이루어진다. 이 때 마이오신 필라멘트나 액틴 필라멘트 자체가 수축하는 것이 아니라 액틴과 마이오신 분자들간 미끄러짐에 의해 활주가 일어난다는 이론이다.내장근 샘플 사진(출처. https://www.britannica.com/science/smooth-muscle)내장근 또한 제대로 근육의 결과 핵이 관찰되지는 않았지만 샘플 사진과 유사한 내장근의 특징인 원추형 근세포가 관찰되었다. 내장근은 민무늬근, 또는 평활근이라고도 하며 세포질 속에 매우 가느다란 근육 원섬유가 긴 축을 따라 배열되어 있어 이것이 수축 작용을 한다. 하지만 이 근육 원섬유에는 가로무늬근이나 심근 같은 주름 무늬는 볼 수 없다. 내장근은 명칭대로 내장이나 혈관에 널리 존재하며, 자율 신경에 의해 지배되기 때문에 의식적으로 수축시킬 수는 없다. 그러한 이유로 대뇌의 지배를 받지 않아 불수의근이라고도 하지만 심장근 또한 대뇌의 지배를 받지 않는 불수의근이므로 구별이 필요하다.심장근 샘플 사진(출처. https://en.wikipedia.org/wiki/Cardiac_muscle)심장근의 경우 얻어낸 시료에서 확실한 관찰을 할 수 없어 결과사진을 첨부하지 못했다. 때문에 샘플 사진을 갖고 와서 서술하도록 한다. 심장근은 골격근과 내장근의 특징을 합쳐 놓은 듯한 근육이라 할 수 있다. 이러한 조직은 심장에서만 볼 수 있는데, 가로무늬근을 가진 근육 원섬유가 존재하는 것은 골격근과 같지만 길이가 짧고, 양 끝은 인접 세포와 연결되어 있어 내장근의 특징 또한 가진다. 심장근은 골격근과 달리, 자극의 종류에 따라 강하거나 약하게 수축하지 못하고, 언제나 어떤 조건하에 있어서 최대의 수축을 한다. 또 수축하고 있을 때는, 다른 수축을 일으키는 자극이 와도 반응하지 않는다. 따라서 골격근에서 볼 수 있는 강직이 일어나지 않는다. 이것은 심장을 주기적으로 수축시켜 혈액을 동맥으로 보내기 위함이다.골격근과 내장근의 관찰 결과가 샘플 사진과 같이 깔끔하게 관찰되지 않은 것은 시료를 깔끔하게 한 층으로 펴지 못했고 현미경의 성능 또한 좋은 편이 아니어 제대로 된 결과를 얻지 못했다고 추측하였다.참고 문헌교양교육부 교양생물, 생물학 및 실험 II 실험서, 서울시립대학교, 45-50
GAL4/UAS system에 의한 유전자 발현 조절세포배양 및 모델동물실험1. 실험의 목적유전학적 실험에서 교배 대상의 유전자 조절은 굉장히 중요하다. 살아있는 초파리에서 원하는 유전자를 특정한 패턴으로 발현하는 방법인 GAL4/UAS system을 이용하여 발현된 세 가지 결과를 관찰한다. 이를 이용하여 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.2. 실험 원리1) GAL4/UAS systemGAL4/UAS system은 Wild type 초파리에는 존지하지 않는다. GAL4는 GAL4 유전자에서 만들어진 전사인자(단백질)이며, 원래는 효모의 전사인자이다. GAL4는 UAS(Upstream Activation Sequence)에 특정적으로 결합하여 UAS보다 Downstream에 있는 유전자를 발현시킨다. 이러한 GAL4/UAS system을 이용해 인위적인 유전자의 전사 조절을 위해서는 GAL4 Drivers와 UAS 초파리의 교배가 필요하다. 교배시 아래의 사진과 같은 원리로 유전자의 발현이 조절된다. 아래 사진은 re-GAL4 drivers와 UAS-GFP 초파리의 교배원리이다.위의 사진에서 볼 수 있듯 female UAS-GFP 초파리와 male re-GAL4 drivers를 교배하여 UAS-GFP만 가진 자손과 re-GAL4만 가진 자손은 wildtype이지만 UAS-GFP와 re-GAL4를 모두 가진 자손은 목표했던 형질이 나타나는 것을 볼 수 있다.이번 실험에서 사용할 GAL4 drivers와 UAS 초파리의 유전자는 다음과 같다.GAL4UAS이름위치이름위치elav-GAL4X chr.UAS-RFP2nd/3rd chr.모든 뉴런에서 GAL4가 발현되는 초파리 계통.UAS의 조절 하에 RFP(Red Fluorescent Protein)이 발현됨이름위치이름위치ms1096-GAL4X chr.UAS-hidX chr.초파리의 날개를 구성하는 세포에서만 GAL4가 발현되는 초파리 계통.UAS의 조절 하에 세포 사멸을 유도하는 hid 단백질이 발현됨이름위치이름위치nompA-GAL4X chr.UAS-nompA-RNAi2nd chr.말초 신경계 일부 감각기관의 특정 신경보조세포에서 GAL4가 발현되는 초파리 계통.UAS의 조절 하에 nompA 유전자 일부와 염기서열이 일치하는 dsDNA가 발현되어 nompA 유전자의 발현을 억제함두 유전자 모두 X 염색체에 있는 ms1096-GAL4/UAS-hid 교배의 경우에는 교배 초파리의 성별에 따라 영향을 받지 않으나 그 외의 두 교배는 GAL4 유전자는 X 염색체에, UAS 유전자는 2/3번 염색체에 있으므로 무작위 교배시 자손의 male에게는 목표형질이 아에 나타나지 않는 경우가 생긴다. 따라서 GAL4 driver를 female로 하고 UAS 초파리를 male로 설정해야 자손의 male에서도 목표 형질이 발현하여 많은 실험값을 얻을 수 있다.2) 형광과 형광현미경, 콘포칼현미경의 원리형광은 빛을 흡수하여 들뜬 상태가 된 물질이 안정 상태가 되며 흡수한 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출하는 현상을 의미한다. 이러한 성질을 이용해 형광현미경의 핵심적 장치인 dichroic mirror는 특정 파장보다 긴 파장의 빛은 통과시키고 짧은 파장의 빛은 반사시키는 방법으로 시료 관찰을 한다.옆의 그림과 같이 짧은 파장의 빛을 dichroic mirror에 쏘면 이 빛이 반사되어 시료에 투과되고, 시료가 방출한 긴 파장의 빛은 dichroic mirror를 통과하여 검출기(detector)를 통해 관찰된다. 콘포칼현미경은 형광현미경과 기본적인 작동 원리는 같으나 매우 좁은 구멍인 aperture를 통해 통과된 빛만을 관찰하기 때문에 초점을 벗어난 상은 관찰되지 않는다. 따라서 두꺼운 시료를 이용해서도 매우 선명한 상을 관찰할 수 있고, 초점을 달리하여 찍은 여러 장의 사진으로 입체적 영상을 재구성하는 것 또한 가능하다.3. 실험 도구 및 재료와 실험 방법1) 형광현미경과 콘포칼현미경을 이용한 세포의 형광물질 관찰① 실험 도구 및 재료콘포칼현미경, 형광현미경, elav-GAL4 drivers(female), UAS-RFP 초파리(male), 슬라이드글래스, 커버글래스, mounting solution(80% glycerol), 매니큐어② 실험 방법(1) female elav-GAL4 Driver와 male UAS-RFP 초파리를 교배한다.(2) 교배의 부모 세대가 알을 낳으면 다른 병으로 옮겨 준다.(3) 1기에 가까운 자손 세대의 애벌레를 채취하여 세 번 이상 물로 잘 헹궈 준다.(4) 슬라이드글래스 위에 mounting solution 10μl를 떨어트리고 그 위로 물로 세척한 애벌레를 올린다.(5) 커버글래스를 살짝 덮은 후 커버글래스가 바닥으로 가게끔 뒤집어 휴지 위에 놓고 살짝 눌러준다.(6) 커버글래스 가장자리를 매니큐어로 봉한 후 관찰한다.2) 신호전달에 의한 기관발생의 관찰① 실험 도구 및 재료현미경, ms1096-GAL4 drivers, UAS-hid 초파리② 실험 방법(1) 성별에 관계없이 ms1096-GAL4 drivers와 UAS-hid 초파리를 교배한다.(2) 1)의 실험과 마찬가지로 교배 후 부모세대가 알을 낳으면 다른 병으로 옮긴다.(3) 성체가 된 자손을 관찰하고 분석한다.3) RNAi를 이용한 유전자 발현 억제① 실험 도구 및 재료현미경, nompA-GAL4 drivers, UAS-nompA-RNAi 초파리② 실험 방법은 2)와 상기동일하다.4. 실험 결과1) elav-GAL4 × UAS-RFP 교배 결과?gray pseudocolor image(좌) ?red pseudocolor image(우)중앙의 굵은 선이 중추 신경계, 중추 신경계에서 상하로 뻗어나온 얇은 선이 말초 신경계.2) ms1096-GAL4 × UAS-hid 교배 결과교배 결과사진. 수컷 개체의 수가 압도적이고, 암컷 개채들도 날개가 존재하는 개체들이다.3) nompA-GAL4 × UAS-nompA-RNAi교배 결과5. 논의1) elav-GAL4 × UAS-RFP 교배 결과콘포칼현미경을 통한 관찰 결과 조절하고자 하는 유전자가 정상적으로 발현되어 초파리 애벌레의 nerv system이 정상적으로 형광을 나타내었다. 모든 뉴런에서 GAL4가 발현되게 하는 elav-GAL4와 붉은 색 형광단백질을 생성하는 UAS-RFP의 조절이 정상적으로 이루어져 초파리의 모든 신경계에서 붉은 색 형광을 관찰할 수 있었다. 다만, 애벌레의 전 신경계를 한번에 관찰할 수는 없었는데 이는 1기 애벌레가 아닌 성장이 많이 된 애벌레를 사용하여 시료의 크기가 너무 컸던 것으로 분석된다. 또한 nerv system 외의 다른 형광이 관찰되는 것은 세척 과정에서 제대로 세척하지 못한 찌꺼기가 autofluorescence를 일으켰거나 표본을 만드는 과정에서 너무 강하게 눌러버려 표본의 형태가 변형되며 나타난 것으로 분석된다.2) ms1096-GAL4 × UAS-hid 교배 결과날개 생성 세포에서만 GAL4가 발현하는 ms1096-GAL4와 세포생성을 억제하는 UAS-hid를 교배하여 일부 암컷에서 날개가 제대로 생성되지 않는 개체가 관찰 될 것이라 예상하였으나 그러한 개체가 관찰되지 않았다. 처음부터 driver나 UAS 초파리를 교배하지 않았거나 female 개체 중 virgin이 아닌 이미 교배가 이루어진 개체가 있었다고 하면 해당 결과를 얻을 수 있으나 그러한 상황에서는 처음부터 교배 자체가 잘못 시행되었다고 분석할 수 밖에 없다. 그래서 교배를 시도했던 부모세대 초파리에 driver나 UAS 초파리가 아닌 다른 wildtype 초파리가 전혀 없었다고 가정하고 분석하면 ms1096-GAL4와 UAS-hid 둘 다 X염색체상에 존재하는 유전자임에 초점을 맞춰야 한다. X염색체상에 존재하는 두 유전자가 동시에 존재하려면 X 염색체가 하나밖에 존재하지 않는 male 개체는 우리가 목표하는 표현형을 나타낼 수 없다. 하지만 사진상에 나타난 것과 같이 표본에는 male 개체가 굉장히 많이 보였다. 표본으로 충분한 female 개체를 포집하지 못하여 목표했던 실험 결과를 얻을 수 없었던 것으로 분석된다.
